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在培养细胞时,培养基中加入edta的作用是什么?
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细胞培养液中是不可能含有EDTA的,EDTA会螯合Ca2+和Mg2+,而钙镁离子是细胞贴壁和正常生长所必须的.而胰酶中一般含有EDTA,目的是螯合掉培养基中的这两个离子,防止钙镁离子抑制胰酶活性,以便胰酶将细胞消化下来.
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在分子生物学实验中：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。
稳定剂及血液抗凝剂；
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细胞培养_细胞传代培养
本文主要介绍了哺乳动物细胞培养的相关知识，主要包括细胞培养的基本原则，HEK293和CHO细胞培养的方法以及细胞的冻存，复苏。
随着细胞基因工程的不断发展，目前有多种生物表达系统都能够大规模的生产重组蛋白，主要分为原核和真核两类。又包括：酵母表达系统，哺乳动物细胞表达系统，昆虫杆状病毒。相比之下，哺乳动物细胞表达系统最突出的优点是能够促进蛋白的正确折叠和糖基化等翻译后修饰，从而保证蛋白的天然活性，目前已成为表达和生产部分蛋白药物、基因工程抗体等目的蛋白的首选宿主。
返回：（瞬时转染原理/稳定细胞系构建/重组抗体表达）
细胞培养基本原则
合适的细胞培养基
合适的细胞培养基是细胞在体外生长最重要的条件，培养基不仅提供给细胞生长繁殖需要的基础物质，还维持细胞生长的整个环境，不同的细胞有不同的生长习性，因此要选择合适的培养基。
目前，多数的合成培养基都有添加血清，常用的血清有小牛血清、马血清等。血清中含有细胞生长所必须的生长因子，作为哺乳动物细胞培养的附加物，血清十分昂贵且存在多种问题，因此人们在不断寻找可以替代血清的物质。
无毒无菌的生长环境
体外生长的细胞缺乏对微生物和有毒物质的抵御能力，一旦被污染，会导致细胞死亡，无毒无菌的培养环境是必要条件。
温度与气体环境
细胞生长需要恒定的温度，同时气体（氧气与二氧化碳）也是哺乳动物细胞培养的所必须的物质，HEK293和CHO的细胞培养一般是37℃，5%的二氧化碳环境。
哺乳动物蛋白表达细胞培养
哺乳动物蛋白表达常用的细胞有HEK293（人胚肾细胞）和CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。这两种细胞的应用最为广泛，是在中最常用的细胞，具有以下特点：
具有准确的转录后修饰功能，表达蛋白在任何方面都最接近天然状态；
具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白整合稳定；
具有较高的耐受剪切力和渗透压能力，表达水平较高；
CHO属于成纤维细胞，是一种非分泌细胞，自身很少分泌内源蛋白，有利于目的蛋白的分离纯化；
HEK293细胞具有更高的生长密度更快的生长速度，易培养，易转染。
提前将水浴锅打开，预热37℃。
细胞培养基提前预热，5-10ml于15ml离心管中。
把冻存细胞立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动，待融化后（大概1-1.5min），取出。
用75%乙醇消毒管外壁，放入超净台,转移到含5-10ml培养基的15ml离心管中，离心800-1000rpm，5min。
去掉上清，加入完全培养基重悬细胞，转移到培养皿中，前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞分散均匀。
标记好细胞名称，代数，日期，培养基等，放到37℃的5%CO2培养箱中培养。
贴壁细胞培养一般第二天就可以贴壁，根据细胞生长速度，2-3天换一次培养基。
离心可能对某些细胞造成伤害，这些细胞可以不离心，只需要将DMSO的浓度降到1%以下即可。（一般冻存液中DMSO浓度为10%，即1ml冻存细胞需加9ml培养基。）
细胞传代培养
当培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时需要进行传代。
吸掉培养皿中的旧培养液。
用5mlPBS洗涤细胞1-2次。
用1ml的trypsin（胰酶）溶液，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞呈圆形即将分离时，吸掉trypsin溶液。（若不去掉trypsin溶液，则在消化后加入适量（5:1）含血清培养基终止作用，离心后再去掉上清。）
轻拍培养皿或培养瓶使细胞从瓶壁脱落，加入适量的新鲜完全培养基，轻柔地吹打数次，使细胞分散均匀。再根据稀释比例转移至新的培养瓶中，正常培养即可，剩余细胞悬液舍弃，放入收集瓶中。（细胞传代时按1：5或更大比例稀释）
trypsin溶液中可以加入0.02% EDTA溶液，解离效果会更好，但消化后残留在培养基中的EDTA 会影响细胞的再次贴壁。
冷冻前确保细胞处于指数生长期，传代后的5mL细胞悬液取出1mL接种到培养瓶继续传代。另取一无菌离心管，将剩余4mL细胞悬液置于其中，离心1000rpm，5min（转速勿超过1500rpm）。
离心后倒掉上层清液，收集下层细胞沉淀。向离心管中加入900ul完全培养基，用枪头反复吹打重悬起细胞。取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率。一般细胞浓度为2~5×106cells/ml较适宜。
将细胞悬液转入1.5mL无菌冻存管中，再加入100ul试剂级DMSO，混匀，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为10％）。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期，然后进行冻存。
传统方法：冷存管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16~18小时（隔夜）→液氮罐长期储存。（-20℃勿超过1小时，防止胞内冰晶过大造成细胞死亡）
细胞培养大瓶好于小瓶，细胞能够充分汲取到养分且有利于细胞均匀分布
细胞培养基DEME为高糖培养基
保证细胞培养液新鲜，采用少量多次配置，或培养基保存于-20℃
控制胰蛋白酶消化时间，消化时间长，细胞贴壁效果差
控制好传代时间，细胞没有完全铺满，细胞之间留有空隙时传代最佳
细胞冻存和复苏的原则是慢冻快复，最大程度的保证细胞复苏成功率
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南京市高新技术开发区星火路10号关注今日：137 | 主题：524135
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【专题讨论】哺乳动物细胞的无血清大规模培养
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这个帖子发布于9年零357天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我们实验室在使用瑞士Cell Culture Technologies无血清无蛋白培养基培养293,BHK-21,CHO细胞,目前已进入摇瓶悬浮状态.下一步准备进入5升工作体积的贝朗反应器. 感兴趣的,可以参加讨论.探讨一下.有经验的可以交流一下.
不知道邀请谁？试试他们
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效果如何？我们也在考虑用这样的办法，希望能给些建议，如温度、转速、细胞密度等。谢谢
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无血清无蛋白培养基培养BHK-21,准备进入5升工作体积的贝朗反应器了吗?我对此比较感兴趣,这几年我一直在搞细胞大规模培养,可以交流一下经验;我的邮箱为JIAWENGE@***
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egg5_wgj 效果如何？我们也在考虑用这样的办法，希望能给些建议，如温度、转速、细胞密度等。谢谢请问你是指哪一类细胞呢?
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无血清无蛋白培养基培养BHK-21,准备进入5升工作体积的贝朗反应器了吗?我对此比较感兴趣,这几年我一直在搞细胞大规模培养,可以交流一下经验;我的邮箱为JIAWENGE@***是的,目前在摇瓶里生长的非常好,年底反应器就会到.如果效果不错,还会继续放大.我们用的是CD(成分限定的培养基)培养基.很不错的
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egg5_wgj 效果如何？我们也在考虑用这样的办法，希望能给些建议，如温度、转速、细胞密度等。谢谢另外,你们现在是用血清养,还是已经进入无血清阶段?前期的适应阶段非常重要的.
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方便问Viansaga战友在什么单位？我一直从事此行业。以下是以前讨论的一个专题。
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没有养过，但很想学习
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这样的细胞(BHK-21)能用来接毒,以及产毒试验做过吗?
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从事细胞培养有些时间了，所使用的是生产用的300L、100L、30L、5L的反应器，在使用过的反应器中，以电加热的最为稳定。就针对以上实验说点体会1、进罐前如有条件可以在转瓶中培养些时间，让细胞适应一下转速。2、细胞接种后的密度最好不低于0.33、转速根据浆叶的角度来定，我处，夹角45度，转速80－100。4、通气选用微孔，在进细胞前应将AirF设置好，保证生物反应在培养过程中处于正压状态，辅助培养液中的溶氧。5、PH值、溶氧通过气体混合仪控制，在设定压力一般为0.5bar，流量不宜过大，否则在通气时会产生大量泡沫。6、如使用消泡剂，一定选购细胞培养用的，并且在罐外做好细胞所能耐受的最大剂量。
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5661263 这样的细胞(BHK-21)能用来接毒,以及产毒试验做过吗?没有问题了。
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看来，有很多战友都在这一战线上努力。目前国内确实有许多单位都在研发和生产当中，但规模不大。只有几个规模还可以。但大多数申报的产品还是二类新药，但这已经很好了，如果可以扩大规模，至少可以把国外很贵的药价格降下来。所以，我想通过我们共同的努力，我想在很短的时间内，是可以克服这些难关的。 我也看了cccDNA以前的论坛，确实不错。还有“wjg”的发言，对我们帮助很大。我想，我们现在最好把讨论的内容集中一下，因为每个人的进度还是不一样的。初期，我想大家能否集中在细胞的驯化上，即从有血清（或拿到无血清培养的细胞株）到上反应器之前的培养。我想对于想做的人很有帮助，对于已经到反应器的朋友，可以总结一下。因为，我想上游的工作，有些是不原公开的。但这一块是没什么的。我们先讨论侃侃。主要围绕：CHO，293，杂交瘤，BHK-21细胞吧。另外，如果想买反应器，我想主要是：贝朗B.BRAUN，和比欧（Bioengineering），贝朗的贵一些，但在中小体积的时候效果不错。比欧的要便宜，而且是最容易放大的，他们也有厂房建设的经验（贝朗没有）。Infors反应器便宜，主要适合原核培养。NBS反应器，只适合小规模，致命弱点，没法放大！！
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1) 细胞驯化本身（虽然耗时）并没有太高的技术含量，关键在于培养基配方设计和工程株的筛选。对于一个好的工艺来说，各个环节的对最终结果（Volumetric productivity) 的影响贡献比例大致如下：
a, 载体构建及工程株筛选，50％
b,培养基配方及加料（或灌注）策略，30％
c, 反应器及过程参数优化，20％
也就是说有一个好的工程株，你就成功了一半，剩下的50％是工艺优化问题。2) 对于反应器的品牌，B.Braun的比较适合做工艺优化。至于放大而言，如果到上千升的体积，大多需要针对工艺专门的过程工程设计，没有买现成产品安装的。B.Braun也有2500L的设计案例。这是一个比较复杂的环节，我想不到具体谈判环节是不会知道那家公司更合适的。
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你说的几种细胞，都很好驯化，如非工程株，培养基合适的话，2wks就可以了。当然工程株会困难些，2wks到2month不等，筛到很好的工程株不是一件简单的事情
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BHK悬浮培养我们曾经做到1升，玻璃搅拌瓶，细胞密度2*106/ml，也曾经接过毒，但首都时间难以确定，实验为完成就夭折了。顺便说一句NBS的培养罐也挺好。有一个问题：如何确定首都时间？
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owl365 编辑于
一直在关注cccDNA的论坛,学到不少,真的希望有更多的战友集中起来讨论这个话题.大规模细胞培养在国内还属刚刚起步,并受到国外的严密技术封锁.出于公司的利益考虑,一般论文很少涉及工艺这块,因此大家只有集中起来相互讨论彼此提高,来迈过这一高的技术门槛.从上游构建,单克隆抗体制备到大规模细胞培养,非常赞同cccDNA关于各环节贡献比例划分.筛选一支好的细胞株对下游表达的贡献是巨大的,但大规模细胞培养是技术短板,资金问题是最大的制约因素.做过多种细胞的驯化,培养基的选择是关键,可以试试多种市售培养基,添加关键微量元素,另外无血清驯化是细致的工作,切勿急功近利.
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cccDNA划分的三个比例还是很科学的，我想我们在前50%的构建和筛选工程株方面，问题不是特别大。目前最大的问题就是再后半段。所谓的技术含量就在于培养基的配方优化和反应器的控制方面。那么我们就从开始来讨论吧：
反应器还提一句：贝朗在大的体系上确实不如比欧。在欧洲就是如此。反应体系在3000升以上的，贝朗很少。不过还是看大家的喜好了，前期用贝朗的没问题了。一、细胞驯化： 1，的确没什么技术含量，对于很熟练的人来说，3周左右吧。就是拿培养基来试！尽量选择CD级别培养基，对于反应的控制和以后的纯化都有好处。2，说来现在用的工程细胞也就以CHO，293，杂交瘤为主了。如果你的细胞株已经是贴壁的，就尽量驯化成悬浮的。3，过程可以直接去掉血清，直接换成无血清培养基。也可以把血清加到培养基当中，再逐步减少血清，知道完全换成无血清培养基。4，在换成无血清培养基后，要密切观察细胞的变化。前期有20-50%的细胞死亡是正常现象。当然也有差异了。更换培养基时尽量换一半，保留一半的条件培养基（条件培养基是养2-3天细胞的培养基），里面含有细胞外泌的因子。有利于细胞的生长。5，如果是驯化贴壁到悬浮，用CD的培养基会有细胞漂起来，但细胞不一定会死。可以收集起来继续培养。也会有细胞成团的现象，只要不是特别多的细胞聚在一起，不要紧。可以观察一下，养一阶段以后，细胞就会散开。6，如果前期你的细胞生长特别慢，增殖不好，可以考虑加入5-10ug/ml的insulin胰岛素，当细胞完全适应培养基后，可以逐渐去掉胰岛素，最后完全去除。7，前期适应时，不要急于传代，要等到活细胞密度达到10e6以上再传代，传代后接种的密度不小于1-3 x 10e5/ml。用CD培养基时，不能用胰酶消化细胞（因为CD培养基中没有蛋白，无法终止胰酶的作用），可用EDTA0.1%-0.5%都可以。8，细胞适应培养基后，活细胞的数量每代是稳定的，达到最大细胞密度的周期是稳定的。而且细胞的状态和有血清时差别不大。细胞的表达量略低于或接近有血清培养。有的要高于有血清培养。9，冻存：条件培养基和新鲜培养基的比例是1：1，同时加入5-10%的DMSO，活细胞数量要不低于3-5x10e6。10，细胞完全适应以后，在进入反应器之前，是要在摇瓶或转瓶里培养，达到足够的密度和适应程度再进入反应器。
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Viansaga战友说得很好。1）关于Chemically difined 还是 Serum free还是有很多讲究，不同的公司定义不完全一样。抛开字面上的表述，主要集中在以下方面：－a,是否含 Insulin－b,是否含Transferrin－c,是否含EGF或其他如Fetuin类外源蛋白－d,是否含Hydolysate一类水解物抛弃这类物质主要出于：安全，成本和下游工艺的考虑。但是就目前来说，Chemically difined的培养基在效果上尽管有很多进展了，但还是需要提高2）如果做工程株的驯化，不单单是细胞适应的问题，还有细胞稳定表达的问题，能做生产用的细胞一般要稳定到50代（Population doulbing level)以上.所以整个过程要有一定的反复，实际上建一个WCB是一个较为庞大的工程，需要对你的细胞特性做各种鉴定。补充一下：就CHO，293和Hybridomas来讲，从贴壁到悬浮并没有驯化问题，加血清和PF-68，以及存在剪切力的条件下，从贴壁到悬浮本身是比较快的过程。
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关于细胞驯化viansaga讲的已很清楚,的确对于熟练的人来说这不是很有难度.制约国内生物医药企业发展大规模细胞培养技术平台除了投资巨大,另外就是表达量过低了,之前cccDNA提过GS表达系统与传统的dhfr系统的区别,相信这是能最大地改变表达量的方法.还请各位高手详解.本人非常好奇各位战友细胞培养系统的体积和最大密度以及培养周期,关于Insulin,为什么在细胞生长缓慢时加,然后要去掉呢?另外酵母粉对细胞增殖的作用还是相当明显的,但浓度要合适,否则容易导致细胞中毒.大家在大规模细胞培养过程中如何控制培养基的葡萄糖浓度,浓缩液的添加等等.让我们把话题讨论得更深入点吧!
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GS系统是Lonza的专利，今年已经在中国授权了，用GS系统是要冒被诉讼的风险的，除非愿意交高额的专利费和版权税。大多数企业用DHFR系统，虽然费时但已经比较成熟了。现有的商业化载体（比如Invitrogen的pC DNA 3.3/pOptiVEC™-TOPO)已经很好了。进一步的载体优化是各公司的商业秘密，各有各的绝招，但个人认为只是锦上添花的事，不会有根本上的颠覆。载体对于特定蛋白或抗体的表达效率基本上用瞬时表达的方法就可以做评估了。要得到高表达的工程株，除了载体以外，还需要高通量的筛选方法，因为目前成熟的转染方法都是随机整合，筛的克隆越多，得到高产株的可能越大。当然整个筛选过程，有时需要和驯化以及培养基优化Overlap起来以提高效率和放大高产克隆的表达优势。Insulin可以帮助细胞代谢，和抗凋亡作用，对于CHO细胞而言也可以提高蛋白表达。去掉的目的，一为成本，二为药物认证方便（外源蛋白对于生物制品始终是一个潜在不安全因素，一在于蛋白本身，二在于外源蛋白生产过程可能引入了其他污染风险）。
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viansaga BHK能用来接毒，英国大规模生产口蹄疫疫苗就是这样。我们培养BHK21用来培养病毒做疫苗，不是用来表达产物，请问有人在做这方面的工作吗？能介绍一下情况吗，如何确定病毒收获时间！
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owl365 编辑于
cccDNA说的很有道理，载体构建和优化，各有各的方法，但差别不是很大。所以筛选高表达工程株就显得很重要了。并且确实要和优化的培养基结合起来。Insulin的作用，cccDNA说的也很清楚了。 Keep战友说的深入讨论很好，那我们就已细胞为源头开始1，细胞的选择和种子库的建立2，细胞的筛选和鉴别3，进入反应器阶段的细胞扩增4，反应器模式5，培养基的筛选6，葡萄糖和谷氨酰胺的问题7，PH的检测和控制8，氧和二氧化碳的控制9，搅拌和气泡的问题如果还有其他问题，请各位来补充。
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owl365 viansaga BHK能用来接毒，英国大规模生产口蹄疫疫苗就是这样。我们培养BHK21用来培养病毒做疫苗，不是用来表达产物，请问有人在做这方面的工作吗？能介绍一下情况吗，如何确定病毒收获时间！owl365
BHK21的接毒和收获具体的时间等不是我来操作，是我们的一个专家来做，我可以问她。
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如果GS能大大提高表达量,甚至达到国外的数克级别,还是有人愿意付专利费的.还有胰岛素也一样,如果产品已上市的话,还是可以收的回的,曾干过把大量诺和诺德胰岛素倒入培养基中.大家可以说说在无血清培养基中添加的微量元素,如脯氨酸,YE等.以及葡萄糖的浓度.发酵罐是大规模细胞培养的关键,其马达,搅拌形式,管路,通气方式,CIP,SIP,以及取样方式等等,都是复杂而严密的过程.大家可以讨论一下,相互学习.另外还想问下viansaga现在5L贝朗反应器的报价是多少?
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owl战友，你做的是可分泌病毒？如果做工艺前研究应该取滤过液实时分析病毒颗粒数，比如用HPLC然后plot一个曲线在合适时机收毒。如果是反应器上，病毒的扩增也会反应到DO,糖耗及其他代谢参数上，我想不同的病毒差异会很大的，需要具体到你的试验上来说。
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cccDNA 编辑于
GS并不能够大大提高表达量，只是筛选时间缩短了，因为其并不靠大量扩增目的基因拷贝数来达到高表达目的，一般来讲该系统的细胞单产（ specific productivity)要低于DHFR系统，但由于这种系统不需要加入Glutamine 以及采用的CHO-K1具有生长优势，所以总体来讲门槛比较低。用DHFR扩增系统也可以达到3g/L的表达量（在我手里），在Bioprcess Intl con&exibition， 5g/L左右的表达也已经报道过了。Amgen内部消息，甚至有更高的表达量。现在基于PER.C6的新的表达平台也很轻松就能达到5g的表达量了，但是一样的因为专利和版权税的问题，除了比较大的制药公司在开发外，并没有得到大肆推广。当然，也有认证方面的问题，这个比较复杂一点。其实对于蛋白表达来讲，titer并不意味着一些，产物的质量（糖基化，均一性等等）也是很大的议题。
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cccDNA 编辑于
cccDNA战友说的DHFR扩增系统表达量真的是很好，在国内也是很少的吧，做到多大体积了？Keep问的贝朗5升（工作体积，实际体积在7升左右）实际的成交价在35万左右。
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owl战友的问题就是BHK-21细胞的接毒和产毒：你的工作体积是1升，细胞密度2x10e6已经可以了，1，你可以在小体积：如200ml的摇瓶里，摸一下条件2，当细胞密度达到2x10e6后，一定要在对数期，换新鲜的培养基，然后接毒3，在接毒后36小时内不用测试。4，36小时后，每隔12小时，检测病毒的滴度，包括上清还有细胞。5，做出曲线，找到病毒最大滴度的时间，就是要收毒的时间。6，病毒的产出和降解是动态平衡的，所以要找到最合适的时间 如果按以上的方法，应该可以的。
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cccDNA战友的3g/L的表达量太牛了,做过不少用DHFR系统筛单抗,最高的表达量也不过几十毫克.而且活细胞密度都能到达4x10e6.不可思议,前期老板还让研究GS,说国外能做克级就靠它,长见识了.谢谢viansaga告诉的35万,在做预算.
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进来学习的，正在学习中...........
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Keep 战友说的产量低，很有可能跟培养基有关，如果用合适的体系，产量至少应该在几百毫克每升。
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同意楼上的说法。
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你们用的都是哪种无血清培养基啊?我们用的是HYCLONE干粉
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你们用的都是哪种无血清培养基,推荐一下吧
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关于丁香园}