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【求助】检测细胞内ROS水平的方法
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这个帖子发布于4年零11天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
想要做临床上收的人的细胞标本内的氧化应激差异，怕培养了以后培养液肯定会影响细胞状态，所以想要直接分离出来就检测。但是发现文献里要么就是检测体液里的ROS含量，例如MDA、SOD等等，要么就是做细胞的TUNEL测凋亡。但是我推测我的细胞凋亡应该不是很明显，只是想单纯的测下ROS相关方面的指标，请问各位有什么建议吗？谢谢。。。。
不知道邀请谁？试试他们
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有人知道吗。。。
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丁香园助理版主
这个是有专门的方法来测ROS的
以下供你参考Detection of Intracellular Reactive Oxygen Species [Abstract] Reactive oxygen species (ROS) play a critical role in the cellular physiopathology. ROS are implicated in cell proliferation, signaling pathways, oxidative defense mechanisms responsible for killing of bacteria, thyroid hormonosynthesis, etc. The cellular Redox homeostasis is balanced by oxidants and antioxidants systems. In several diseases (cancer, neurodegenerative diseases, cardiovascular diseases), the Redox balance is disturbed. In fact, excessive amounts of ROS can damage proteins, lipids and DNA at cellular level.
The choose of a sensitive method for detection of intracellular ROS is very important for detecting the disturbed Redox balance in pathological cells and after exposition of cells to different genotoxic agents (Irradiation, Oxidative stress, etc).
The detection of ROS in biological systems is difficult for several reasons: Method sensibility and probe specificity. The 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) fluorescent probe is commonly employed and may react with several ROS including hydrogen peroxide, hydroxyl radicals and peroxynitrite. The cell-permeant H2DCFDA passively diffuses into cells and is retained in the intracellular level after cleavage by intracellular esterases. Upon oxidation by ROS, the nonfluorescent H2DCFDA is converted to the highly fluorescent 2',7'-dichlorofluorescein (DCF). The chloromethyl derivative of H2DCFDA (CM-H2DCFDA) provides much better retention in live cells than H2DCFDA. Dead or dying cells produces ROS. When we want to detect ROS in living cells, we have to stain cells by Propidium Iodide (PI) and evaluate ROS production only in living cells which are PI negative. In fact, PI intercalates into double-stranded nucleic acids. It is excluded by viable cells but can penetrate cell membranes of dying or dead cells. PI is excited at 488 nm and emits at a maximum wavelength of 617 nm. Because of these spectral characteristics, PI can be used in combination with other fluorescent probe such as CM-H2DCFDA (Excitation/Emission: 492–495/517–527 nm).
A probe fluorescence emission can be assessed by Flow cytometry, a standard fluorometer or fluorescence microscopy using appropriate filter.
Flow cytometry is commonly employed to detect intracellular ROS production. Flow cytometry measures fluorescence per cell. The cells are excited by the light source and emitted light from cells are converted to electrical pulses by optical detectors. Emitted Light is send to different detectors by using optical filters: 525nm Band Pass Filter for FL-1 and 620nm Band Pass Filter for FL-3. A 525 nm band pass filter (FL-1) placed in the light path prior to the detector will only allow “green” light into the detector. So, FL-1 is used in our protocol to collect green light corresponding to the oxidation of dichlorodihydrofluorescein (DCF) by ROS. FL-1 is the Green (FL-1) channel on flow cytometers. 620nm Band Pass Filter (FL-3) only allow “red” light into the detector. Red fluorescence emission is measured in the Red (FL-3) channel on most flow cytometers.Materials and Reagents Trypsin-EDTA (1X) (0.05% / 0.02% in PBS) (PAA L11-004)DPBS, Calcium, Magnesium (Invitrogen No.14040)HBSS Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) with Calcium and Magnesium and without Red Phenol (Invitrogen No.14025). CM-H2DCFDA (Invitrogen No.C6827).Propidium Iodide - 1.0 mg/ml (Invitrogen No.P3566).Equipment Cell incubator Six-well platesCentrifugeFACSVantage SE (Becton Dickinson)2x75 mm, 5 ml polystyrene round bottom test tube (BD Biosciences No.352054). ProcedureIn the protocol described below, we detect the intracellular ROS after exposure of non cancerous human thyroid epithelial cell line “HTori-3.1” to the oxidative stress. HTori-3.1 cells are grown in complete culture medium (see recipe). HTori-3.1 cells were plated at a density of 2.5 × 105 cells per well into six-well plates in complete culture medium.Sixteen hours later, the cells (90% confluence) were washed by warm DPBS, harvested by trypsinization (250 μl of trypsin / Well).Add 1 ml of complete culture medium (10% FCS) to stop trypsinization and resuspend cells by gently pipetting up and down. Collect cells into 5 ml polystyrene round bottom tube by centrifugation (5 min at 200 xg) at room temperature and aspirate supernatant. Wash cell pellet with 4 ml DPBS and centrifuge 5 min at 200 xg at room temperature.Resuspend cell pellet in HBSS with 10 μmol/L of CM-H2DCFDA and increased concentration of H2O2 (1 – 5 -10 -15 - 20 - 25 and 50 μmol/L) by gently pipetting up and down (500 μl/tube).Incubate cells (resuspended in tubes) in cell incubator [(37°C), high relative humidity (95%), and controlled CO2 level (5%)] in the dark for 45 min.Add Propidium Iodide 0.5 μl/0.5ml/tube (final concentration = 1μg/ml) and place the tubes on ice (still in the dark) and proceed immediately to flow cytometry analysis. Note that: a) the propidium iodide staining procedure should be performed immediately before analysis on the flow cytometer, b) when we place tubes on ice we minimize cell activity and we avoid artifactual fluctuations of ROS detection between the first tube analyzed in FACS and following tubes. A total of 5 000 events are analyzed in flow cytometry. The cellular viability is assessed by propidium iodide staining. Collect PI fluorescence in the FL-3 channel (620nm) of FACSVantage SE (Becton Dickinson).Living cells, which are PI negative, were selected by FACS gating. In these living cells, we record the fluorescence of DCF on FL-1 channel (525nm) of FACSVantage SE (Becton Dickinson). AnalaysisThe effect of H2O2 concentrations from 1 to 50 μmol/L on the intracellular ROS level was determined by flow cytometry analysis. (Fig. 1). We can present results as the " all mean fluorescence "or as "M2 percentage" fluorescence variation. M2 indicate the percentage of cells with an increase production of ROS. We measured a concentration-dependent increase of fluorescence, reflecting an increased level of intracellular ROS (Fig. 1). For example, after exposure of cells to 20 μM H2O2, we detect an increase in fluorescence of HTori3.1 cells [Mean fluorescence of all cells is 243.14 in stressed cells and 76.76 in no stressed cells (0 μM H2O2) ]. Our results show that the level of ROS in stressed cells is 3 times more than in no stressed cells.Also, we can analyze results by "M2 and M1 percentage" fluorescence variation. M1 is placed around the no stressed cells. M2 is placed to the right of M1 to designate positive events. We look at the %Gated for M2: 1.23% (no stressed cels) and 47.12% (cells stressed with 20 μM H2O2). Our results indicate that 47,12% of cells show an increase in ROS level after exposure to 20 μM H2O2.
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楼主，有找到好的方法吗？交流一下，~~~~
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最近一篇文章采用双光子成像方法实时测量ROS产生，特别设针对H2O2。见帖子”双光子成像实时探测细胞内ROS（H2O2）的产生“
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关于先药物刺激还是先加载探针的问题，说明书上说：1-2小时，先装探针，在药物刺激。大于2小时，就先刺激，在加入探针！但是论坛上有人说，都是先刺激，在加入探针。所以我就迷茫了，所以请大神指导一下。（我是药物刺激1小时）假如先装探针，后加h2o2,测的时候H2O2要洗出去吗
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各位大师，我想问一下正常细胞内ROS浓度是多少啊
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关于丁香园面部排毒膏，真的是帮助排出铅汞毒素吗？ - 知乎35被浏览39833分享邀请回答3添加评论分享收藏感谢收起0添加评论分享收藏感谢收起查看更多回答→ 面部排毒有什么好处?
面部排毒有什么好处?
健康咨询描述：
从怀孕开始就没有用护肤品了,因为听说用了对宝宝不好,也不敢随便乱用.但是我是属于油性皮肤,慢慢地脸上就开始涨痘和长斑呢,越来越多,整个人都看上去没有精神,很丑都不敢出门见人啦.
想得到怎样的帮助：面部排毒有什么好处?
其他类似问题
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&&&&&&指导意见：&&&&&&1.刮痧排毒,刮痧排毒属于面部排毒的一个很重要的排毒项目，刮痧排毒有什么好处呢?面部刮痧排毒是根据面部的皮肤生理结构设计的专用面部刮痧板，沿面部特定的经络穴位实施一定的手法，使面部经络穴位因刮试刺激而血脉通畅，达到行气活血梳通毛孔纹理，排出痧气。&&&&&&2.面部拔毒,面部拔毒在深层清洁、去角质、按摩、敷面膜的原理和流程上与其他美容原理是相同的，它是用拨毒粉和排毒精油调配而成的乳液，利用超声波将乳液带入皮肤内层，拨毒乳会将皮肤内毒素通过淋巴循环带出。面部毒素比较重的人就可以明显看到原来白色的乳液逐渐变成灰色甚至黑色。这就说明毒素经过拨毒乳已经被拨出，面部拔毒的好处是拨毒后的皮肤显得通透、白皙和有光泽。&&&&&&3.产品排毒,面部的排毒可以通过活化细胞循环系统，以增强细胞天然的再生与排毒功效，各护肤品牌的护理产品大多具有这项特点。通过添加一些能促进血液循环、吸氧功能的成分，刺激加速细胞的修护与更新，提供细胞必须的氧气，带动皮肤的新陈代谢，帮助清除囤积真皮中的细胞废弃物。&&&&&&4.淋巴引流排毒,淋巴引流排毒方法是以淋巴较多的腋下、锁骨、脸部与耳际交界处为重点。先从鼻翼两侧缓而深地按摩，一直到耳际，最后再由额头沿着脸庞侧边慢慢到锁骨，完成脸部的排毒。淋巴排毒有什么好处呢?淋巴排毒能将滞留在身体内的二氧化及沉积的物质代谢出来。净化肌肤，使肌肤通透、水润，宛若新生。
副主任护师
擅长: 消化内科,呼吸内科,内分泌科,传染科,妇产科
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&&&&&&病情分析：&&&&&&你好！面部排毒的情况如果是非经常使用化妆品女性一般是无需排毒的，机体毒素都在血液中，&&&&&&指导意见：&&&&&&因此良好的心态，养成多喝水的习惯是最好的排毒，正确合理使用化妆品和护肤品
国家二级营养师
擅长: 孕产妇营养，婴幼儿营养，老年慢性病营养。从事妇产科
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&&&&&&病情分析：&&&&&&怀孕期间有些护肤品是可以用的，怀孕的时候皮肤的基础护理，如保湿也是需要的。只要尽量不化浓妆就好。护肤品选用一些药妆和相对天然的，目前市场上有孕妇专用的护肤品，应该会比较好。如含有美白祛斑成分的暂时就不要用了。&&&&&&指导意见：怀孕期间也不是所有的孕妇都会长斑，长斑主要是由于怀孕造成内分泌失调引起的。生活要有规律，早睡早起，多休息，避免劳累。避免长时间日晒，如果外出时紫外线比较强烈，要做好防晒措施。平时多吃些维生素C含量高的果蔬，如西红柿，橙子，猕猴桃等，保持愉快的心情。&&&&&&以上是对“面部排毒有什么好处?”这个问题的建议，希望对您有帮助，祝您健康！
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&&&&&&面部排毒是新护肤趋势很热门的话题,而现代的都市女性虽然表面上都是光彩夺目,其实却被大气污染,电磁辐射紫外线伤害等一系列环境问题折磨得脆弱无光,环境污染和身体内部毒素堆积是导致面部毒素聚集的主要原因，毒素过多会令面色发黄发黑，面部排毒在美容中越来越重要了，很多人会花高价去美容院做排毒疗程，其实，我们在家也可以自己做面部排毒，排毒按摩和一些小技巧都能有助于减少面部毒素，让肤质更加白皙透亮。指导意见：&&&&&&1.每周一次蒸气浴，汗蒸或者桑拿都可以，&&&&&&2.在沐浴后做一些简单的有氧运动也可以加速血液循环和身体代谢，让排毒效果加倍。&&&&&&3.一周一次清洁面膜，将肌肤毛孔中的毒素以及黑色素完美吸出。&&&&&&4.睡前做面部排毒按摩，加速血液循环，减少毒素堆积，按压下巴、颈部、额中、眼头和鼻翼这几个位置，可促进毒素分解。&&&&&&5.面部刮痧活血排淤。&&&&&&6.每周有一天起床洗脸后什么都不涂也不化妆。如果皮肤实在干燥，可以只涂抹一层保湿霜。
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&&&&&&可以尝试用淋巴排毒法来进行面部排毒.淋巴排毒按摩主要是通过按摩和精油的芳香作用，疏通人体循环系统，达到促使体内毒素排出体外的目的。&&&&&&淋巴是人体内的一个循环系统，相当于人体内的清道夫，亦是收集人体各器官毒素的主要媒介。在血液输送养份氧气过程中，还会收集毒素及代谢废物过滤净化，然后输送至肾脏，经腹股沟到排泄系统排出体外。如果淋巴系统循环减慢，毒素便会积聚造成水肿及毒素积聚体内的情况出现。循环不良会导致体内毒素淤积，出现体胖、肤色晦暗、面部痤疮等美损性问题。而淋巴排毒按摩主要是通过按摩和精油的芳香作用，疏通人体循环系统，达到促使体内毒素排出体外的目的。这样由毒素淤积引起的美损性问题也就得到了解决。一般来说，15-20天做一次淋巴排毒护理就够了，太频繁对皮肤也没有好处。2-3次以后，人的肤色和身体的状况会有明显的好转。
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&&&&&&做面部排毒的好处：&&&&&&1.可以改善皮肤暗黄、晦暗&&&&&&2.调节面部肤色、均匀肤色&&&&&&3.清除皮肤基底垃圾毒素，促进产品的吸收&&&&&&4.促进面部血液循、加速代谢&&&&&&5.增加皮肤的通透度&&&&&&6.加速痘痘与痘印的代谢&&&&&&7.配合美白产品，可以使面部色素淡化&&&&&&8.改善面部淋巴、侧颈淋巴的循环与代谢&&&&&&9.清除毛孔里使毛孔堵塞的垃圾，毛孔堵塞会使肌肤产生黑头，白头，痘痘等。那么需要面部排毒的人群有哪些呢?经常化妆涂抹bb隔离的人士;电脑工作者，每天对着电脑6个小时以上的人士;工作坏境污染重的人士;经常玩手机、ipad的人士;经常上美容院做各种各样护理的人士;用过含有急速美白，急速祛斑，急速祛痘等的人士;年龄超过26岁以上，不管是否有上面6项，不管肌肤有什么问题没有，都应该定期排毒。
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使用微信扫码支付1元斑美拉面部排毒sina._诗蕊含玉_新浪博客
斑美拉面部排毒sina.
斑美拉面部排毒
一、斑美拉简介
斑美拉公司香港注册，生产工厂在广州；专注于面部排毒，打造素颜女神！从2015年开展加盟代理以来，目前已经在全国拥有上数百名加盟代理商；每年有数万名爱美的顾客在使用斑美拉脸部排毒液后，从获脸部肌肤的新生，无需化妆，素颜即是女神！
二、斑美拉起源
2010年，斑美拉品牌创始人容总和菲总一起去香港旅游，顺便探望比自己大十几岁的堂姐！已经几年没有见过堂姐了，一见面的时候竟然让容总惊讶的说不出话；看着比自己大十几岁的堂姐皮肤比自己还好，皮肤非常的有光泽，而且非常紧致！年龄看上去也比自己还要年轻！容总当时看着堂姐的皮肤真是羡慕得不得了，再看看自己黄脸婆一般的皮肤瞬间觉得无地自容！回想自己这几年一直在美容院也没有少花钱去护理，皮肤竟然跟堂姐还有这么大的差距！当时容总就迫不及待追问堂姐有什么保养秘方；堂姐说是堂姐夫的外公调制了一种药液给她在脸上使用，连续使用了一个多月后皮肤就变光滑水嫩了！再仔细询问得知，原来堂姐夫的外公是香港当地有名的老中医！爱美的容总当时就请堂姐让堂姐夫外公也给自己调制药液拿回国内自己使用，也是通过了一个月左右的时间皮肤变漂亮了！容总老公是个商人，亲眼见证容总使用药液后皮肤有那么巨大的改变，一眼就看到了背后巨大的商机！经过了一番周折后终于花了巨款买断技术回到国内，注册斑美拉商标，并和自己十几年的闺蜜菲总一起推广全国市场！如今都是跨界打劫的年代，美容行业如今已不再单单是女性经营行业，如今男士也是非常在意自己的形象，因为每个人都意识到面部风水和形象问题，他们都非常注重脸部保养，都想更年轻更帅。女的都想逆生长，永保青春。斑美拉具有广阔的市场空间。
三、斑美拉成分
“面部排毒”液由人参、灵芝、芦荟、甘草、沙棘等纯植物萃取的纯天然提取液。富含人体所需的多种维生素、微量元素、氨基酸和很强的生物活性物质，滴滴精纯。经权威检测机构检测合格，已通“过国家食品药品监督局”备案，国家食品药品监督局“许可服务”。经香港、广东、广西、上海等政府权威检测机构检验合格，保安全，重效果。
四、斑美拉原理
皮肤由表皮、真皮、和皮下组织构成。皮肤的代谢周期，通俗的、标准的认为最外层角质为28天。随着年龄变化，这个数值将越来越长，60岁时约45天。而最外层即是表皮啦。表皮位于皮肤的表层，是上皮组织，它与外界接触最多，又是与化妆品关系最密切的部位。表皮虽然差不多只有普通纸那么薄，最厚处也不超过0.2毫米，但它们都是由最下面的基底层发育而成，各种形态和大小不同的上皮细胞构成。基底层由基底细胞和黑色素细胞组成。黑色素细胞可以制造黑色素，从基底层细胞分裂后向上推移起到达颗粒层的最上层约需l4天，再通过角质层到最后脱落又需14天左右，这个时期就是细胞的更换期。只要平时注意保养，由于新城代谢的原因新生长出来的细胞会不断替换掉旧的乃至衰老的细胞，脸部还是会回到原来的肤色的。这也是斑美拉之所以能排出脸部毒素的一个基础。
关于脸部毒素：我们都是知道我们的皮肤是人体最大面积的排毒出口，脸部是最为薄弱的地方。比如其中一种内部毒素：我们肠道功能紊乱时，毒素将会被血液吸收，随着血管回到肝脏，肝脏就会开始工作，解毒。长期如此肝脏功能下降，肾脏功能也下降。当这两大器官长期超负荷工作时，脸部皮肤也就会越来越糟糕，毒素的累积导致脸部长痘痘，各种各样的斑也随之而来；色泽也越来越黄，失去光泽。另外一种常见的外部脸部毒素：长期使用含铅含汞的化妆品护肤品等等，大量的激素等等，导致脸部皮肤越来越差，抗衰来功能越来越差，脸部就会有各种样的斑、痘及扬中的过敏现象。所以当我们的脸部出现这样的症状的时候，我们就要引起重视而不是忽略或者采取不恰当的方式处理，不然情况就会越来越严重。斑美拉不是祛斑产品，也不是美白产品，它是脸部排毒产品。它能给你的皮肤做个深层的大清洁，把你脸部皮肤基底层的毒素垃圾，通过人体循环周期代谢出来，排出黄气、淡化皱纹、法令纹、色素，红血丝、及油脂分泌痘包，痘疤疗效显著，还原你原本的健康肌肤。斑美拉产品核心在于畅通血脉、化解血淤、畅通循环、能够及时地排出皮下的毒素，溶解掉肌肤上的色斑。彻底的消除掉色斑的形成根源，平衡体内的激素水平，提高自己的免疫能力。由内而外地进行调节机体，由内而外地加速溶解掉黑色素。从而使得肌肤不仅有光泽而且还有弹性，白皙而又细腻，最终达到祛斑的目的。去除斑不能只做表面功夫，要由内而外的哦！！这也是斑美拉之所以能解决各种脸部问题的关键。
五、斑美拉功效及使用方法
一小棉签均匀涂抹在脸上，“脸部排毒”液深入皮肤后，能迅速激活皮肤组织，促进新陈代谢，提高皮肤免疫功能，消除自由基，降解过氧化脂（LOP），增强超氧化物歧化酶（SOP）值，抑制黑色素合成生长，化解真皮层毒素的黑色素，并促使这些毒素和黑色素被拔除于表皮外角化脱落。通过15-30天左右的时间内外排毒技术，彻底解决脸皮所有的皮肤问题：雀斑、黄褐斑、蝴蝶斑、老年斑、铅汞中毒黑斑、严重深层斑、暗疮、粉刺、青春痘、痘印、脓包痘、皮肤粗黄黑、平皱、收缩毛孔、紧致皮肤、淡化黑眼圈、眼袋、修复红血丝、修复过敏皮肤、修复扁平疣、油脂粒及各种化妆品残留物导致的任何皮肤问题。让爱美的女士都能真正摆脱“黄脸婆”的困扰并且年轻10到20岁！让肌肤重现光彩，焕发少女般的青春容颜，做个不化妆每天24小时都拥有真正美丽自信的素颜女人。
六、斑美拉理念
“斑美拉”公司秉承健康养生美容理念，倡导真实的美才是健康的美，追求“清水出芙蓉，天然去雕饰”的美丽境界。以直观的效果、良好的口碑，成为您身边的养生专家。我们有能力与信息让您一次性投资！一辈子美丽！一辈子财源滚滚！真正做到美丽财富双丰收!!!
七、斑美拉承诺
签约合作，无效退款！！！
八、斑美拉毒副作用及反弹情况
斑美产品属于纯植物萃取的纯天然提取液，绝不含任何化学添加剂及有害物质。“面部排毒”液由人参、灵芝、芦荟、甘草、沙棘等纯植物萃取的纯天然提取液。富含人体所需的多种维生素、微量元素、氨基酸和很强的生物活性物质，滴滴精纯。不含有害金属物质及任何激素类物质。经权威检测机构检测合格，已通“过国家食品药品监督局”备案，国家食品药品监督局“许可服务”。斑美拉公司两位董事长、高层管理人员及全国各地的代理商都是亲自使用，测试。经过多年验证，事实证明，我们的皮肤依旧是非常健康的，不会对身体造成毒素作用。
至于相关反弹情况，两位董事长自推出斑美拉开始就自信先使用这款产品，很多顾客都是我们的受益者，都已经时隔多年，脸部依旧保持“非常活力”的状态，毫不夸张的说依旧比同龄人年轻10岁左右。市场上这么多年也都没有发现过一个案例有反弹的现象。斑美拉专注于脸部排毒，将脸部毒素完全排完，让脸部恢复“初始状态”后，我们的后期维护也是很重要的。身体内部也是需要清除的，所以斑美拉也会提醒所有的顾客朋友，脸部排完毒素会后，日常生活中也一定要做好内部的清洁。房子时间长了，如果不打扫，房间也会有很多垃圾啊。仅仅只需要一盒斑美拉产品能虽说不能管你一辈子，但是管你大半辈子还是能做到的。让你脸部不会再受到毒素的亲耐，还你脸部一生好皮肤！！！
九、顾客排毒案例
全球招商合作热线： 021-
微信: hx 公众号：全球斑美拉面部排毒
手机网站：
斑美拉博客：
上海分公司：上海市徐汇区天钥桥路申峰大厦803室
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　　每日经济新闻经授权转载
　　这是很多高铁乘客比较关心的话题，也经常被问到，但是真要解释情况还比较困难，见闻君只能根据所知的部分内容给大家进行说明。高铁车票的价格问题主要涉及车次的等级以及旅行距离的远近。
　　高铁的车次等级主要分为G字头与D字头两种：
　　G字头，时速350公里的约为0.48元每人公里；
　　D字头，时速250公里的约为0.32元每人公里。
　　后来高铁执行降价后：
　　G字头降速到300公里，票价降低5%，约为0.46元每人公里。
　　D字头降速到200公里，票价降低5%，约为0.3元每人公里。
　　当然，见闻君上面所说的都是高铁二等座。如果是一等座：
　　则时速300公里G字头车，0.74每人公里；
　　D字头时速200公里车，0.37每人公里。
　　如果分别提速至350公里与250公里，大约有5%的价格变动。
　　上面是通用标准，但是如果是G字头车跑时速200公里线路，也要按照时速200公里的价格进行收费的。比如北京到青岛的高铁列车，北京到济南段，二等座按照0.46元算，济南到青岛段则按照0.30元算。
　　高铁的票价执行递远递减的计价原则，分段实行折扣，大致是这样一个原则。
　　500公里以内，执行原价。以时速300公里为例，那就是每公里0.46元。
　　500公里—1000公里，约执行9折，约每人公里0.414元。
　　1000公里以上，约执行8折，每人公里约0.368元。
　　以京沪高铁为例进行计算：
　　500&0.46 500&0.414
318&0.368=230 207 117=554元。
　　现在京沪高铁的二等座价格是553元。
　　当然，这只是民间测算，虽然大多数高铁执行递远递减的规则，但是并非所有线路都是这样。详细的计算标准要以国家发改委的文件为主。
　　这本不是一个大问题，只是有人习惯将高铁当火车看，而认为航空档次高于火车，所以出现部分高铁票价格高于打折机票的情况，就大惊小怪，并以此对高铁票定价进行非议。当然，高铁如何定价问题肯定也是需要探讨的，但是无论如何有一个基本的前提，就是让高铁形成一个良性发展的状态。如果票价过高，大家都坐不起，那高铁就是废物；如果票价过低，高铁持续性的巨额亏损，无法运营下去，这种情况高铁比废物还不如，将成为国家的一个巨大负担。
　　所以，讨论这个问题的前提是，第一，保证高铁发展能够实现良性循环；第二，目前京沪、京津、沪杭、沪宁、广深等线路实现了盈利，但是大部分线路还在持续大面积亏损，中国高铁整体处于巨额亏损中。
　　然后，我们来说，在国外高铁本来就是定位比飞机高的产品，无论是在高铁的创始国日本，还是在欧洲的德国与法国，高铁的票价定价都是要高于航空的。高铁的竞争力从来就不是因为它是一种廉价的交通工具，而是在于它的安全性与舒适性。拥有宽大的空间，能够自由的走动，能够自由的看手机上网。中国是世界高铁大国中，唯一一个定价低于航空的国家。
　　当然，还有一点也应该说明，国内很多航线机票之所以会出现大幅度的折扣，也是高铁的功劳，正是因为有高铁的强大竞争力在哪里，机票才会有如此大的折扣。
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