凝血酶活性两种测定方法的比较
凝血酶是从猪血或牛血中提取的凝血酶原,经激活后而成凝血酶。凝血酶活性测定常用的底物有纤维蛋白原[1]、健康人血浆[2]等,亦有报道用NPGB滴定法[3]测定其活性的。《中国药典》规定用纤维蛋白原(以下简称纤原)作为其活性测定的底物,但纤原存在来源不便,价格较贵等缺点。为此,我们进行了混和人血浆(以下简称血浆)代替纤原进行活性测定的试验方法比较,现将结果报告如下:1资料与方法1.1一般资料①凝血酶:本单位生产,随机抽取200U、500U、1000U、2000U共30批。②纤维蛋白原中国药品生物制品检定所生化室。③混和人血浆驻马店市中心血站提供,共7人份混和。④器材37℃恒温水浴箱、秒表、微量可调加液器等。1.2方法①以纤原作底物,按《中国药典》[1]进行操作。以血浆为底物时,操作同纤原。②取15批凝血酶分别以纤原和血浆作底物进行活性测定,将所得结果进行相关性分析。③另取15批凝血酶分别以纤原和血浆为底物测其酶活性,并将血浆所测结果...&
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检测抗凝血酶l(anti一hrombinl,AT--l)功能活性(AT一皿:A)的方法有多种,本文忱较发色性多肤底物(发色底物)法与凝血酶凝胶空斑(凝胶空斑)法,现将结果报道如下: 材料与方法、侧定对象 (一)正常组41例;男16例,女25例,年龄19一63岁。均无血栓性及出血性疾病史,近期内也无服药史(包括避孕药)。 (二)病人组105例,男60例,女45例;·年龄16~80岁。均由各专科医师确诊的住院或门诊病例(附表)。 二、侧定方法 (一)发色底物法①略加改进。 1.试验原理①①于试验中加入已知过量的凝血酶,在含肝素的缓冲液中与受检血浆(含AT一皿)作用形成1:1复合物,然后加入发色底物(Bz-phe一val一Arg一NA),残余凝血酶裂解底‘物,释出生色基团对硝基苯胺(PNA)。在肝素存在的条件下,显色的程度与血浆AT,l活性呈比例关系。 2,试荆①抑肤酶Tris缓冲液于0 .2mof/LTri:缓冲液(含0.07mol...&
(本文共3页)
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目的:构建具有促进内皮修复和抗栓双重活性的融合基因,检测该融合基因在体内外的活性,为再狭窄的多基因治疗提供新的思路和试验依据。方法:通过基因重组构建hVEGF_(165)与嵌合水蛭肽(Fused hirudin,FH)融合基因的真核表达载体(hVEGF_(165)-FH/pcDNA3.0),转染内皮细胞株,检测其表达产物促进内皮细胞增殖及抗栓的活性;局部转染hVEGF_(165)-FH/pcDNA3.0,观察其是否具有抑制兔颈总动脉血管成形术后再狭窄的作用。结果:hVEGF_(165)-FH表达产物具有促进内皮细胞增殖及抗栓活性,减轻兔颈总动脉血管成形术后再狭窄。结论:融合基因hVEGF_(165)-FH具有促进内皮修复和抗栓功能,从而有效地预防再狭窄。以内皮修复为基础,构建双靶点或多靶点的融合基因可能是再狭窄防治的一个重要策略。&
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凝血酶参与血管平滑肌细胞(VSMCs)异常增生，但其增生与时相、浓度的关系，及pp60c-src、Jak2在其增生信号传递过程中的作用不清楚。本研究旨在对上述问题进行探讨。 方法
3-10代的VSMCs的单细胞悬液用于实验。1. 为明确凝血酶刺激24小时促VSMCs增殖的量效关系, 实验分六组：凝血酶组（0，0.1，0.5，1，3，10U/ml）。 2.为明确凝血酶促VSMCs增殖的时效关系（0，1，6，12，24，48，72小时）,实验分对照组(DMEM)、凝血酶（0.5U/ml和1.0U/ml）。 3、为明确pp60c-src及Jak2活性在凝血酶促VSMCs增殖中的作用,实验分对照组(DMEM)、凝血酶组（0.5U/ml）、凝血酶和PP1组（PP1，Src特异性抑制剂，TH0.5U/ml＋PP1 10μmol/L）、凝血酶和AG490组（AG490，Jak2特异性抑制剂，TH0.5U/ml＋AG490 50μmo...&
(本文共31页)
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··········
微循环学 杂志 ,)
○2005 　CHINESE JOURNAL
OF MICROCIRCULATION
凝血酶活性的检测及临床意义
　　张 　莹
　　[ 中图分类号] 　R33 1 　　[文献标识码] 　A 　　[文章编号] 　1005 -
、外源凝血系统激活的共同结果导致血循环中凝血活
血酶的形成 ,其生成增多导致血栓形成而生成减少则导致出
内酶的形成 ,凝血活酶使凝血酶原转变为凝血酶 ,凝血
血 。凝血酶作为促凝系统的终端酶 ,其生成检测是反映血浆
酶作用于纤维蛋白原 ,使之形成纤维蛋白单体 ,并先
中高凝状态变化的敏感检测指标 ,直接反映了血栓形成的倾
后释放出纤维蛋白肽 A ( FPA) 和纤维蛋白肽 B ( FPB)
向。因此凝血酶形成的检测是评价血液凝固能力的敏感和
形成纤维蛋白 血栓形成 。凝血酶活性的检测是评价凝血
有效的方法 。凝血酶不但参与凝血过程 ,还作为一种重要的
系统功能的重要手段[ 1 ,2 ]
。近年来 ,实验室直接或间接检测
细胞外信号分子 ,通过激活凝血酶受体 ,参与一系列病理过
凝血酶的方法有较大的发展 ,特别是直接检测凝血酶活性更
程[4 ] 。如 ;裂解纤维蛋白原形成纤维蛋白血栓 ,激活血小板 ,
是实验医学的研究热点 ,本文就这些检测方法及其临床意义
并认为此过程在经皮冠状动脉成形术后再狭窄的形成起始
作一综述 。
动作用[ 5 ] 。不但如此 ,凝血酶活性及其受体表达被认为和其
他生长因子一起参与血管损伤后血管的增殖反应[ 6 ]
1 　凝血酶分子结构及生理 、生化特性
1. 1 　分子结构特性
2 　凝血酶检测方法
凝血酶是由308 个氨基酸残基所组成的蛋白酶 ,分子量
2 . 1 　间接检测方法
为 36 000 ,是一个双链分子 , 由A 、B 两条链组成 ,两条链之
由于凝血早期产生的凝血酶很快被体内的抗凝物质中
间由二硫键连接 。凝血酶分子至少有三个相互独立的结构
和 ,故直接测定凝血酶非常困难 , 已知凝血酶激活至血栓形
位点 ,即催化位点 或称激活位点 、阴离子结合位点 或称纤
成的每一过程都有特定的凝血标志物的产生 ,因此可通过检
维蛋白结合位点 和肝素结合位点 。这三个位点均表现为不
测血浆中参与促凝系统的中间阶段物质来间接反映凝血酶
同分子以不同的结合形式相结合 ,这是由于对不精确结合的
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& 土鳖虫与日本医蛭提取物抗凝血酶活性的比较研究
土鳖虫与日本医蛭提取物抗凝血酶活性的比较研究
(药理药化(
土鳖虫与日本医蛭提取物抗凝血酶活性的比较研究
李友宾,张　健,段金廒,徐　蓉
(1.江苏省中医药研究院,江苏南京　210028;　2.南京中医药大学,江苏南京　210029)
摘要:目的研究土鳖虫提取物的抗凝血作用,并与日本医蛭抗凝活性做了比较,为土鳖虫的新药开发提供实验依据。方
法采用凝血酶直接滴定法。结果鲜(干)土鳖虫提取物的抗凝血活性均很强,与日本医蛭相当。但土鳖虫和日本医蛭
抗凝血酶活性成分对热稳定性有差异。结论土鳖虫中含有直接作用于凝血酶的成分,但不同于日本医蛭的抗凝血酶成分。
关键词:土鳖虫;　日本医蛭;　抗凝活性;　凝血酶
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:06)
ComparativeStudiesofAnticoagulantActivityofEupolyphagasinensisandHirudonip2poniainvitro
LIYou2bin,ZHANGJian,DUANJin2ao,XURong
(1.DepartmentofTCMChemistry,JiangsuProvincialAcademyofTraditionaledicine,Nanjing.NanjingUniversityofTraditionaledN)
Abstract:ObjectiveTostudytheanticoagulantacitvityofirudonipponiaex2
tract.MethodsDirectlytitrationonthrombin.Resultshighyinhibitiveactvitiestothrombin,ponentsaredifferent.Conclusio2nEupolyphagasinensisaredifferentfromHirudonippmnia.Keywords:　H　　Thrombin
　　,始载于《神农本草经》。、续筋骨折伤、瘀血经闭、Y瘕痞块;水蛭有破血、逐瘀、通经的功能,历来用于治疗症瘕、痞块、血瘀闭
经、跌打损伤。对水蛭的活性成分报道较多,大致可分为两大类:一类是直接作用于凝血系统的成分,包括凝血酶抑制剂,以及其它抑制血液凝固的物质,这或许就是水蛭活血化瘀的物质基础;二类是其它蛋白酶抑制剂及其它活性成分[2]。土鳖虫的活性成分研究较少,药理研究报道其提取液在家兔体内外均能使血浆KPTT,PT及TT延长,其作用随土鳖虫提取液浓度的增加而增强,抗凝活性不依赖于AT2III。从而推测是对凝血酶发挥的直接
作用。本实验对土鳖虫的水提液进行了抗凝血酶活性研究,并与日本医蛭的抗凝血酶活性进行了比较。1　材料1.1　药材土鳖虫,鲜品购于江苏省常州市奔牛镇东桥村土元养殖总场,干品购于江苏省中西医结合医院药材科,经本研究室鉴定为鳖蠊科昆虫地鳖(EupolyphagasinensisWalker)的鲜或干燥雌体;日本医蛭,鲜品购于江苏省宿迁保安养蛭场,干品为鲜品用钓鱼线上经太阳直接晒干而成,经本研究室鉴定为日本医蛭HirudonipponiaWhitman。1.2　试剂凝血酶,常州生化千红制药有限公司,使用前以蒸馏
μ1(NIH单位)的溶液;牛纤维蛋水溶解,配成浓度为(0.1ATU/
白原(MpBiomdicalsIns　方法2.1　干品试液制备称取土鳖虫和日本医蛭干品细粉(40目)2g,加8倍量蒸馏水浸泡1h,置研钵中研磨成匀浆,4℃冷浸提取,12h后,15000r/min离心15min,取上清,沉淀再用7倍量蒸馏水浸提8h,同法离心,与上述上清合并,浓缩定容至0.076g(生药)/ml,置4℃保存备用。2.2　鲜品试液制备称取土鳖虫和日本医蛭鲜品各20g,用蒸馏
水洗去泥沙,加6倍量蒸馏水,高速组织捣碎,置4℃冰箱浸提过
夜,15000r/min离心15min,取上清,沉淀再用6倍量浸泡提8h,离心,与上述上清合并,置4℃保存备用。2.3　抗凝血酶成分的对热稳定性量取土鳖虫和日本医蛭鲜品提取液各2ml分别于小试管中,置沸水浴加热5min,冷却补足蒸发失去的水分后12000r/min离心15min,取上清备用。2.4　活性测定方法Markwartdt凝血酶直接滴定法[4]略作改动。精密量取样品液100μ1,置几只小试管(10mm×100mm)中,加入含0.5%(牛)纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨苓甲烷盐酸溶液(取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.1mol/L盐酸溶液约40ml,加水至100ml,调pH值至7.4)200μl,摇匀,置恒温水浴(37±0.5)℃中缓缓滴加凝血酶溶液(每分钟5μl边滴加边轻轻摇匀)至凝固[凝血酶溶液的浓度,将凝血酶溶液配成以20NIH/ml为基准浓度的一系列浓度梯度(10×20,5×20,3×20,2×20,1/2×20,1/4×20,1/10×20,……),使用不同浓度的凝血酶溶液来滴定血纤维蛋白原和待测水蛭提取物(土鳖虫提取物)的混合溶液,从高浓度到低浓度的凝血酶逐步缩小水蛭提取物(土鳖虫提取物)的活性范围,然后再精确滴定]。记录消耗凝血酶溶液的体积,中和一个单位的凝血的量,为一个抗凝血酶活性单位。根据消耗凝血酶的量,计算出每克生药的抗凝血酶活性。每个样品测定3次。3　结果3.1　抗凝血酶活性土鳖虫和日本医蛭水提物的抗凝血酶活性测定结果见表1。用凝血酶直接滴定法,测出土鳖虫有抗凝血酶作用,单从抗凝血酶活性来看,土鳖虫的抗凝活性与日本医蛭处于同一数量级,说明土鳖虫与日本医蛭有相当的抗凝活性。结果还显示土鳖虫干燥后其抗凝活性变化性不大,而日本医蛭干燥后活性降低了1倍。3.2　抗凝血酶成分的对热稳定性结果见表2。由加热结果看出,土鳖虫的抗凝成分对热不稳定,加热使其活性快速损失,而日本医蛭的抗凝活性成分对热较稳定,100℃加热5min对其活性
收稿日期:;　修订日期:
几乎没有影响。说明土鳖虫的抗凝活性成分与日本医蛭的抗凝
作者简介:李友宾(19652),男(汉族),四川内江人,现任江苏省中医药研
活性成分有差异。究院副教授,博士学位,主要从事中药活性成分研究工作.
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