第56卷　第3期　
　2005年3月　　化　　　工　　　学　　　报　　　　　　　Vol156　No13　Journal　of　Chemical　Industry　and　Engineering　(China)　　March　2005综述与专论离子液体在生物催化中的应用
刘丽英,陈洪章
(中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京100080)
摘要:近年来,离子液体(ILs)以其独特的优势成为生物催化反应研究的热点,尤其是作为生物催化反应的溶剂或共溶剂的研究更是备受关注.许多酶能在ILs.如目前研究最多的脂肪酶,有多种能在ILs中表现出活性稳定、;某些蛋白酶在ILs中稳定性提高,具有酯酶的活性;β2半乳糖苷酶在ILs;IL也较好;但是也有某些酶,如纤维素酶IL.因此有关这一方面的研究还有待进一步深入.
关键词:离子液体;中图分类号:TQ文献标识码:A文章编号:05)03-0382-05
Applicationsofionicliquidsinbiocatalysis
LIULiying,CHENHongzhang
(StateKeyLaboratoryofBiochemicalEngineering,InstituteofProcessEngineering,
ChineseAcademyofSciences,Beijing100080,China)
Abstract:Overthepastyears,ionicliquids(ILs)havegainedincreasingattentionassolventorco2solventforperformingbiocatalyticreactionswithsometimesremarkableresultsbecauseofitsspecialadvantages.Enzymesofwidelydifferenttypesarecatalyticallyactiveinionicliquidsoraqueousbiphasicionicliquidsystems.Lipaseshavebeenmainlystudied.Someofthemmaintaintheiractivityinanhydrousionicliquidmediaandthe(enantio)selectivity,yieldandoperationalstabilityareoftenbetterthanthatintraditionalmedia.SomeproteinasecouldcatalyzetransesterificationinILsandshowedimprovedstability.andsomeperoxidasedecreasesorislost.Sofurtherstudyisneededtoimproveenzymeactivity.Keywords:ionicliquids(ILs);enzymeTheapplicationofILstowhole2cellsystemsandβ2galactosidaseisalsosuccessful,buttheactivityofcellulase
生物催化的有机反应具有反应条件温和、无环
境污染、速度快、选择性高等优点.尽管非水相生
物催化反应后处理方便,但传统的有机溶剂通常限
制了酶的活性和选择性.多年来,人们一直试图解决酶的固定化和在有机溶剂中失活的问题.最近发现,用ILs代替传统的有机溶剂作为生物催化反应的介质,就是一个很好的解决办法.离子液体[1](ionicliquids,ILs)是100℃下呈液态的盐,一般由有机阳离子和无机阴离子组成.与传统的有机溶剂和电解质相比,ILs
具有一　　收到初稿,收到修改稿.
),女,博士.联系人:陈洪章.第一作者:刘丽英(1976—　　Receiveddate:.Correspondingauthor:Prof.CHENHongzhang.E-mail:
hzchen@home1ipe1ac1cn
Foundationitem:supportedbytheStateKeyDevelopment
ProgramforBasicResearchofChina().基金项目:国家重点基础研究发展规划项目().
　第3期　　刘丽英等:离子液体在生物催化中的应用?383?
系列突出的优点:(1)几乎没有蒸气压,不挥发;(2)具有较大的稳定温度范围(从低于或接近室温
)、较好的化学稳定性及较宽的电化学稳到300℃
定电位窗口;(3)通过阴阳离子的设计可调节其对无机物、水、有机物及聚合物的溶解性,能和许多溶剂形成两相体系,并且其酸度可调至超酸.因此它被称为“绿色溶剂”.
ILs的种类很多,理论上可通过改变不同的阴阳离子组合而合成不同的ILs.ILs中常见的阳离子类型有烷基铵阳离子、烷基钅翁阳离子、N2烷基吡啶阳离子和N′,N′2二烷基咪唑阳离子等(如图1),
其中以烷基取代的咪唑阳离子研究最多.阴离子主
(CF3SO2)2N-、(C2F5SO2)2N-、要有BF4-、Cl-、PF6-、
-NO3-、Al2Cl7-、Au2Cl7、(CF3SO2)3C-、CF3SO3-、-SO2等.以Cl-和BF4-为阴离子的ILs与水是混4
溶的,而以(CF3SO2)2N-和PF6-为阴离子的ILs不
仅不溶于水而且也不溶于烷烃和醚类等非极性液体.
typesofcationsinionicliquids
reactionsusingionicliquids
Biocatalyst
RhodococcusR312wholecell
][PF6]/buffer(two2phase)[H3NEt3][NO3]
[BMIM][PF6]/buffer(two2phase)[BMIM][PF6]
[OMIM][PF6];[BMIM][PF6];[EMIM][BF4];[BMIM][BF4];[BMIM][(CF3SO2)2N];[EMIM][(CF3SO2)2N];[MTOA][(CF3SO2)2N]10differentILs
proteinrenaturation
Reactionsystem
extractionoferythromycin
recoveryofn2butanolfromfermenta2tionbroth
synthesisofZ2aspartame
transesterificationofN2acetyl2L2phenylalanineethylester(tyrosinethylester)with12transesterificationofN2acetyl2phenylalanineethylesterwith12butanol
Ref.[4][5][6][7][8—10]
heneggwhitelysozymewholecellofyeastthermolysine
α2chymotrypsin
eightlipasesandtwoesterasesCALB,PCL
kineticresolutionof(R,S)212phenylethanol[11][12][13][14,15]
[EMIM][PF6];[BMIM][PF6]kineticresolutionofsecondaryalcohols
severalILs;washingwithaqueouskineticresolutionof(R,S)212acylationof
β2glucosesodiumcarbonate
[EMIM][BF4];[BMIM][PF6];
[BMIM][(CF3SO2)2N];[EMIM][(CF3SO2)2N];[BMIM][BF4]
[BMIM][PF6];[BMIM][BF4];[BMIM][(CF3SO2)2N];
[BMIM][CF3SO3];[BMIM][SbF6][BMIM][(CF3SO2)2N][BMIM][(CF3SO2)2N];[EMIM][(CF3SO2)2N][MMIM][MeSO4];[42MBPy][BF4]
[MMIM][MeSO4]/buffer(one2　phase)
[BMIM][BF4]/buffer(one2phase)[BMIM][PF6];[BMIM][BF4]
synthesisofbutylbutyratebalco2perhydrolysis
CALB,PCL,CRL,　porcineliverlipase
Pseudomonassp1lipase
kineticresolutionofallylicalcohols[16]
kineticresolutionof(R,S)212influenceof
wateractivityandtemperature
kineticresolutionofphenylethanolandesterificationof12octanolinthepresenceofsupercriticalCO2regenerationofNADH
synthesisofN2axetyllactosamine
hydrolyticactivity
transesterificationunderreducedpressureor
kineticreso2lutionof52phenyl212penten232transesterificationof22hydroxymethul21,42benzodioxanekineticresolutionofnates
P2chiralhydroxymethanephosphi2
[17,18][19,20][21][21,22][23][24,25]
formatedehydrogenase
β2galactosidase,subtilisin,　Bacilluscirculans
lipase,PFLAK[BMIM][PF6];[BMIM][BF4][26]
　　Note:BMIM,12butyl232CALB,CandidaantarcticalipaseB;(CF3SO2)2N,bis(trifluoromethyl)CRL,CEMIM,12ethyl232MBPy,12butyl242MMIM,12methyl232MTOA,meOMIM,12octyl232PCL,PseuPFL,
Pseudomonasfluorescenslipase.
?384?化　　　工　　　学　　　报　　第56卷
　　从目前的研究来看,ILs在生物催化过程中有3种作用模式:作为纯溶剂,在水相或两相系统中
作为共溶剂.[BMIM](12丁基232甲基咪唑)[PF6]或[BMIM][(CF3SO2)2N]常作为纯溶剂
2　ILs在脂肪酶生物催化中的应用
目前报道的能在ILs中保持活性的酶多数为脂肪酶.一般来讲,脂肪酶对纯有机溶剂有较强的耐受力,能够在其中保持活性[29].
Lau等[14]首次用脂肪酶证明了ILs用于生物催化的潜力.作者在无水体系中,用CALB作催化剂,在ILs、氨解反应和环氧化反应,纯[BMPF6]或[BMIM][],反应4h,.
脂肪酶和酯酶通常用于外消旋化合物的动力学分解,一般通过催化水解反应、酯化反应或酯交换反应来实现.从已有研究来看,脂肪酶在ILs中能提高反应的对映体选择性,而且与在MTBE中的反应相比,选择性受水含量或温度的影响较小[11～17].但是由于各实验室制备的ILs的纯度不同,致使脂肪酶在同一种ILs中表现出不同的活性.如Sch fer等[11]对8种不同脂肪酶和2种酯酶在10种不同ILs和甲基叔丁基醚(MTBE)中的活性进行了研究,采用乙酸乙烯酯作为酰基供体.结果发现2种酯酶失活,而Pseudomonas脂肪酶和Alcaligenes脂肪酶在[BMIM][(CF3SO2)2N]中的对映选择性比在MTBE中的对映选择性显著提高,CALB在[OMIM][PF6]、[BMIM][(CF3SO2)2N]和[BMIM][CF3SO3]的效果最好.Park和Kazlauskas[12]也报道在[MOEMIM](12甲氧乙基232甲基咪唑)[BF4]中进行脂肪酶催化葡萄糖的区域选择性酰基化反应,产率达99%,选择性为93%,此值远远高于通常使用的有机溶剂中的值.但是Sch fer发现CALB在[BMIM][PF4]和[BMIM][PF4]中几乎没有活性,而Park等发现CALB能在上述两种ILs中保持活性[12～16],这是由ILs的纯度不同引起的.研究发现ILs制备过程中的水洗次数也会影响酶的活性.早期对Pseudomonas脂肪酶的研究也表明反应介质中的水含量对酶的活性有重要影响[24].
人们对ILs中酶的回收利用的研究表明,酶可以回收循环使用,但是随着使用次数的增加酶活会逐渐降低.Lozano等[19]和Reetz等[20]研究了固定化的CALB在ILs中的催化反应,发现底物和产物都会溶解在超临界CO2形成的第二相中.
或两相体系共溶剂.与水混溶的ILs如[BMIM][BF4]、[MMIM](12甲基232甲基咪唑)[MeSO4]可用作水相共溶剂[2].ILs中生物催化研究的热点是通过调节ILs的不同阴阳离子组合,调节ILs的溶解性,从而形成两相或多相反应体系[3](图2),以利于最终产品的分离.表1对这几年来所有使用ILs作为反应体系的生物催化过程作了总结.对ILs
Fig12　Three2phasecomposedofcyclohexane(top),waterwithbluedye(center)andIL(bottom)(Ref[3])
1　ILs在蛋白酶生物催化中的应用
目前有关蛋白酶在ILs中催化反应的研究较少.Erbeldinger等[7]首次在[BMIM]
用嗜热菌蛋白酶作催化剂合成天门冬氨酰苯丙氨酸甲酯,发现酶的稳定性提高.反应后,产物可通过水洗和沉淀而分离,ILs能重复使用且不影响产率.该研究证明了ILs具有在生物催化中应用的潜力.此后,人们对α2凝乳蛋白酶在ILs中的活性进行了研究[9,10,27].研究发现反应中必须添加一定量的水才能保证α2凝乳蛋白酶的活性,但是对酶在ILs中的酶活水平的报道并不一致.Laszlo和
发现α2凝乳蛋白酶在ILs进行的催化反应的反应速度和在有机溶剂(乙腈或己烷)中的Compton
反应速度在同一量级.Iborra等[9]发现α2凝乳蛋白酶在ILs中的活性只有其在12丙醇中活性的10%～50%,但是酶的稳定性提高.而Eckstein等
道有少量水存在条件下,α2凝乳蛋白酶在ILs中的活性高于在有机溶剂中的活性.此外,Zhao和Malhotra[28]用ILs代替传统有机溶剂,研究了蛋
白酶催化N2乙酰氨基酸酯的分解动力学,这是采用水溶性ILs作为共溶剂的少数几篇报道之一.
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07 文章编号： 1004-面包酵母催化不对称还原 EOPB 反应中的溶剂效应* 石玉刚 ， 励建荣， 唐琼杭州 310035）（ 浙江工商大学食品与生物工程学院浙江省食品安全重点实验室， 浙江44摘要： 研究了非水介质中面包酵母催化不对称还原 2氧代- 苯基丁酸乙酯（ EOPB） 合成手性 2羟基- 苯 361 EHPB 的 e. e. 值较之 基丁酸乙酯（ EHPB） 的反应。乙醚体系中湿酵母（ WB） 催化 6mmol?L EOPB 合成（ R） -3. 于干酵母（ DB） 提高了近 19% ， WB 稳定性较差。DB 催化该反应的立体选择性随溶剂 log P（ 0. 82- 2） 的 但 增加而降低， 反应从相同 log P 值（ 3. 2） 的二甲苯转换至环己烷后产物构型由 R 转为 S， 经有机溶剂预处理后 酵母醇脱氢酶（ YADH） 的紫外及荧光光谱的特征变化表明溶剂分子极性与结构的协同作用下酵母催化行为 发生了改变。 4关键词： 面包酵母； 不对称还原； 手性； 2羟基- 苯基丁酸乙酯 中图分类号： O621. 34 文献标识码： AEffect of organic solvents on asymmetric reduction of ethyl- oxo- phenylbutyrate mediated by saccharomyces cerevisiae 24SHI Yugang * ，LI Jianrong，TANG Qiong（ School of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Food Safety Key Lab of Zhejiang Province， Hangzhou 310035，China） Abstract： The asymmetric reduction of ethyl- oxo- phenylbutyrate （ EOPB） catalyzed by saccharomyces cerevisiae in organic 2- 4phase to synthesize chiral ethyl- hydroxy- phenylbutyrate （ EHPB） was investigated. In diethyl ether with the initial EOPB 24concentration of 6 mmol?L -1 ，the e. e. （ R） EHPB was increased 19% by using wet baker's yeast （ WB） as biocatalyst compared to that by dry baker's yeast （ DB ） . However，the catalytic activity and stability of WB was lower than that of DB. The enantioselectivity of the reduction to produce （ R） EHPB was reduced with the increase of the log P value （ 0. 82- 2） of employed 3. organic solvents. Although dimethylbenzene and cyclohexane had the same log p value （ 3. 2 ） ，the enantioselectivity of the reduction was reversed from R to S when dimethylbenzene was in place of cyclohexane as reaction media. Significant changes were observed in the UV absorption and fluorescence spectrum of the YADH from the yeast pretreated by the solvents. These facts indicated that the synergistic effect of solvent polarity and its spatial structure led to the change of the catalytic behavior of baker's yeast. Key words： baker's yeast； asymmetric reduction； chirality； ethyl 2hydroxy- phenylbutyrate 4-0511收稿日期： 2010- 17； 修回日期： 2010- 07 基金项目： 浙江省自然科学基金（ Y4100762） 资助项目； 浙江省教育厅科研项目（ Y） 资助项目； 浙江工商大学人才引进科研基金 （ 09- 资助项目； 2009 年浙江省大学生科技创新活动计划资助 57） ） 男， 联系人简介： 石玉刚（ 1980- ， 讲师， 主要研究方向： 绿色化学及功能食品添加剂。Email： yugangshi@ 126． com146化学研究与应用 高光学活性的 αC羟基酯可由面包酵母第 23 卷［16 ］ 酶） 也有 S 型酶 ， 往往需要通过改变底物或调（ Saccharomyces cerevisiae） 选择性催化还原 α C羰 基酯 制 得［1-］ 5节反应条件使其中一类酶起主要作用， 达到突显 某种手性选择性的目的。 使用非水介质尤其是非 这类研究目 极性有机溶剂是其中一种重要手段， 前多集中在报道有机溶剂 使 用 后 催 化 效 果 的 改 变， 而关于溶剂对生物催化剂自身影响的研究较 为少见。本文以面包酵母催化不对称还原 EOPB 为模板反应（ 图示 1） ， 研究了部分有机溶剂的 log P 值及其分子结构对该生物催化反应的影响， 结 合 YADH 样品经有机溶剂处理前后的紫外及荧光 初步探讨了致使酵母催化行为变 光谱特征变化， 化的溶剂效应。， （ R ） - 羟 基- 苯 基 丁 酸 乙 酯 24而［ R） （ EHPB］ 是其中一类重要手性目标产物， 它是 angiotensin 合成 众 多 血 管 紧 张 肽 转 换 酶 （ ACE， converting enzyme） 抑制剂类药物的关键手性中间 体［6， 7 ］， 相关合成方法已见较多报道［8- ］ 10。 本课题组前期系统研究了面包酵母催化不对称还原 2羰 4EHPB 的反 基- 苯基丁酸乙酯 （ EOPB） 合成 （ R） 应情况［11- ］ 15。面包酵母催化还原反应中起关键作用的醇脱氢酶 （ Yeast alcohol dehydrogenase，YADH） 既有 R 型酶 （ 将底物还原为 R 构 型 产 物 的 脱 氢图示 1 Scheme 1面包酵母催化不对称还原 EOPBThe asymmetric reduction of EOPB catalyzed with baker’ yeast s1 机溶剂使用前经 4A 分子筛脱水。95- 型磁热搅11. 1实验部分试剂与仪器 Saccharomyces cerevisiae（ 桃花包点干酵母， 梅LD4- 型离心机 （ 北京 2 拌器 （ 上海医用仪器厂 ） ， UV医用离心机厂 ） ， 2102 PC 紫外可见光分光光 RF度计 （ 尤尼科 （ 上海 ） 仪器有限公司 ） ， 5301 荧 GC9790 型气相色谱分析 光光度计 （ 岛津公司 ） ， 仪 （ 福立分析仪器有限公司） 。 1. 2 1. 2. 1 面包酵母蛋白质含量测定（ Bradford 法） 标准曲线的制作［17 ］24山马利酵母有限公司 ） ， 氧代- 苯基丁酸乙酯 （ EOPB， 纯度 99% ， 武进卫星化学试剂厂 ） ， 标样 （ R） - 羟 基- 苯 基 丁 酸 乙 酯 ［ R ） 24（ EHPB， 度 纯 99% ， ALDRICH 化学公司 ］ 其余化学试剂均为分 ； 析纯， 中国医药（ 集团） 上海化学试剂公司出品； 有表1 Fable 1 试管编号 标准蛋白含量 （ μg） 标准蛋白溶液 （ mL） 蒸馏水 （ mL） 考马斯亮蓝试剂 （ mL） 注： 标准牛血清蛋白蛋白含量： 0. 1mg / mL 0 0 0 1. 0 1 10 0. 1 0. 9取 11 支干净试管， 分两组按表 1 平行操作。标准溶液的配制Preparation method of standard solutions 2 20 0. 2 0. 8 3 30 0. 3 0. 7 4 40 0. 4 0. 6 5 50 0. 5 0. 5 4 6 60 0. 6 0. 4 7 70 0. 7 0. 3 8 0 0. 8 0. 2 9 10 0. 9 0. 1 10 20 1. 0 01h 将所配溶液摇匀， 内以 0 号试管为空白对 照， 595nm 处测定 OD595nm ， OD595nm 为纵坐标， 在 以 标准蛋 白 含 量 为 横 坐 标， 坐 标 纸 上 绘 制 标 准 在 曲线。 1. 2. 2 酵母蛋白含量的测定 取 1g 湿酵母于离 加入 10mL 磷酸盐缓冲液充分溶解后超声 心管中， 10000r / 破壁 9min； 破 壁 后 低 温 离 心 10min （ 4℃ ，min） 。取上清液 0. 1mL 稀释 100 倍到 10mL， 2 取# # 1# 支试管（ 1 和 2 ） ， 试管中加入 0. 1mL 磷酸盐缓2 冲液和 4mL 考马斯亮蓝试剂作为空白， 试管中 加入 0. 1mL 稀释后上清液与 4mL 考马斯亮蓝试 混合均匀后在 595nm 处测定 OD595nm ， 在标准曲 剂， 线上查出标准蛋白的量， 从而计算出湿菌体的蛋 白含量。干酵母蛋白含量测定方法同上。#第2 期 1. 3石玉刚等： 面包酵母催化不对称还原 EOPB 反应中的溶剂效应［13 ］147面包酵母催化还原 EOPB 反应 1. 3. 1 干酵母法 （ DB 法 ） 1. 55mL 去离子水、 1g 干酵母（ DB） 依次置于 60mL 酶反应器中， 密闭反 应器于 4℃ 下预平衡 24h 后移入 20mL 无水乙醚， 混合均匀 后 置 于 恒 温 水 浴 中， 力 搅 拌， 温 至 磁 升－1 30℃ ， 加入 6mmol ?L EOPB， 计时反应 24h。 反 应结束后， 过滤除酵母， 滤液用 5g 无水硫酸钠干燥测蛋白 质 含 量 及 酶 活 ， 余 上 清 液 加 入 丙 酮 其 （ － 2℃ ， 上清液 ∶V 丙酮 = 2∶1） ， V 4000r 离心 20 min（ 0℃ ， ?m － 1 ） 。吸取 2mL 上清液测蛋白含量及酶活， 其 V 余上清液滴加丙酮 （ － 2℃ ， 上清液 ∶ V 丙酮 = 20 ∶ 11 ） ， － 2℃ 沉淀完全， 4000r ? m － 1 ） 。 离心 15min （ 0℃ ， 沉淀溶于少量蒸馏水， 冷水透析 3h， 离心除沉淀得 YADH 样品， （ pH8，0. 2M） 溶解， 用磷酸盐缓冲液 定容制得待测样品。 1. 6 紫外（ UV） 及荧光（ FS） 光谱分析 将上述 YADH 样品溶液预先于 30℃ 恒温 10min 1901 紫外分 后， 进行 UV 与 FS 光谱扫描。使用 TU光光度计测定酵母样品的紫外吸收光谱， 波长扫描 350 nm， 范围： 190测定温度 30℃ ， 1cm 光径比色 在 5301PC 荧光分 皿中进行吸收光谱扫描。使用 RF激发光栅及发射 光光光度计测定样品发射光谱， 光栅狭缝宽均设为 3nm， 激发波长分别为 280nm， 295nm； 石英比色皿 1cm × 1cm × 4cm； 激发波长分 别为 250nm （ Δλ = 60nm） 和 275nm （ Δλ = 15nm） ， 370 nm 和 290狭缝宽度为 3 /3nm， 分别测定 310330 nm 范围内的同步荧光扫描光谱。所有实验均 重复 3 次以上。3h， 减压旋转蒸发除溶剂制得粗产物 。 1. 3. 2 湿 酵 母 法 （ WB 法 ） 取 12. 0g 酵 母 粉、 6. 0g 蛋白胨、 0g 葡萄糖， 6. 溶于 1200mL 去离子水 121℃ 下 灭 菌 中。分 置 于 6 个 1L 锥 形 瓶 中， 25min。冷却 后， 瓶 中 添 加 0. 2g 干 面 包 酵 母 向 （ DB） ， 150r 于摇床上有氧培养 24h （ 30℃ ， / min） 后 5000r / min） ， 除上清液， 生理盐水洗两 离心 （ 4℃ ， 次， 低温离心后收集湿菌体 （ WB） ， 冰箱内贮存备 20mL 用。向上述酶反应器中， 依次加入 2. 08gWB， 无水乙醚， 混合后置于恒温水浴中， 磁力搅拌， 升 －1 温至 30℃ ， 加入 6mmol?L EOPB， 计时反应 24h。 反应结束后， 样品处理同上。 1. 4 1. 5 还原产物分析［15 ］溶剂预处理后酵母醇脱氢酶 （ YADH） 样品制备 0. 625mL 水、 25mL 有机溶剂 （ 乙醚、 、 苯 甲苯、 、 、 环己烷 邻二甲苯 间二甲苯和对二甲苯 ） 依次置 于 60mL 酶反应器中， 磁力搅拌， 水浴恒温 30℃ ， 加 入 DB 1. 25g， 预处理 5h 后， 除溶剂（ 利用无水乙醚 25mL × 3 ） ， 风 吹 干， 碎 过 筛 洗脱 残 余 溶 剂， 冷 磨 （ 100 目） 后冷藏保存。 20g DB 溶解于 80mL Na2 HPO4 溶液 （ 0. 066mol ?L － 1 ） ， 37℃ 恒 温 2h， 拌。 室 温 提 取 3h， 心 搅 离 －1 20min（ 4000r ? m ） ， 上清液 55℃ 恒温 20min， 冷－1 却， 离心 20min （ 4000r ?m ） 。 吸取 2mL 上清液22. 1结果与讨论WB 乙醚单相体系中 DB、 催化行为对比 利用 Bradford 法测定 WB 及 DB 蛋白质含量0. 故 分别为 0. 340g / g WB、 707g / g DB， 1g DB 中蛋 白质含量 （ 0. 707g） 等同于 2. 08g WB 中的蛋白质 含量； 恒重法测得 2. 08g WB 中含水 1. 55mL。 蛋 白质含量及初始水含量恒定， 分别利用 DB 或 WB 催化不对称还原 EOPB， 结果如表 2 所示。表2 Table 2 序号 1 2 3 4 5 酵母类型 DB Fresh WB Fresh WB Fresh WB Fresh WBDB、 对催化不对称还原 EOPB 反应的影响 WB Effect of DB and Fresh WB on the reduction of EOPB e. e. （ R） （ % ） 76. 2 95. 1 94. 5 93. 3 92. 11EOPB （ mmol?L -1 ） 6 6 5 4 3Conv. of EOPB （ % ） 52. 6 26. 5 24. 8 23. 9 23. 4Yield of EHPB （ % ） 29. 4 8. 6 9. 5 9. 8 10. 7Conf. R R R R R1. 6mmol L EOPB， 20mL diethyl ether， 30℃ ， h. 24 注： 1g DB （ 2. 08g WB） ， 55mL H2 O，148化学研究与应用第 23 卷DB、 在乙醚单相体系中， WB 催化不对称还原 EOPB 反应产物均以 R 构型为主， 较 DB 表现 WB WB 催 化 还 原 出更 好 的 催 化 反 应 立 体 选 择 性， 6mmol?L － 1 EOPB 的产物对映体过量值较 DB 提 这可能是因为 WB 中催化还原合成 R 高了近 19% ， 型产物的 YADH 活性更高。 但 WB 对于外界环境 且活细胞代谢过程更需外加能量 变化较 DB 敏感， 物质以维持其较高活性， 本实验条件下 （ 无能量添 WB 加） ， 催化活性低于 DB， 因此 WB 催化反应的 EOPB 转化率及 EHPB 产率均低于 DB 一倍以上。 WB 提高底物浓度， 催化反应的 EOPB 转化率略有 ， EHPB 产率由 10. 7% 降至 8. 9% ， 说明增 升高 而Table 3 序号 1 2 3 4 5 贮存时间 （ h） 0 2 4 7 141大 底 物 浓 度 加 剧 了 EOPB、EHPB 水 解 副 ［11， ］ 12 。 反应 WB 活性不稳定， 延长 WB 贮存时间其活性迅 4℃ EOPB 转化率减小了 速降低， 下保存 14 天后， 78% ； 催化生成 S 型产物的 YADH 活性下降更快， 贮藏 1 周后 WB 催化产物中几乎检测不到 S 型产 物（ 表 3 ） 。 尽 管 活 性 DB 催 化 EOPB 合 成 （ R ） EHPB 反应立体选择性较 WB 低， 但可通过优化反 应条件等手段加以改善， DB 在合适温度下即可 且 反应重复性好， 操作简 长时间维持酵母活性状态， 单， 因此选择 DB 法为主要研究对象。表 3 WB 贮藏时间对反应的影响 Effect of storage time of WB on the reduction Conv. of EOPB （ % ） 26. 5 26. 1 24. 6 20. 5 5. 6 Yield of EHPB （ % ） 8. 9 8. 5 5. 7 4. 9 0. 08 Conf. R R R R Re. e. （ R） （ % ） 95. 1 96. 6 98. 2 ＞ 99. 9% ＞ 99. 9%6mmol L EOPB， 20mL diethyl ether， 30℃ ， 24h. 注： 2. 08g WB，2. 2 非水相反应介质的影响 2. 2. 1 有机溶剂对酵母催化 EOPB 反应的影响 反应介质的不同会导致酶 分 子 立 体 选 择 性 的 变 化， 这种变化不仅发生在从水相转移至有机相， 还 ［18- ］ 19 。 发生在从一种有机相转换到另一种有机相 水相介质 中 酵 母 催 化 EOPB 的 反 应 产 物 大 多 为 1 （ S） EHPB［12，15］， 而恒定初始加水量 （ 30g?L ） 的 有机反应介质可使该反应 立 体 选 择 性 根 本 性 逆 转。提 高 介 质 疏 水 性， 现 EHPB 产 率 及 e. e. 发（ R） 值均有不同程度降低 （ 图 1） 。 这可能是由于 溶剂极性的改变， 导致酶分子中疏水性与亲水性 最终导致酶分 氨基酸残基的位置发生较大变化， ［20 ］ 子立体选择性的变化 。 二甲苯与环己烷 log P 值相同， 但酵母在二者中催化 EOPB 反应的产物 构型完全相反， 即二甲苯中产物以 R 构型为主， 而 环己烷中产物主要为 S 构型， 类似此种情况下反 应介质的改变而导致酶催化立体选择性的翻转现 象， 目前仍未见确切解释。图 1 不同有机溶剂对面包酵母催化不对称还原 EOPB 反应的影响 Fig. 1 Effect of different organic solvents on the reduction of EOPB by DB （ 50g?L － 1 DB， 20mmol?L － 1 EOPB， 50mL solvent， 30g?L － 1 H2 O， 30℃ ， 24h）第2 期 2. 2. 2石玉刚等： 面包酵母催化不对称还原 EOPB 反应中的溶剂效应149不同 log P 值有机溶剂处理过的 YADH 的 UV 及 FS 光谱特征 小分子与生物大分子作用前水性增强 逐 渐 增 加 （ 图 2 ） ； 波 长 为 250nm， = Δλ 60nm （ 图 3（ a） ） 与波长为 275nm， = 15nm （ 图 Δλ 3（ b） ） 的条件下扫描的同步荧光图谱， 与空白样品 荧光强度均有不同程度的增加； 这说明增大 比较， 溶剂 log P 值导致 YADH 表面的发色基团裸露程 度变大。后的吸收光谱有一定差异时， 可据此研究其分子 ［21， ］ 22 。 与空白样 （ A） 比较， YADH 间的相互作用 的紫外最大吸收峰位置无明显变化， 但吸收强度 随 log P 值的增大而增加， 发生增色效应； 336 nm 处预处理过的 YADH 的荧光强度随有机溶剂的疏Acontrol； Bdiethyl ether； Cbezene； Dtoluene； Ecyclohexane； F- xylene p图2 不同 log P 值有机溶剂预处理过的 YADH 的 UV 及 FS 发射图谱 Fig. 2 Change of ultraviolet and fluorescence spectrum of YADH caused by different organic solventsAcontrol； Bdiethyl ether； Cbezene； Dtoluene； Ecyclohexane； F- xylene p图3 Fig. 3 不同 log P 值有机溶剂预处理过的 YADH 的同步 FS 图谱 Change of synchronous fluorescence spectrum of YADH caused by differentorganic solvents Enzyme solution （ 0. 0020g?mL － 1 ，pH 8） （ temperature 30℃ ， pretreatment conditions： 50g?L － 1 DB， 25g?L － 1 H2 O， o C， 30 5h）2. 2. 3相同 log P 值有机溶剂处理过的 YADH 的 UV 及 FS 光谱特征 259nm 处经邻二甲苯 （ C） 、苯处理的样品荧光强度高。 酵母在环己烷和二甲 苯中催化反应的产物构型相反； 酵母在间二甲苯 与对二甲苯中酵母的催化特征相似， 但在邻二甲 苯中酵母催化活性及立体 选 择 性 均 较 前 两 者 高 （ 图 1） 。说明相同 log P 值不同分子结构的溶剂 介质能使得酶分子表面的裸露程度发生改变， 直 接导致酶与底物的结合程度发生改变， 最终表现 为酶催化行为的变化。 结合光谱学结果， 说明至 少在有机溶剂的 log P 值与其分子结构的协同作间二甲苯（ D） 、 对二甲苯（ E） 处理过的 YADH 的紫 外吸收强度较空白样品依次增大， 而环己烷处理 过的 YADH 紫外吸收强度介于间二甲苯与对二甲 苯之间； 样品的荧光强度均有不同程度增加 （ 图 4， 5 （ a） ，（ b） ） ， 中 经 间、 二 甲 苯 处 理 的 图 其 对 YADH 荧光光谱曲线较接近， 且明显较经邻二甲150化学研究与应用第 23 卷用下， 预处理阶段 Y A DH 发生某种变化（ 活性空间位置、 构象等） ， 致使酵母催化行为发生根本变化 。Acontrol； Bcyclohenxane； C- xylene； D- xylene； E- xylene omp图4 相同 log P 值有机溶剂处理过 YADH 的 UV 及 FS 发射图谱 Change of ultraviolet and fluorescence spectrum of YADH caused by identical log P solvents Fig. 4Acontrol； Bcyclohenxane； C- xylene； D- xylene； E- xylene omp图5 Fig. 5 相同 log P 值有机溶剂处理过 YADH 的同步 FS 图谱 Change of synchronous fluorescence spectrum of YADH caused byidentical log p solvents enzyme solution （ 0. 0020g?mL － 1 ，pH8） （ temperature 25g?L － 1 H2 O， 30℃ ， 5h） 30℃. pretreatment conditions： 50g?L － 1 DB，2. 3混合有机溶剂的影响 苯中酵母催化还原 EOPB 的反应立体选择性 较乙醚高， 但苯中 EOPB 转化率及 EHPB 产率却比 EHPB 产率较乙醚下降了 20% 。 因此， 乙醚低， 期 望通过两种溶剂复配作为反应介质实现提高反应 的立体选择性同时兼顾 EOPB 转化率及 EHPB 产 率。图表明随着体系中苯含量的增大， 产物的对 映体过量值不断增大， 这可能是苯抑制了酵母中［23 ］ 催化生 成 S 型 产 物 YADH 的 催 化 活 性 所 致 。 e. EHPB 产 乙醚与苯的体积比为 3 ∶2 时， e. （ R） 、图6 Fig. 6乙醚与苯复配体系对酵母催化还原反应的影响38. 率 和 EOPB 转 化 率 分 别 为 52. 81% ， 93% 和 68. 13% 。Effect of the mixing of ether and benzene on the reaction［ g L -1 ?DB， 052 g EOPB， 25 mL H2 O， 50 0. 1. 30℃ ， h， 24 V（ diethyl ether） + V（ benzen） = 50 mL］第2 期 参考文献：石玉刚等： 面包酵母催化不对称还原 EOPB 反应中的溶剂效应151［ Choi Y H，Choi H J，Kim D，et al. Asymmetric synthesis 1］ 311of （ s） - chloro- phenyl- propanol using saccharomyces J］ cerevisiae reductase with high enantioselectivity ［ . Appl． Microbiol． Biotechnol． ， 2010， 1） ： 18587（ 193. ［ Goldberg K，Schroer K，Lütz S，et al. Biocatalytic ketone 2］ reduction―a powerful tool for the production of chiral alcohols―part II： wholecell reductions［ . Appl. MicrobiJ］ 2007， 2） ： 24976（ 255. ol. Biotechnol． ， ［ Lacerda P S B，Ribeiro J B，Leite S G F，et al. Microbial 3］ enantioselective reduction of ethyl- oxo- phenyl2- 4butanoate ［ . Biochem． Eng． J． ， J］ 2006， 3） ： 29928（ 302. ［ Kaluzna I，Andrew A A，Bonilla M，et al. 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