您现在的位置：>>> 正文
血管内皮细胞粘附分子1/CD106ELISA试剂盒 ELISA试剂盒
血管内皮细胞粘附分子1/CD106ELISA试剂盒 elisa试剂盒检测应用血管内皮细胞粘附分子1/CD106ELISA试剂盒的产品介绍血管内皮细胞粘附分子1/CD106ELISA试剂盒由我司特价销售血管内皮细胞粘附分子1/CD106ELISA试剂盒。血管内皮细胞粘附分子1/CD106ELISA试剂盒血管内皮细胞粘附分子1/CD106ELISA试剂盒因为ELISA试剂盒有着准确性高、灵敏度高、特异性强的诸多优点，深受广大师生朋友的喜爱。实验类型ELISA试剂盒有一个共同特点，就是进行抗原捕获。一般捕获形式包括将抗原吸附到微孔板或者用微孔板上的抗体进行捕获。In-cell ELISA和酶联免疫斑点ELISPOT是两种特殊的类型，In-cell ELISA需要将微孔板中培养的细胞进行固定和通透化，然后再用抗体原位检测。ELISPOT有点像蛋白印迹Western blot，先在带膜的微孔板中培养细胞，然后在膜上检测细胞分泌的抗原形成斑点。我们还需要根据自身需要选择96孔板或是384孔板进行ELISA实验。血管内皮细胞粘附分子1/CD106ELISA试剂盒感谢各位对本公司的支持与认可，我们将再接再厉为您们提供优质的产品与服务。血管内皮细胞粘附分子1/CD106ELISA试剂盒外，还有更多相关实验产品，标准品，细胞株和实验技术服务等等前期后续服务。如果您对考虑购买的ELISA试剂盒还有任何疑问，都可以直接向我们咨询。为您服务是我们的荣幸。（编辑：tanxi）
关注本网官方微信 随时阅专业资讯
全年征稿 / 资讯合作
联系邮箱：
版权与免责声明
凡本网注明“来源：中国化工仪器网”的所有作品，版权均属于中国化工仪器网，转载请必须注明中国化工仪器网，，违反者本网将追究相关法律责任。
本网转载并注明自其它来源的作品，目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性，不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时，必须保留本网注明的作品来源，并自负版权等法律责任。
如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起一周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。
为进一步加强食品质量安全监管和提升产品质量安
近两年，在国内各大综艺、视觉触及的广告牌出现频率较高的一则广告语莫过于“拼多多、拼
中国科学院过程工程研究所前身是1958年成立的中国科学院化工冶金研究所。五十多年来，研
原子荧光光谱技术日益精进，行业也亟待更先进的标准保驾护航。日，由中国分 上传我的文档
 上传文档
 下载
 收藏
粉丝量：344
毕业于医学院校，在医院工作，有相对丰富的护理经验
 下载此文档
血管内皮细胞损伤及修复的研究进展
下载积分：1500
内容提示：血管内皮细胞损伤及修复的研究进展
文档格式：DOC|
浏览次数：222|
上传日期： 08:22:27|
文档星级：
全文阅读已结束，如果下载本文需要使用
 1500 积分
下载此文档
该用户还上传了这些文档
血管内皮细胞损伤及修复的研究进展
关注微信公众号USE OF CYTOKINE-SUPERANTIGEN FUSION PROTEIN FOR PREPARING MEDICAMENT AGAINST SOLID TUMOR
WIPO Patent Application WO/
The invention discloses the use of a cytokine-superantigen fusion protein for preparing a medicament against solid tumor, wherein the cytokine is an epidermal growth factor or a vascular endothelial cell growth factor, and the superantigen is the superantigen of staphylococcus aureus enterotoxin A.
Inventors:
SUN, Jialin (201 Apartment, No. 55 BuildingWuyi Road 519,Changning District, Shanghai 0, 200050, CN)
Application Number:
Publication Date:
09/09/2011
Filing Date:
11/18/2010
Export Citation:
SUN, Jialin (201 Apartment, No. 55 BuildingWuyi Road 519,Changning District, Shanghai 0, 200050, CN)
International Classes:
A61K39/085; A61K38/18; A61P35/00
View Patent Images:
&&&&&&PDF help
Foreign References:
CNACN1629194A
Other References:
ZHU HONGLI ET AL.: 'Cloning, prokaryotic expression and purification of VEGF-SEA genes' BIOTECHNOLOGY BULLETIN no. 2, April 2008, pages 181 - 187
LUO JINFENG ET AL.: 'Expression and purification of fusion protein EGF-SEA in E.coli' INDUSTRIAL MICROBIOLOGY vol. 38, no. 4, August 2008, pages 31 - 34
BIAN XIAOHE ET AL.: 'Cloning and expression of superantigen fusion genes VEGF-SEA' TIANJIN MEDICAL JOURNAL vol. 36, no. 10, October 2008, pages 783 - 785
Attorney, Agent or Firm:
BEI & OCEAN (Time Plaza Bld. A Ste. 603, West Anshan RoadNankai District, Tianjin 3, 300193, CN)
1 . 细胞因子 -超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用， 其特征是所述细胞因子为表皮 生长因子或血管内皮细胞生长因子， 所述超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素 A的超抗原。 2. 根据权利要求 1 所述的细胞因子 -超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用， 其特征 是所述细胞因子 -超抗原融合蛋白能够动员 τ淋巴细胞,并将所述 T淋巴细胞靶向性地定位 到实体肿瘤组织内的肿瘤细胞周围，所述 T淋巴细胞具有 CD4+或 CD8+特征以及能与 SEA 相互作用。
3. 根据权利要求 1所述的细胞因子 -超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用， 其特征 是所述细胞因子-超抗原融合蛋白能诱导实体肿瘤组织内的 T 淋巴细胞分泌细胞因子白细 胞介素 -2、 干扰素 -γ和肿瘤坏死因子 -α。
4. 根据权利要求 1所述的细胞因子 -超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用， 其特征 是所述细胞因子 -超抗原融合蛋白能够诱导肿瘤细胞表面上的凋亡蛋白 Fas的高表达。 5. 根据权利要求 1所述的细胞因子 -超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用， 其特征 是所述细胞因子 -超抗原融合蛋白能够诱导杀伤性 T淋巴细胞分泌穿孔素和颗粒酶 B。 6. 根据权利要求 1所述的细胞因子 -超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用， 其特征 是所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够抑制体内实体肿瘤的生长，导致肿瘤组织内大量肿瘤 细胞的死亡。
Description:
细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用 技术领域
本发明涉及一种融合蛋白的用途，特别是涉及一种细胞因子 -超抗原融合蛋白在制备抗 实体瘤药物的应用。 背景技术
表皮生长因子 （Epidermal growth factor, EGF) 和血管内皮细胞生长因子 （Vascular endothelial cell growth factor, VEGF)等的受体在各种肿瘤组织中大量表达， 例如在肠黏膜 肿瘤中的 EGF受体比正常组织高出 300倍 （Gastroenterology, 98, 961-967, 1990) 。 所以， 异常高表达的 EGF受体和 VEGF成为一个引人注目的癌治疗靶点。
表皮生长因子连接到一种毒素蛋白或 R A水解酶上可选择性杀伤高表达 EGF受体的 癌细胞 (Clin. Cancer Res., 11, 329-334, 2005; Protein Eng., 11, , 1998) ， 但这种方 式不是依靠免疫系统例如淋巴细胞等攻击肿瘤。
EGF基因在 80年代早期被发现了（Nucleic Acids Res., 10, , 1982; Nature, 303, 722-725, 1983 ) ， 它的成熟形式是 53氨基酸的多肽。
VEGF 基因是在 80 年代后期被发现 ( Science, 246, , 1989; Science, 246, , 1989) ， 由于 mR A的不同剪切， 它的成熟形式有多种形式， 长度可以是 189、 165以及 121氨基酸的多肽 （J. Biol. Chem., 266, , 1991 ) 。
细胞受体是一种位于细胞表面的蛋白， 接受外面信号后使得细胞内发生一系列信号传 导并由此引发基因调控等活动， 而癌细胞上常常有大量与生长因子有关的受体， 这些受体 就成为抗体的靶点。 如果抗体抗这些受体即与它们相互作用也就是与它们结合， 从而阻断 细胞因子与其受体的相互作用， 从而达到抑制肿瘤生长。
抗体可中和封闭癌细胞上的受体， 从而抑制配体介导的细胞增殖。 虽然抗体有抗体依 赖性细胞毒作用 （antibody dependent-cell mediated cytotoxicity) ， 但作用不显著。 通过连 接一个金黄色葡萄球菌肠毒素 A ( Staphylococcal-enterotoxin A , SEA ) 的超抗原 ( Superantigen) 到抗体上可产生加强的淋巴细胞介导的细胞毒。
SEA基因早在 80年代就报道了 (J. Biol. Chem., 262, , 1987; J. Bacteriol., 170, 34-41, 1988)。为了减轻 SEA的副作用，在它的第 227位置上引入了一个点突变（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94， , 1997) 。 为了减弱血清反应同时又保留 SEA的生物活性， 在 SEA中引入更多的点突变 (J. Mol. Biol" 333， 893-905 , 2003 ) 。
SEA不需要抗原提呈细胞的加工处理，而以完整的蛋白质形式直接与细胞膜上的 MHC II类分子结合形成复合物， 识别 T cell receptor (TCR)的 νβ片段， 激活比普通抗原多得多 的 Τ细胞（包括 CD4+， CD8+) ， 并释放大量细胞因子， 对靶细胞产生强而有力的细胞毒 作用。瑞典的一个小组的抗体超抗原融合蛋白对于 B16黑色素瘤的肺转移进行了很多研究 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, , 1995; Eur. Surg. Res., 35, 457-463, 2003 ) ， 但对 于抗实体瘤的作用如何仍然不清楚。
另外， 要使抗体成为药物， 就必须对于鼠源抗体进行人源化的基因工程改造。 由于抗 体药物的使用剂量很大， 常常需要数十毫克 /人 /次， 这就要求提高基因工程抗体的动物细 胞的表达水平以及发展大规模发酵技术。 所以抗体药物的研究开发的周期和投资成本是非 常巨大的。
癌细胞是由正常细胞转变而来的， 癌细胞的抗原是自身抗原， 所以癌细胞能够逃避免 疫系统的监视。 人们一直在寻找新的抗癌方法来提高癌症病人的免疫力， 特别是针对癌细 胞的特异性免疫力。 因此， 本领域迫切需要一种特别针对癌细胞的强有力的新的抗癌药物 用于抗肿瘤， 特别是抗实体肿瘤。 这种药物是区别于抗体的， 现在还没有报道。
中国专利申请号 .7 "—种可用以抗癌治疗的超抗原融合蛋白质及其生产 方法"公开了一种构建细胞因子和超抗原的融合蛋白的方法以及这种融合蛋白质在大肠杆 菌中表达和纯化的方法， 但并没有公开细胞因子和超抗原的融合蛋白抗实体瘤的生物活性 的数据。 发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种细胞因子 -超抗原融合蛋白在制备抗 实体瘤药物的应用。
本发明的技术方案概述如下：
细胞因子-超抗原融合蛋白在制备抗实体瘤药物的应用，所述细胞因子为表皮生长因子 或血管内皮细胞生长因子， 所述超抗原为金黄色葡萄球菌肠毒素 A的超抗原。
所述细胞因子 -超抗原融合蛋白能够动员 τ淋巴细胞,并将所述 T淋巴细胞靶向性地定 位到实体肿瘤组织内的肿瘤细胞周围， 所述 T淋巴细胞具有 CD4+或 CD8+特征以及能与 SEA相互作用。
所述细胞因子-超抗原融合蛋白能诱导实体肿瘤组织内的 T 淋巴细胞分泌细胞因子白 细胞介素 -2、 干扰素 -γ和肿瘤坏死因子 -α。
所述细胞因子 -超抗原融合蛋白能够诱导肿瘤细胞表面上的凋亡蛋白 Fas的高表达。 所述细胞因子 -超抗原融合蛋白能够诱导杀伤性 T淋巴细胞分泌穿孔素和颗粒酶 B。 所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够抑制体内实体肿瘤的生长，导致肿瘤组织内大量肿 瘤细胞的死亡。
本发明的优点：
细胞因子-超抗原融合蛋白实际上是代替现有技术的抗体的， 也具有靶向作用， 是区别 于抗体的新的可期待的药物。 实验证明细胞因子 -超抗原融合蛋白既分别与 EGF和 VEGF 的受体即 EGFR和 VEGFR相互作用， 又与 T细胞上的 TCR作用， 这样就将 T细胞靶向 性定位到大量表达 EGFR或 VEGFR的肿瘤细胞表面上， 由 T细胞分泌的细胞因子、 诱导 靶细胞产生 Fas和穿孔素和颗粒酶等导致肿瘤细胞凋亡。细胞因子-超抗原融合蛋白对于实 体肿瘤有着很明显的杀伤作用。 附图说明
图 1为只有一条带的高纯度的 VEGF-SEA融合蛋白的电泳图。 （图中， 1 : 纯化中的漂 洗液 2: 用洗脱液洗下来的 VEGF-SEA)
图 2 为高纯度的 SEA和 EGF-SEA电泳图。 （图中 1 : SEA; 2： EGF-SEA) 图 3表示 EGF-SEA和 VEGF-SEA融合蛋白抑制肿瘤生长情况。
图 4表示小鼠注射 EGF-SEA 、 VEGF-SEA SEA和生理盐水的解剖。 （图中： 4-1 为对照； 4-2为 SEA; 4-3为 EGF-SEA; 4-4为 VEGF-SEA)
图 5表示小鼠注射 EGF-SEA 、 VEGF-SEA SEA和生理盐水的解剖后的瘤重结果。 图 6 利用常规免疫组化检测到的 CD4+T 细胞。 （图中： 6-1 为 EGF-SEA; 6-2 为 VEGF-SEA; 6-3为 SEA; 6-4为对照)
图 7是图 6组织切片上的 CD4+T反应细胞个数计算。
图 8是利用常规免疫组化检测到的 CD8+T细胞。 （图中： 8-1 为 EGF-SEA; 8-2为 VEGF-SEA; 8-3为 SEA; 8-4为对照)
图 9是图 8组织切片上的 CD8+T反应细胞个数计算。
图 10是利用常规免疫组化检测到的与 SEA反应 T细胞。 （图中： 10-1为 EGF-SEA; 10-2为 VEGF-SEA; 10-3为 SEA; 10-4为对照）
图 11是图 10组织切片上的 SEA反应 T细胞个数计算。
图 12用 EGF-SEA和 VEGF-SEA蛋白溶液孵育肿瘤组织石蜡切片， 先用抗 SEA抗体 反应，然后用荧光素标记的抗小鼠的第 2抗体反应， 1 :50稀释，最后在荧光显微镜下观察。 (图中: 12-1为 EGF-SEA; 12-2为 VEGF-SEA; 12-3为 SEA; 12-4为对照）
图 13 肿瘤组织内 IL-2分泌 （图中： 13-1为 EGF-SEA; 13-2为 VEGF-SEA; 13-3为 SEA; 13-4为对照， 13-1、 13-2显示了肿瘤细胞之间有抗体反应的显色区域） 。
图 14肿瘤组织内 TNF-α分泌（图中： 14-1为 EGF-SEA; 14-2为 VEGF-SEA; 14-3为 SEA; 14-4为对照， 14-1、 14-2显示了肿瘤细胞之间有抗体反应的显色区域） 。
图 15肿瘤组织内 IFN-γ分泌 （图中： 15-1为 EGF-SEA; 15-2为 VEGF-SEA; 15-3为 SEA; 15-4为对照， 15-1、 15-2显示了肿瘤细胞之间有抗体反应的显色区域） 。
图 16根据图 13-15的免疫组化实验的石蜡切片上的抗体阳性反应以面积为单位来计算 细胞因子分泌的数量。
图 17禾 I」用 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)试齐 U盒（R & D Systems公司 ) 来检测肿瘤组织内的细胞因子分泌。
图 18肿瘤细胞上的 Fas表达分析， 用抗 Fas抗体 （Santa Cruz Biotechnolog公司） 来 检查肿瘤组织（图中： 18-1为 EGF-SEA; 18-2为 VEGF-SEA; 18-3为 SEA; 18-4为对照， 发现经过 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤 S180细胞表面上的大量 Fas表达，显示 抗体反应的大细胞周围有阴影部分就是 Fas蛋白） 。
图 19肿瘤细胞周围穿孔素分析， 用抗穿孔素抗体 （Santa Cruz Biotechnolog公司） 来 检查肿瘤组织（图中: 19-1为 EGF-SEA; 19-2为 VEGF-SEA; 19-3为 SEA; 19-4为对照， 发现经过 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤 S180细胞周围有大量穿孔素蛋白， 用 箭头表示的小条带部分就是累积的穿孔素蛋白群） 。
图 20肿瘤细胞周围颗粒酶分析， 用抗颗粒酶抗体（Abeam公司）来检查肿瘤组织（图 中： 20-1为 EGF-SEA; 20-2为 VEGF-SEA; 20-3为 SEA; 20-4为对照，发现经过 EGF-SEA 和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤 S180细胞周围有大量颗粒酶， 作为肿瘤细胞的大细胞表面 及其周围有阴影部分就是颗粒酶蛋白） 。
图 21肿瘤细胞 TU EL染色， (图中: 21-1为 EGF-SEA; 21-2为 VEGF-SEA; 21-3 为 SEA; 21-4为对照， 经过 TU EL检测发现 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤组 织内有大量 TU EL阳性 S180肿瘤细胞即死亡细胞， 显示阴影的细胞是死亡细胞） 。
图 22肿瘤细胞的 TUNEL阳性率， 根据 TUNEL染色的组织切片上显示阴影死亡细胞 的个数来计算死亡率， 肿瘤细胞死亡率达到 50-60%。 具体实施方式
本发明利用细胞因子 -超抗原融合蛋白质，其中的促进癌细胞生长的细胞因子可以将融 合蛋白质定位到癌细胞上， 而超抗原则在癌细胞周围引起抗癌的免疫反应， 即超抗原依赖 的细胞介导的细胞毒作用 （Superantigen-dependent-cellular-cytotoxicity, SDCC) 。 利用此 方法就可以将这种类型的融合蛋白质特异地定位到癌细胞并在癌细胞周围引起抗癌的细 胞毒免疫反应。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例 1 EGF-SEA表达载体的构建
委托 TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括可编码 53个氨基酸的 EGF和连接肽 和在 EGF前面再增加限制内切酶位点 BamHI和 EcoRI的几个碱基， 在编码连接肽的一部 分的核酸序列里包含了 Sail和 Hindlll的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入 T 载体并进行 DNA测序鉴定， 然后再用双酶切方法即用 BamHI和 Hindlll处理后， 把这个 片段插入 pET22b质粒上， 形成了 pET22b-EGF。第二步是合成带有 Asp (227)→Ala点突 变的 SEA核酸序列片段， 先插入 T载体并进行 DNA测序鉴定， 然后再用双酶切方法即用 Hindlll 禾 B Xhol 处理后， 把这片段插入 pET22b-EGF 质粒上， 这样就产生了表达载体 pET22b-EGF-SEA、 可表达 EGF-SEA融合蛋白 （见序列表 SEQ ID N0.2) 。
实施例 1 VEGF-SEA表达载体的构建
委托 TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括可编码 121个氨基酸的 VEGF和连接 肽和在 VEGF前面再增加限制内切酶位点 BamHI和 EcoRI的几个碱基， 在编码连接肽的 一部分的核酸序列里包含了 Sail和 Hindlll的限制内切酶位点。 将这个合成好的核酸片段 插入 T载体并进行 DNA测序鉴定， 然后再用双酶切方法即用 BamHI和 Hindlll处理后， 把这个片段插入 pET22b质粒上， 形成了 pET22b-VEGF。 第二步是利用实施例 1中已合成 好并插入 T载体的 SEA，用双酶切方法即用 Hindlll和 Xhol处理后，把它插入 pET22b-VEGF 质粒上， 这样就产生了表达载体 pET22b-VEGF-SEA、 可表达 VEGF-SEA融合蛋白 （见序 列表 SEQ ID NO.4) 。
实施例 3 各种蛋白的表达、 变性和复性以及纯化
将表达质粒 pET22b-EGF-SEA和 pET22b-VEGF-SEA以及作为对照用的 pET22b-SEA 分别用电穿孔法转入大肠杆菌 BL21(DE3)， 利用抗生素 Amp筛选阳性菌。 接下来各种蛋 白的表达、 变性和复性以及纯化的过程大致相同， 操作如下：
含有表达质粒的大肠杆菌 BL21(DE3)先进行大规模 37°C培养， 然后加入 IPTG使之浓 度达到 ImM并过夜 30°C培养， 从而诱导表达蛋白。 第 2天离心培养液和收集菌体， 用超 声波法破细胞壁， 离心收集包含体沉淀， 这里的蛋白是以包含体形式存在。 包含体蛋白用 6M尿素变性溶解，然后进行多阶段透析，透析溶液是逐步稀释的尿素例如 3M、 2M和 1M， 接下来是 0.5M尿素， 0.4M L-精氨酸， 375μΜ氧化型谷胱甘肽 GSSG， 1.875mM还原型 谷胱甘肽 GSH，透析后进行离心，所得上清液就是蛋白的复性溶液。用 H Bind Purification Kit试剂盒 （Novagen公司） 对于蛋白进行纯化， 先用 Binding Buffer冲洗凝胶柱， 同时也 在蛋白溶液里加入 Binding Buffer, 将蛋白样品上柱， 用 Wash Buffer漂洗， 然后用 Elute Buffer洗脱， 最后用蛋白质电泳进行鉴定， 这样就得到了只有一条带的高纯度的蛋白 （图 1和图 2) 。
实施例 4 两种细胞因子-超抗原融合蛋白抑制实体肿瘤的实验
首先选择雄性 ICR小鼠， 4-5周， 18-22g， 分成 4组， 每组 15只小鼠。 将 2xl06小鼠 肉瘤细胞 sarcoma 180 ( S180) 接种于小鼠的右侧腋下， 然后隔天往腹腔内注射 EGF-SEA 和 VEGF-SEA以及 SEA蛋白溶液 0.2ml (250 pmol)/只，而对照组注射等量生理盐水（0.9% NaCl)，9天后处死小鼠。观察小鼠肿瘤生长情况以及处死后肿瘤的重量。图 3表示 EGF-SEA 和 VEGF-SEA融合蛋白抑制肿瘤生长情况。 图 4表示小鼠注射 EGF-SEA、 VEGF-SEA SEA和生理盐水的解剖。 图 5表示小鼠注射 EGF-SEA 、 VEGF-SEA SEA和生理盐水的 解剖后的瘤重结果。 表明 EGF-SEA和 VEGF-SEA融合蛋白对于实体肿瘤有着非常明显的 抑制作用。
实施例 5 肿瘤组织内 T淋巴细胞的检测
两种细胞因子 -超抗原融合蛋白和 SEA蛋白处理以及对照组生理盐水的小鼠 S180肿瘤 组织切成小块， 用石蜡包埋制成石蜡切片， 然后进行免疫组织化学实验。 为了检测肿瘤组 织内的 CD4+和 CD8+T细胞， 使用 Santa Cruz Biotechnolog公司的抗 CD4+和 CD8+抗体， 然后用二抗以及 avidin-biotin-perxidase complex (Zymed公司) ， 最后用 diaminobenzi dine (DAB ) 显色。
为了检测与 SEA有反应性的 T细胞， 首先制备抗 SEA血清多抗， 将纯化后的 SEA蛋 白免疫 BALB/c 小鼠， 经过多次免疫获得效价超过 8000 的抗血清， 用 Hitrap protein G-Sepharose column (Amersham Biosciences公司） 纯化抗血清， 得到 IgG部分。 把这些肿 瘤组织的石蜡切片孵育于浓度为 0.8μ§/μ1的 SEA溶液里， 然后漂洗， 先用抗 SEA抗血清 IgG反应， 1 :50稀释， 漂洗除去抗体， 再用二抗反应。
图 6利用常规免疫组化检测到的 CD4+T细胞。 图 7是图 6组织切片上的 CD4+T反应 细胞个数计算。 图 8是利用常规免疫组化检测到的 CD8+T细胞。 图 9是图 8组织切片上的 CD8+T反应细胞个数计算。 图 10是利用常规免疫组化检测到的与 SEA反应 T细胞。 图 11 是图 10组织切片上的 SEA反应 T细胞个数计算。
经 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤组织内发现有大量 CD4+和 CD8+以及具有 SEA反应性的 T细胞 （图中 6-1、 6-2显示的小点为 T细胞） （图中 8-1、 8-2显示的小点 为 T细胞） （图中 10-1、 10-2显示的小点为 T细胞） ， 这说明在 EGF-SEA和 VEGF-SEA 诱导下， 肿瘤组织内充满了浸润性 （infiltrating) T细胞。 而 SEA处理小组的肿瘤内只有 少量的 CD4+和 CD8+以及具有 SEA反应性的 T细胞， 而生理盐水处理的对照组几乎没有 什么 T细胞。
SEA能与 T细胞反应说明 SEA是与 T细胞上的 TCR相结合。
实施例 6 两种细胞因子-超抗原融合蛋白对于肿瘤细胞的结合能力的检查
用 EGF-SEA和 VEGF-SEA蛋白溶液孵育肿瘤组织石蜡切片， 先用抗 SEA抗体反应， 然后用荧光素标记的抗小鼠的第 2抗体反应， 1 :50稀释，最后在荧光显微镜下观察（图 12 )。 经过 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤组织内， 可发现 S180肿瘤细胞 （大细胞） 禾 B T细胞 （小细胞） 都显示荧光， 表明 EGF-SEA或 VEGF-SEA可与 S180细胞上的 EGF 的受体 EGFR或 VEGF受体 VEGFR结合， 又与 T细胞上的 TCR结合。
只是 SEA处理和生理盐水的对照组的肿瘤内没有发现 T细胞 （小细胞） 。
实施例 7 肿瘤组织内细胞因子的检测
用 Santa Cruz Biotechnolog公司的抗 IL-2抗体、 抗 IFN-γ抗体以及抗 TNF-α抗体来检 测肿瘤组织内由 T 细胞分泌的细胞因子， 再用 R & D Systems 公司的 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 试剂盒来检测肿瘤内的细胞因子。 图 13 肿瘤组织内 IL-2 分泌（13-1、 13-2显示了肿瘤细胞之间有抗体反应的显色区域）。 图 14肿瘤组织内 TNF-a 分泌 （14-1、 14-2显示了肿瘤细胞之间有抗体反应的显色区域） 。 图 15肿瘤组织内 IFN-γ 分泌（15-1、 15-2显示了肿瘤细胞之间有抗体反应的显色区域） 。 图 16根据图 13-15的免 疫组化实验的石蜡切片上的抗体阳性反应以面积为单位来计算细胞因子分泌的数量。图 17 禾 ll用 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 试齐 Ll盒 (R & D Systems公司) 来检测 肿瘤组织内的细胞因子分泌。
结果表明 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤组织内有大量 IL-2、IFN-y和 TNF-a 细胞因子， 而 SEA处理和生理盐水的对照组的肿瘤内就很少细胞因子。
实施例 8 引起肿瘤细胞凋亡的因子的分析
肿瘤细胞上的 Fas表达分析， 用抗 Fas抗体 （Santa Cruz Biotechnolog公司）来检查肿 瘤组织， 发现经过 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤 S180细胞表面上的大量 Fas 表达 （图 18) ， 而 SEA组和对照组的肿瘤细胞则很少或几乎没有 Fas表达。 这可能是由 EGF-SEA和 VEGF-SEA所诱导的肿瘤组织内的 T 细胞所分泌的细胞因子例如 IFN-γ和 TNF-α可使得肿瘤细胞高表达 Fas， 而 T细胞上的 FasL可导致表达 Fas的肿瘤细胞凋亡， 这是杀伤 T细胞引起靶细胞凋亡的一个途径。 图 18肿瘤细胞上的 Fas表达分析， 用抗 Fas 抗体 （Santa Cruz Biotechnolog公司） 来检查肿瘤组织， 发现经过 EGF-SEA和 VEGF-SEA 注射的小鼠肿瘤 S180细胞表面上的大量 Fas表达，显示抗体反应的大细胞周围有阴影部分 就是 Fas蛋白。
肿瘤细胞周围穿孔素分析， 用抗穿孔素抗体（ Santa Cmz Biotechnolog公司）来检查肿 瘤组织， 发现经过 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤 S180细胞周围有大量穿孔素 蛋白 （图 19， 19-1为 EGF-SEA, 19-2为 VEGF-SEA, 用箭头表示的小条带部分就是累积 的穿孔素蛋白群） ， 而 SEA组和对照组的肿瘤细胞周围几乎没有穿孔素。 杀伤性 T淋巴 细胞可分泌穿孔素使得靶细胞的细胞膜形成小孔， 破坏靶细胞的渗透压的平衡， 导致靶细 胞死亡。
肿瘤细胞周围颗粒酶分析， 用抗颗粒酶抗体 （Abeam公司）来检查肿瘤组织， 发现经 过 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤 S180细胞周围有大量颗粒酶 （图 20) ， 图 20 肿瘤细胞周围颗粒酶分析， 用抗颗粒酶抗体 （Abeam 公司） 来检查肿瘤组织， 发现经过 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤 S180细胞周围有大量颗粒酶（作为肿瘤细胞的大 细胞表面及其周围有阴影部分就是颗粒酶蛋白） 。
而 SEA组和对照组的肿瘤细胞周围几乎没有颗粒酶。 颗粒酶是由杀伤性 T淋巴细胞 可分泌的一种蛋白水解酶，当穿孔素破坏靶细胞的细胞膜后，颗粒酶就可以进入靶细胞内， 从而降解靶细胞。
细胞死亡后， 染色体 DNA就会降解， 使用 TU EL试剂盒 （Roche Applied Science公 司） 可以检测细胞核内 DNA 降解， 从而可判断这些细胞已经死亡。 在 terminal deoxynucleotidyl transferase作用下， 带有荧光素标记的核苷酸就会掺入到凋亡细胞双链或 单链 DNA的 3-OH末端，然后用带有过氧化物酶标记的抗荧光素抗体进行反应。这样经过 TU EL检测发现 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤组织内有大量 TU EL阳性 S180 肿瘤细胞即死亡细胞。 图 21肿瘤细胞 TUNEL染色， 经过 TUNEL检测发现 EGF-SEA和 VEGF-SEA注射的小鼠肿瘤组织内有大量 TUNEL阳性 S180肿瘤细胞即死亡细胞（显示阴 影的细胞是死亡细胞） 。
而 SEA组和对照组的肿瘤组织内的死亡肿瘤细胞就很少。
图 22肿瘤细胞的 TUNEL阳性率， 根据 TUNEL染色的组织切片上显示阴影死亡细胞 的个数来计算死亡率， 肿瘤细胞死亡率达到 50-60%。
经 EGF-SEA和 VEGF-SEA给药的小鼠的 S180肿瘤生长受到很大抑制， 肿瘤组织内 发现有大量 CD4+和 CD8+以及与 SEA反应的 T淋巴细胞， 由这些肿瘤组织内的 T细胞分 泌大量细胞因子例如 IL-2、 IFN-γ以及 TNF-α, 其中 IFN-γ和 TNF-a会导致肿瘤细胞凋亡。 同时杀伤性 T细胞例如 CD8+T细胞分泌穿孔素和颗粒酶到肿瘤细胞周围， 可破坏肿瘤细 胞的细胞膜和降解肿瘤细胞。 通过 TUNEL检测， 肯定了 EGF-SEA和 VEGF-SEA组小鼠 的肿瘤组织有大量肿瘤细胞死亡。
上面一系列实施例表明 EGF-SEA禾 B VEGF-SEA既分别与 EGF禾 B VEGF 的受体即 EGFR和 VEGFR相互作用， 又与 T细胞上的 TCR作用， 这样就将 T细胞靶向性定位到大 量表达 EGFR或 VEGFR的肿瘤细胞表面上， 由 T细胞分泌的细胞因子、 诱导靶细胞产生 Fas和穿孔素和颗粒酶等导致肿瘤细胞凋亡。 特别要指出的是 EGF-SEA和 VEGF-SEA对 于实体肿瘤有着很明显的杀伤作用。
本发明选择了一个崭新的战略， 将超抗原连接到细胞因子上， 这样产生了新型的细胞 因子-超抗原融合蛋白质， 作为一个模型， 本发明使用表皮生长因子 EGF和血管内皮细胞 生长因子 VEGF分别与超抗原 SEA来构建这种新型的融合蛋白质。
在此虽然只选择超抗原 SEA，超抗原还可以选自：金黄色葡萄球菌肠毒素家族的 SEB、 SEC、 SED、 SEE,链球菌毒素的 SPE-A、 SPE-B、 SPE-C,休克综合征毒素（ Shock syndrome toxin) ， 病毒蛋白以及其氨基酸序列有 70%以上的相同性的自然和人为的变异体， 也能够 说明本发明的思想。 超抗原 SEA或其它超抗原的作用是激发机体内的免疫反应。
同样， 作为实验材料的表皮生长因子 EGF和血管内皮细胞生长因子 VEGF只是利用 它们癌细胞的定位作用， 采用与癌细胞紧密相关的其它细胞因子也能够说明本发明的思 这样的物质有各种趋化因子（Chemokine) 、 Ephrin家族、 血管生成素 （Angiopoietin, Ang) 、 血小板生成素 （Thrombopoietin, TPO)和血浆第 VII因子 （Factor VII) 、 尿激酶 型纤溶酶原激活物 （ Urokinase-type plasminogen activator , uPA ) 、 促胃液素释放肽 ( gastrin-releasing peptide , GRP)、生长激素释方夂激素 ( Growth hormone releasing hormone, GHRH) 、 促黑激素 a-MSH、 催乳激素 （Prolactin, PRL) 、 催乳激素释放激素 （Prolactin releasing hormone, PRLH) 、 生长激素 （Growth hormone, GH) 、 促卵泡激素 （Follicle stimulating hormone, FSH) 、 胎盘泌乳激素 （Placental lactogen, PL) 、 绒毛膜促性腺激 素 （Chorionic gonadotropin, CG) 和促肾上腺皮质激素释放激素 （Corticotropin releasing hormone, CRH) 、 生长抑素（Somatostatin, SST) 、 去唾液酸糖蛋白 （ Asialoglycoprotein, ASGP) 、 低密度脂蛋白 （Low density lipoprotein, LDL) 和转铁蛋白 （Transferrin, Tf) 等， 许多肿瘤组织都过量表达这些物质的受体， 从而趋化因子、 酶、 激素及其它蛋白等多 肽分子配体就可以像细胞因子那样与超抗原相连接形成融合蛋白质， 将超抗原定位到肿瘤 组织。
融合蛋白质也可以通过化学交联反应等化学反应手段分别将细胞因子和超抗原的多 肽片段进行连接， 例如共价键连接， 从而构建成融合蛋白质。
对于融合蛋白质可以进行化学修饰、 缺损融合蛋白质的一部分多肽片段以及将其它多 肽连接在这些蛋白质上等一系列的改造。
纯化后的融合蛋白质可以通过一系列蛋白质的变性和复性过程来完善其包括二硫键 在内的空间结构， 从而提高它的生物活性。
从更大的范围来看， 细胞因子与其癌细胞表面上过度表达的受体实际上是一种配体 (Ligand) 和受体之间相互作用的关系， 利用这种配体和受体的亲和力， 将超抗原定位到 肿瘤组织。 除了细胞因子外， 其它有与癌细胞过度表达受体相对应的多肽分子即配体也可 用于癌细胞的特异性定位。 除了上面所说的与癌细胞上的受体对应的配体外，从噬菌体展示 (phage display)等方法 筛选到的与癌细胞上的受体有亲和力并有拮抗作用的人工筛选多肽以及其它能够直接与 癌细胞表面相互作用的多肽分子都可以和超抗原形成融合蛋白质。
作为药物其剂型可以是乳化剂、脂质体、 分散剂、稳定剂等一起制成各种注射、 口服、 敷贴以及手术处理等药物的给药形式。
除了融合蛋白质本身可以作为药物外， 编码融合蛋白质的核苷酸片段或载体还可以作 为基因治疗形式来应用。
以上实施例和优选实施方式的描述属于对权利要求限定的本发明的示意性说明， 而不 是限制本发明。本发明的具体实施中， 所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够抑制小鼠体内实 体肿瘤的生长， 导致肿瘤组织内大量肿瘤细胞的死亡； 在本发明的启示下， 本领域的技术 人员也应该能够理解， 所述细胞因子-超抗原融合蛋白能够抑制体内实体肿瘤的生长， 并不 限于小鼠。 需要特别指出的是， 只要不脱离本发明的宗旨， 所有显而易见的改变以及具有 等价代换的相似发明， 均包含在本发明的保护范围之内。 序列说明
SEQ ID ΝΟ:1的核苷酸序列是编码 EGF-SEA融合蛋白；
SEQ ID NO:2是 EGF-SEA融合蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO:3的核苷酸序列是编码 VEGF-SEA融合蛋白；
SEQ ID NO:4是 VEGF-SEA融合蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO:5是连接肽的编码序列；
SEQ ID NO:6是连接肽的氨基酸序列。
FreePatentsOnline.com. All rights reserved.}