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α-互补与蓝白斑筛选机制的探究
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你可能喜欢简介/蓝白斑筛选
蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌方法。
原理/蓝白斑筛选
蓝白斑筛选蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：&是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
方面/蓝白斑筛选
蓝白斑筛选设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。
操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片段）与含lacz'的连接时，会插入进MCS（即靶基因），使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。
实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。
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贡献光荣榜【蓝白斑筛选】蓝白斑筛选问题!_牛宝宝文章网【蓝白斑筛选】蓝白斑筛选问题!专题：提醒：关注微信公众号『比比读小说网』，需自备手纸（你懂得）！蓝白斑筛选问题!蓝白斑筛选重组子时首先是氨苄筛选,其次是半乳糖苷酶活性筛选.感受态细胞中应该也有质粒,而且应该也有氨苄抗性标记,而且感受态如DH5α的半乳糖苷酶应该是失活的,那么它也不能降解X-gal,与重组子一样的啊,那么怎么保证筛选到的是重组子呢?难道感受态中没有质粒吗?如果没有制备感受态的步骤中怎么没有提到呢?晕死了!蓝白斑筛选问题!的参考答案在重组质粒表达的实验中,蓝白班筛选是要检测重组质粒是否表达,而氨苄的加入主要是为了防止培养过程中染菌.对于半乳糖苷酶活性筛选,首先重组质粒所选的质粒与野生型（感受态）不同,上面有多克隆位点,蛋白标签,和多对操纵子、启动子,其中就包括乳糖操纵子.当培养液中加入IPTG,IPTG可以和乳糖操纵子下游的的阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白从DNA上脱离,激活半乳糖苷酶的表达.因而重组质粒可以利用x-gal而感受态不能.这个是蓝白斑筛选的主要原理.结果中白斑表示重组质粒表达的菌体,蓝斑表示未表达.至于氨苄筛选,通常不会利用氨苄抗性进行筛选,因为感受态中是否有氨苄抗性基因很不确定,无法得到准确的结果.需自备纸巾的小色文请关注微信公众号比比读小说网！转载请保留本文连接：分享到：相关文章声明：《【蓝白斑筛选】蓝白斑筛选问题!》由“爱成瘾泪成殇”分享发布，如因用户分享而无意侵犯到您的合法权益，请联系我们删除。TA的分享}