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大家给分析下我这样的蛋白还得用什么方法再提纯一点？
最近做一个单域抗体的纯化，带有HIS标签，用NI柱纯过之后纯度还可以，但是老师让再提纯一下比较不同纯度下的抗体结合活性。不知道大家有什么建议，本人没有做过蛋白纯化，不知道下一步该怎么分析了，求助！！上样顺序为Marker,破碎后上样前、上样后缓冲液洗脱、20mM咪唑、100mM咪唑。最后这个孔道的蛋白是我要的，但是想除去上边的杂蛋白。
QQ截图13.png
之前50mM咪唑也洗过，有目的带出现没有100mM洗脱的多，这是第二次纯化，直接用100mM洗脱的。现在就想提高下纯度，想问下后边再过什么柱子应该怎样确定先什么柱子后什么柱子啊？
过完镍柱，后面自己看着做，过一些柱子，都没事；看把离子交换紧跟镍柱
菌体破碎和溶解过柱时都是用的50mM Tris-Hcl，500mMNacl,破碎的时候还加入了10mM咪唑。之前用过20，50，100，150，250,500mM咪唑洗脱过。下面给你附图。
我想问的是过完NI柱之后应该再过哪个柱子？离子交换柱吗？应该怎么准备？分子筛也要过吗？
你是做蛋白纯化的吗？可以直接交流吗？
第一次洗脱.png
我就是不知道下一步该过什么柱子？嘿嘿，新手做一头雾水。。。离子交换柱阴阳离子柱都要走一遍吗？
看你蛋白的PI,最好相差3左右和蛋白稳定综合考虑
蛋白的PI我是用的EXpaxy这个页面测得PI/pw是5.77/19.8KD& & 不知道这样准不准？还是有什么专门的分析蛋白的软件？
还好，大家都这样做；PH=8左右的tris buffer，用阴离子DEAE试试
为啥不给我金币啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊
好的。谢谢。我试试再跟你们聊:victory::victory:没有做过这方面的指定有很多问题麻烦你们。谢谢了！
额 下午给你回了 咋没了
看你的图纯度还可以的嘛
不过看情况你拉梯度也难分开上面那条带
我是做蛋白结构的 纯度一般要求90%以上
我们纯化流程一般是亲和柱，强离子交换，分子筛
前面朋友说的DEAE你可以试试，但是感觉那个粗分还行，不适用精细纯化，除非在同一种缓冲液中杂蛋白和你的目的蛋白电荷性质相反或差异非常大
我用的GE的monoQ效果很好，过完基本不用过分子筛都可以了，不过具体还要看你蛋白性质
分子筛只能分离分子量相差较大的蛋白，如果跟你蛋白分子量接近就不用考虑了反而会损失蛋白
我打算还是用100mm咪唑洗脱，后面过个阴离子交换柱看看情况
其实我的蛋白是个抗体，应该不能用强阴离子交换柱，我们实验室有DEAE纤维素-DE-52 羧甲基纤维素CM-23 32 52__Ion Exchange Cellulose- whatman这个填料，不知道你了解吗？
还有想问一下，过完镍柱后再过阴离子交换柱时样品需要怎样处理呢？刚买了超滤管，透析后再超滤下就浓缩了吧？上样的时候是直接上浓缩的呢还是得稀释到合适的浓度？
额&&是抗体？》》》》。。。。。。
亲&&抗体可以尝试proteinA 或者 ProteinG柱子& &专门纯化抗体的&&你可以先看看说明书
填料我不太清楚额&&我都是买的GE的预装柱
离子交换不用过超滤管浓缩，只要除盐，盐浓度降到50mM以下，一般就是电导不要超过5
过分子筛才需要超滤管浓缩
不过DEAE这种 我感觉过了效果不是很明显哦。。。
透析后用超滤管可以达到浓缩的目的。。。。不过要注意截留分子量，一般选用小于蛋白分子量1/3的超滤管
这是个单域抗体，构建的时候连的是his标签，不是完整的抗体分子，所以不能用纯化抗体的亲和标签纯化
我是手动上样&&不能机器 所以 只能自己摸索啊。。。
我先看一下过完阴离子交换柱的效果和纯度&&估计分子筛也得过吧:cry::cry:
还想问你一个问题就是我用50mm tris-hcl纯化的蛋白，想过阴离子交换柱，这个柱子再平衡的时候一般用20mm&&tris-hcl吧，这个时候我要把我的蛋白缓冲液换成20mm&&tris-hcl吗？还是直接可以用50mm tris-hcl 去平衡阴离子交换柱？
这样 。可以不用换&&pH对了就行。。。
有个网址，是EXPasy 你直接在百度上输就会有相关的网页版的序列分析和翻译的功能。你可以看一下。
我也是按着之前实验室的师姐做的论文里做的，先是看你的蛋白的相关性质，比如等电点啊，分子量啊，还有就是用什么缓冲液比较合适。不知道你是手动还是用仪器呢？流程的话就是先用水洗一下，再用缓冲液洗（这个缓冲液要和你样品储存夜一样），上样（可以上2-3遍），缓冲液洗，低浓度到高浓度咪唑洗，最后用高浓度咪唑洗干净，水洗干净后用20%乙醇保存。用的所有溶液都要过虑至少是0.45滤膜。
祝好运，这个还是比较简单的。有问题再交流。
你好，我现在还是在做这个蛋白的纯化，老师说要把nie柱放在最后，先过离子交换或者分子筛什么的，说是按着大规模产业化的要求来做，既要降低成本又要纯度高，所以问一下要是菌体破碎后的上清应该先考虑什么来确定过柱子的顺序呢？谢谢！
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1，大小球分析
对于每场比赛，博彩公司在开出让球盘的同时，也会对比赛的进球数开出盘口。传统意义上的进球数盘?的上盘为大球项目、下盘则为小球项目，因此，我们也可将其称之为大小球盘口。和让球盘一样，大小球除了盘口也会给出相应的水位。而两者除了形式相同外，虽然在分析原理方面存在巨大差异，但是其相通之处还是很多。就如在对大小球盘口进行分析时，也要基于基本面等综合因素，对盘口和水位的合理性做出判断。也要对庄家的造热方向作出分析等等。从这些来看，其原作原理都是一致的。　　大球盘口分析法是对进球数进行赛前分析的重点，该方法是由大小球属性、进球预期值分析、理论盘口分析（盘型定位）、盘口冷热分析这四个要素组成。同时，?四大要素也是对大小球盘口进行分析的基本程序和步骤。步骤一 大小球属性定位1、不同联赛的大小球属性　　国家之间、联赛之间的足球发展水平参差不齐，同时也因民族性、地域性、球迷的认同度等因素，导致了各个国家及联赛间的足球思维的各不相同。例如，意大利足球的侧重防守、法国足球的务实性、德国足球的坚韧性、巴西南美的技术花哨等等。整合下各大联赛的进球总体情况，可大致以归纳为以下三种类型。　　&　　大球联赛： 日职联、韩k、瑞超、瑞士超、挪超、芬超、德甲、匈甲、荷甲、荷乙、　　 巴西甲。　　 中性联赛： 英超、英冠、西甲、德乙、奥甲、丹超、阿甲、美职联。　　 小球联赛： 澳A联、法甲、法乙、意甲、意乙、罗甲、俄超、西乙。要特别说明的是，在赛季开始，以往小球特征明显的法甲、法乙、波兰甲、韩K等联赛，本赛季都频出大球比分。而一向进球数较为中性的西甲、德乙等联赛，却逐渐向小球联赛滑落，其大小球属性发生了变化。虽然庄家并未及时对这些联赛的大小球盘口做出调整，但是在操盘手法上其欺骗性更强、意图更为隐秘，望大家在实战中加以重视。　　 2、不同属性下的盘口特点　　 （1）大球联赛：　　此类联赛因为总体进球较多，大小球盘口往往开得很深，通常以2.5球盘为起点，而一些在两队交锋记录中进球较多的球队之间的比赛往往能开到3球以上的盘口。此类联赛一旦开出2.5盘的高水或者2/2.5浅盘，则要对小球可能性引起重视。例如：德甲、荷乙、巴西甲、瑞超等。　　 （2）小球联赛：　　这类联赛往往缺少令人叹服的进攻，打法上务实保守，总体上进球较少。小球性质的联赛盘口起点在2/2.5球较多，有的甚至开到2球或者1.5/2球。这类联赛一旦开到2.5球或以上的盘口，就要观察两队的交锋记录和近期攻防状态了。例如：法甲、法乙、西乙等联赛。　　 （3）中性联赛：　　由于总体进球数相对不稳定，因此盘口起点介于大小球联赛之间。这类联赛一旦开出2.5\3球，也要对两队历史因素和近期攻防变化引起关注，很可能就会一反常态的表演一场进球大战。例如：英超、英冠、德乙等。　　&　　步骤二 进球预期值　　&　　 该步骤要点是，根据对阵双方近期攻防状态，统计出主队在主场的进球数和失球数与客队在客场的进球数和失球数；然后再加上双方在距离本次比赛最近的2次交锋中的进球和失球数，最后得出?个两队进球+失球的平均值；这个平均值即为进球数的预期值。　　该方法的特点是能够反映比赛双方的近期进攻和防御能力，同时也将他们交锋进球记录的因素考虑进来，得出的平均值也是进行盘口定位的数据基础。具体计算公式如下：　　&　　 进球预期值=（两队交锋得失球数+最近几轮主客场得失球数）/统计场次要着重说明的是，这个得失球数的统计时效，距离本次比赛时间越近其准确性就越高。超过3个月甚至跨赛季的进球数不能作为衡量双方得失球状态的参考。　　 还要强调的是，进球预期值只是通过数据得出的一种技?性统计结果，能否形成最终的大众投注心理（市场预期值），则要结合更能体现两队真实状态的主客场大球率来共同构成。因此，这就要延伸出大小球市场预期值的概念，对此将在本部分第四章的最后部分做出详述。先就进球预期值，将同一赛事的两场比赛对比说明：佛罗伦萨5-2辛尼 （欧冠）　　 365初盘： 0.85 3球 1.05　　 365终盘： 0.825 3球 1.075&　　交锋记录：　　 日：辛尼VS佛罗伦萨 3-4　　近期得失球情况：　　主队：　　日：佛罗伦萨VS拿波里 0-1　　日： 佛罗伦萨VS卡坦尼亚 3-1　　客队：　　日：梅索科菲VS辛尼 1-4　　日：维迪奥顿VS辛尼 3-0根据上述统计，可以计算出主队近期得失球数为5球、客队为8球，经过除权得出双方近期的平均得失球数为13球÷4场=3.25球；双方交战平均数为7球。　　再除权(3.25+7)÷2=5.12球，得出双方的进球可能性在5个球以上，也就是说本场比赛的进球预期值应在5个球以上。里昂1-1利物浦（欧冠）&　　365初盘：1.00 2/2.5球 0.90　　365终盘：0.80 2/2.5球 1.10　　交锋记?：　　日：利物浦VS里昂 1-2　　近期得失球情况：　　主队：　　日： 里昂VS图卢兹 2-1　　日：里昂VS索肖 0-2　　客队：　　日：阿森纳VS利物浦 2-1　　日：富勒姆VS利物浦 3-1根据上述统计，主客队的平均得失球数结合交锋得失球数，得出双方得失球的可能性达3球；双方上轮欧冠的大小球盘口为2/2.5球，本轮再次开出与上轮相同的盘口，结合当前的得失球可能和上轮比分，显然这个盘开小了。　　在第一个案例中，我们?算出两队的进球可能高达5个球，显然实际盘口不可能按照5球开盘。在分析时我们说过，5个球只能说双方的进球加失球可能性存在5个球可能，或者说双方有能力共同制造5个进球。那么，实际盘口与预期值之间存在明显差异时，我们该如何判定这个实际盘口的合理性呢？　　再回到前面的两个案例中，所属意大利联赛的佛罗伦萨虽然其表现出较强的攻击欲望，但是归其属性尚属小球联赛范畴；匈甲球队客军辛尼却是重视进攻的大球型联赛属性；3球盘显然是庄家综合了两队各自联赛属性后开盘，大球与小球联赛球队之间交锋开出深盘应该属于实力盘的范畴。反?利物浦和里昂，分别归属于中性的英超联赛和小球居多的法甲联赛。如理解为庄家上轮开出的2/2.5盘符合双方实力盘的话，本轮开出的同类盘口，庄家更有意在突出双方中小型联赛性质的色彩，加之此盘下上轮打出大球，完全是一个游离于双方得失球实力的蛊惑盘。
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