单链抗体的研究进展及在肿瘤诊断_百度文库
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单链抗体的研究进展及在肿瘤诊断
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肝癌靶向单链抗体的筛选与亲和力测定
原发性肝癌世界上恶性程度极高，且预后极差的恶性肿瘤之一，其中90％以上为肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)，全球每年因HCC而死亡的患者超过100万。在我国肝癌目前已处于恶性肿瘤死亡率的第二位，每年至少有10万名新发现病人，和11万名肝癌病人死亡。尽管目前肝癌能够早期发现，且治疗方法有许多种，但治疗效果都十分有限，并未显著延长病人的生存期。大部分肝癌病人对化疗及放疗等治疗均不敏感，能手术根治的病人仅占15％。近年来，随着分子生物学和免疫学的不断发展，对癌基因的认识不断深入，以及转基因技术的日趋完善，肝癌基因治疗已显示出一定的前景。成为继手术、放疗和化疗之后第4种治疗模式。载体问题一直是肝癌基因治疗研究领域的核心技术之一。肝癌基因治疗常用的载体主要分两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体存在非导向性、有限的携带能力、生产和包装以及安全性的困扰等问题；近年来，非病毒载体以其安全性，低毒性，低免疫反应，靶向性及易于组装等优点被寄予厚望。其中，研究具有肝癌靶向特异性分子是需首要解决的问题，
去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是肝脏的一种重要且高效的内吞受体，主要分布于肝小叶门静脉周围肝细胞的窦面膜微绒毛间隙(MicrovilliClefts)，配体能否在微绒毛间有效渗透可能也是决定ASGPR介导的内吞的一个重要。肾脏的滤过的阈值是60-70kDa，单链抗体作为配体不经修饰很快从肾脏滤过。Wu等第一次利用ASGP作为配体，将DNA靶向性导入了ASGPR表达阳性的细胞(HepG2)细胞，但由于天然配体分子大、来源困难以及潜在的生物危险性，目前更倾向于通过生物工程手段获得靶向分子。至今，已证实有多种去唾液酸糖蛋白受体的配体可有效介导靶向性DNA转移至肝癌细胞。如半乳糖基多聚赖氨酸(Lac-PLL)、半乳糖基脂质体、半乳糖基聚乙烯亚胺、半乳糖化的胆固醇、醣脂类等。研究表明：scFv可以模拟配体的功能，将目的基因导入到靶细胞中，通过受体介导的内吞作用将目的基因导入靶细胞中。王骞等用抗TfR的单链抗体，将HSV-tk基因有效地导入肝癌细胞HepG2。
噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。构建容量大、特异性高、稳定性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心，也是其远大前景的基础。噬菌体抗体是指在其表面表达有Fab抗体或单链抗体(scFv)的噬菌体。用基因克隆技术将B细胞全套可变区基因克隆出来，组装到表达载体内并表达到噬菌体表面形成噬菌体抗体的群体，即为噬菌体抗体库。经特定抗原或细胞筛选后，便可获得特异性抗体。
本研究将利用抗体库技术，体外筛选、克隆、表达去唾液酸糖蛋白受体的单链抗体，并对单链抗体的筛选进行了改进，进一步提高筛选的阳性率，并对所获得的单链抗体进行亲和力测定，使有利于作为肝癌基因治疗的靶向分子，为其作为肝癌的基因治疗能在体内应用成为可能奠定基础。
从人源噬菌体抗体库(TomlinsonILibrary)中筛选与ASGPR特异性结合的单链抗体。采用捕获噬菌体ELISA法，从人源抗体库中筛选抗ASGPR的单链抗体，并与间接噬菌体ELISA法相比较。对单链抗体的筛选方法进行了改进，进一步提高筛选的阳性率，并对所获得的单克隆噬菌体进行可溶性表达、纯化后进行亲和力测定，对其抗原结合性质进行鉴定。使有利于作为肝癌基因治疗的靶向分子，为其作为肝癌的基因靶向能在体内应用奠定基础。
在原核表达系统中成功表达和纯化得到重组去唾液酸糖蛋白受体，该重组去唾液酸糖蛋白受体具有较强的免疫原性；以该重组去唾液酸糖蛋白受体作为抗原筛选TomlinsonI噬菌体抗体库，采用捕获噬菌体ELISA法筛选rASGPR特异性scFv可有效降低硫氧还蛋白标签(Trx·Tag)引起的假阳性，提高筛选阳性率，并可快速筛选出9株具有rCRDHl特异性的scFv；筛选得到的W1噬菌体感染E.coliHB2151后，可诱导表达低亲和力的可溶性scFv，该单链抗体具有中低亲和力，对肝癌的基因治疗具有潜在的应用价值。
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项目名称抗核仁素单链抗体-美登素偶联物靶向治疗肺癌的实验研究
负责人& 教授
批准金额33 万元
所属类别面上项目
近年来，靶向化疗受到了极大的关注，已成为肿瘤治疗的新趋势。我们前期研究发现肺癌细胞高表达膜型核仁素（Nucleolin），获得１株能抑制肺癌细胞增殖的抗核仁素单抗，克隆和表达了其单链抗体（scFv）。同时，膜型核仁素还高表达于肿瘤新生血管内皮细胞，提示膜型核仁素是肺癌治疗的一个潜在靶点。美登素（Maytansine）是从卫矛科植物美登木中发现的生物碱，是一种强烈的微管抑制剂，抗癌作用为阿霉素的150-300倍，可能是比较理想的靶向化疗弹头药物。在前期研究工作中，已设计和制备了用于卵巢癌靶向化疗的多聚叶酸-白蛋白-美登素偶联物。本项目在此基础上，拟将抗核仁素单链抗体（scFv）和美登素定向偶联，构建一种新型的肺癌靶向化疗药物，利用体外和动物实验验证其有效性，探讨其作用机理，以期能通过同时靶向杀伤肺癌细胞和肿瘤新生血管内皮细胞发挥更好的抗肿瘤作用，为肺癌靶向治疗药物的研发奠定基础。
结题摘要近年来，靶向化疗受到了极大的关注，已成为肿瘤治疗的新趋势。我们前期研究发现肺癌细胞高表达膜型核仁素（Nucleolin），获得１株能抑制肺癌细胞增殖的抗核仁素单抗，克隆和表达了其单链抗体（scFv）。同时，膜型核仁素还高表达于肿瘤新生血管内皮细胞，提示膜型核仁素是肺癌治疗的一个潜在靶点。美登素（Maytansine）是从卫矛科植物美登木中发现的生物碱，是一种强烈的微管抑制剂，抗癌作用为阿霉素的150-300倍，可能是比较理想的靶向化疗弹头药物。本项目利用大肠杆菌表达系统表达了抗抗核仁素单链抗体（scFv），优化了美登素衍生物的制备过程，并将Nucleolin scFv和美登素衍生物DM1定向偶联，构建了一种新型的肺癌靶向化疗药物Nucleolin scFv-DM1，利用体外和动物实验验证其有效性，探讨其作用机理。体外实验发现，Nucleolin scFv-DM1针对Nucleolin阳性细胞A549和HUVEC的IC50值（72h）分别为1.9 nmol/L和2.4nmol/L。体内实验发现，Nucleolin scFv-DM1高剂量组（5mg/Kg）治疗5次能使肿瘤全部消退，且能显著延长荷瘤鼠的生存期。以上结果表明，抗Nucleolin scFv-美登素能靶向到Nucleolin阳性的肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞，具有强烈的抗肿瘤作用，为肿瘤靶向化疗的进一步研究奠了基础。此外，我们在本研究的基础上还开展了基于DM1的肿瘤靶向化疗药物研发；开展了Nucleolin的功能研究，发现Nucleolin能与CCDC7相互作用，在肿瘤新生血管生成、侵袭转移过程中扮演重要作用。
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全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体的筛选、鉴定及其靶向性实验的研究.pdf57页
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硕+学位论文 中文摘要 ． 摘要 目的：从全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库中大规模筛选特异性
抗鼻咽癌噬菌体单链抗体 ScFv ，鉴定其特异性；构建、表达抗鼻
靶向特异性，为鼻咽癌的发病机制的研究和临床诊断以及导向治疗奠
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细胞HUVEC对初级抗体库进行正负淘洗富集以及ELISA筛选，选
择与鼻咽癌细胞反应强阳性而与HUVEC以及正常鼻咽细胞反应弱
阳性或者阴性的克隆进行免疫组化鉴定并测序。构建特异性阳性克隆 1 DE3 ，进行IPTG诱导表达，变
pET-25b + 并转化大肠杆菌BL2
外孵育在荧光显微镜下观察抗体HNSA033与鼻咽癌细胞的结合作
用。通过尾静脉将复性抗体HNSA033注射入荷鼻咽癌裸鼠体内观察
融合蛋白EGFP．HNSA033的体内靶向作用。 结果：用细胞对噬菌体抗体库进行三轮正负淘洗和富集后，从中
性反应的克隆，阳性率为42．O％。其中有3个克隆与CNE2呈强阳性
反应，而与NP69、HUVEC等人正常细胞系呈弱阳性或阴性反应。
根据相对亲和力指数，选择克隆HNSA033进行免疫细胞化学和免疫 硕十学位论文 中文摘要 组织化学染色，免疫细胞化学结果与ELISA～致；免疫组织化学结 果显示HNSA033与鼻咽癌组织和正常鼻咽组织阳性率分别为75．O％ 和13．3％，差别具有统计学意义 P 0．05 。成功构建的重组表达载 合蛋白EGFP．HNSA033分子量大小为63KD，表达形式分析显示融
合蛋白主要以包涵体的形式存在，用His．tag磁珠纯化试剂盒纯化
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照组小鼠的肿瘤部位未见荧光，显示融合蛋白EGFP．HNSA033具有 良好的靶向性。 结论：通过淘选富集、ELISA筛选从噬菌体单
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