|/|/|/|/|/|
//|//|//|//|//|
【求助】求教real time pcr的相对定量的标准曲线法
请问做内参和目的的标准曲线，要用哪组的样品（比如我有5组样品，分别是空白；处理一；处理二；处理三；处理四）？做标准曲线对real time的扩增效率有要求吗？相对定量是不用标准曲线的海天一见 wrote:相对定量是不用标准曲线的其实关于相对定量标准曲线的问题园子里面有很多类似的帖子,建议楼主先搜索一下,如果得不到满意的答案再发帖子!进行相对定量不做标准曲线,不计算扩增效率而直接应用DeltaDelt CT法是不科学的!想必楼主是想用DeltaDelt CT法了,这个方法应用的前提是目的基因与内参基因扩增效率一致,试问你如果不做标准曲线又如何知道目的基因和内参基因的扩增效率?也就更谈不上要扩增效率一致了.制作标准曲线,楼主可直接将样品稀释成一定的浓度梯度,直接进行扩增,最后一定要保证有5个浓度可以进行统计分析,而且至少重复一次.如果结果理想,目的基因和内参基因的扩增效率一致,那你就可以直接应用DeltaDelt CT法了,对另外几个处理进行定量的时候就没有必要再做标准曲线了.一般说来,目的基因和内参基因的扩增效率相差3个百分点都可以认为效率是一致的!不知我的回答对楼主有没有帮助?
您的位置： &&扫二维码下载作业帮
拍照搜题，秒出答案，一键查看所有搜题记录
下载作业帮安装包
扫二维码下载作业帮
拍照搜题，秒出答案，一键查看所有搜题记录
real-time PCR相对定量2 -△△CT法中用来判断扩增效率的标准曲线怎么制作?相对定量2 -△△CT法中建立标准曲线的目的是用来检测PCR的扩增效率的,那么这个标准曲线是如何制作的?我将未知浓度的cDNA 梯度稀释5-6个梯度之后进行扩增,Y轴是CT值 那X轴代表什么呢?仪器中2 -△△CT法不自动给出扩增效率啊 是要在相对定量的标准曲线法下面进行实验才能得知扩增效率吗?求指导啊
扫二维码下载作业帮
拍照搜题，秒出答案，一键查看所有搜题记录
你好,这个要在开始的时候选择“相对定量”模式,软件才会给出扩增效率
为您推荐：
其他类似问题
扩增效率E=10-1/斜率-1，其中斜率为标准曲线的斜率
我想知道的就是这个标准曲线怎么制作 ？什么作为X轴呢？
扫描下载二维码关注今日：17 | 主题：281968
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】关于real time标准曲线的制作
页码直达：
这个帖子发布于7年零324天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
近期想做real time PCR，是关于基因差异表达的，我只需要知道两个样本中目的基因的表达差异就够了，从现在了解的知识是，可以用双标准曲线法和2-ΔΔCt法，但是无论哪种方法都要做标准曲线，后者要验证目的基因和管家基因的扩增效率，只有扩增效率相差不大，才能用这个方法，可是做标准曲线需要制作标准品，好像是质粒，可是我从来没接触过这方面的知识，更别说制作了，我就想知道：可不可以用我的cDNA模版进行梯度稀释分别对目的基因和管家基因进行扩增来做标准曲线？如果不行，还有什么更简便的方法呢？望大家不吝赐教哈:D:D
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
可以用.我就是这么做的。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我的问题跟楼主一样，楼上的兄弟说可以直接用cＤＮＡ，那用10的倍数系列的范围是多少呢？谢谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
将cDNA进行梯度稀释10- 1、10- 2、10- 3、10- 4、10-5倍,以cDNA稀释倍数取对数值为横坐标,△Ct值为纵坐标作图.做出的回归曲线,曲线斜率绝对值为小于0.1,就说明目的基因和内参的扩增效率比较一致
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
是不是说也可以用gDNA 来做标准品，只要测浓度就可以了吗
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
是不是在用CDNA作为标准品是不需要测浓度的，反正是十倍十倍的稀释。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
可以用相对定量2-ΔΔCt这种办法。首先目的基因和管家基因分别同时做标准曲线，模板可以直接用cDNA倍数稀释来进行。4至5个点，2至3个复孔。再把待测样品同时跑上。ABI的机器可以直接把标准曲线画出，还把斜率，截距，扩增效率什么的都算出来。如果你的目的基因的点落在线上，那结果就可以用了。再用2-ΔΔ Ct计算就可以了。简单一点：如果你能保证RNA浓度测的准并且每一步加样都很准确。最后管家基因的所有样品的CT值都差不多大小（最大余最小差别小于1，越小越好），扩增曲线再平台期前基本是重合的，差不多就可以认为样品之间的扩增效率一致，你再直接计算2-ΔΔCt就可以了。不过这对新手很难，精确定量需要很好的闹心并细心。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园准中级站友
深切关注中：进一步问：1、cDNA样品倍比稀释作为标准曲线（我目前就这样做的)一般可以，但有时其他样品的扩增效率比选择做标准曲线的样品高，就超出了范围，大家怎么处理？2、很多次PCR试验中，不可能用同一个cDNA来做标准曲线样品（没那麽多），是否可以每次换不同的cDNA样品来制作标准曲线？我遇到的问题是同一组的动物，不同次做出来的结果有时差别很大。3、结果用2-ΔΔ Ct计算可以，我用标准曲线得到的相对浓度直接除以actin得到比值进行比较可否？谢谢啦，困惑很久。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园real time PCR 标准曲线制作_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
real time PCR 标准曲线制作
上传于|0|0|文档简介
&&real time PCR 标准曲线制作
(荧光定量PCR 标准曲线 制作)
阅读已结束，如果下载本文需要使用5下载券
想免费下载本文？
定制HR最喜欢的简历
下载文档到电脑，查找使用更方便
还剩1页未读，继续阅读
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢扫二维码下载作业帮
拍照搜题，秒出答案，一键查看所有搜题记录
下载作业帮安装包
扫二维码下载作业帮
拍照搜题，秒出答案，一键查看所有搜题记录
荧光定量PCR 标准曲线的制作 是不是可以软件自动生成的!
扫二维码下载作业帮
拍照搜题，秒出答案，一键查看所有搜题记录
是的啊!但是你要在一起上标注好哪个是标样以及重复,他就自动生成了
谢谢 请问具体怎样设置最后才会自动出现标准曲线啊？？？
每个机器不一样 我用的是biorad的，然后P上之前有一个面板显示96孔，你自己找找，一般在设置里面，然后选中所有做标样的孔，有一个选项，unknown，standard什么的，默认为unknown。然后你把它改成standard，选横方向(意思就是浓度梯度横向递增，竖排是重复)，就行了。
这个问题...前几天技术员来的时候我还专门问过呢，她的解释是绝对定量因为要求很高，所以当时给客户考虑的是每次实验都要做一次标准曲线（是每次PCR）。然后我问要是我觉得这次标准曲线ok，样品不好重跑一次能不能把上次protocol的标准曲线调出来直接设，她说所有的realtime的机器都没有这样的设置。就是说你每一次PCR都要跑一次标样！
我个人觉得不用，只要每个样品有一个标准曲线就行了，剩下的把第一次的标准曲线调出来用就ok。
标准曲线是包括你的样和actin的啊，不知道你说的所有的样一个标准曲线怎么用？ 共用actin 的标准曲线？
建议你的标样的模版DNA和actin都连在质粒上，从质粒扩标准曲线而不是回收产物，这样好一点
为您推荐：
其他类似问题
近几年配的RT-PCR的软件都可以自动生成，07年前的最好自己用excel处理，那时候的软件比较笨些。
把数据用excel生产呗
扫描下载二维码}