关于RT-PCR时模板CDNA加入量的问题(RT-PCR,模板) - PCR实验 - 生物秀
标题: 关于RT-PCR时模板CDNA加入量的问题(RT-PCR,模板)
摘要: [关于RT-PCR时模板CDNA加入量的问题(RT-PCR,模板)] 如题请问大家25UL体系加入的CDNA量是多少呢?是按UG还是UL呢?偶是按UG来算的,有什么区别吗? 关键词:[模板 RT-PCR]……
如题请问大家25UL体系加入的CDNA量是多少呢?是按UG还是UL呢?偶是按UG来算的,有什么区别吗?
回复:这个问题很大呀，你先看看标准的反映体系标准的PCR反应体系：　　　10×扩增缓冲液 　
10ul　　　4种dNTP混合物 　
各200umol/L　　　引物 　　　　 　
各10～100pmol　　　　模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　　 　 Taq DNA 　
2.5u　　　　Mg2+　　　　　　
1.5mmol/L　　　加双或三蒸水至 　
100ulC的量要根据你的扩增片断的大小，以及酶的灵敏度和提取的RNA的质量来算应该加的量，我们按ug来算是因为要测定RNA的浓度，及其OD26/280值是多少，1OD260/280＝33ug，比如：我的RNA提取后测的OD260/280＝1.1.则这个RNA的即是33×1.1=34.3ug，则这也是C的浓度，我们一般忽略则RT过程中丢失的量，所以CDNA的取舍是在你做了几次PCR后，观察电泳结果，得到最佳的反映体系：1，如果电泳条带模糊很弱，应该适当的加大模板的量2。如果出现拖带，也应该增加模板的量3。如果引物二聚体出现，可以适当的增加模板的量4。但是如果条带过浓，需要减量这些要摸条件的，慢慢来吧，祝你成功回复:我是提完RNA测一下OD,转录后CDNA再测一次,计算公式为A260*40*50(稀释倍数)/1000,一般大约为1UG/UL左右,对于CDNA有没有稀释一说呢.
另外有一个疑惑,是不是在达到平台期后,CDNA加入量的多少不影响亮度呢亮度
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grown stage 1.06-1.0848h2%MS7106grown stage 1.06
WTgrown stage 1.06RNA
AxygenAxygen EP1.5ml0.2mlDEPC-treated waterinvitrogen trizolinvitrogen DNase Iinvitrogen SuperScript& III Reverse
TranscriptaseUV2550
2 invitrogen
trizol RNA
0.1g1.5ml EP1.5ml EP1ml trizol5min200ul 15s3min12,000g15min
12,000g15min
500ul 10min12,000g10minRNA1ml 75%DEPC-treated water7,500g 5min
min80ul DEPC-treated water
RNA495 ul DEPC-treated water100OD260RNA = 40*
OD260*100RNAug/ulOD260/ OD280RNA
4 invitrogen DNase
EP1ug RNA1ul 10*DNase I Reaction buffer1ul DNase I1U/ulDEPCto 10 ul37°C 15min1 ul 25mM EDTA solution65°C 10min
5 invitrogen
SuperScript& III Reverse Transcriptase cDNA
EP8 ul RNA1 ul oligo d(T)Random hexamers1ul dNTP65°C 5min1min
10*RT buffer
25mM MgCl2
RNaseOUT(40U/ul)
SuperScriptIII RT(200U/ul)
MIXRNA/primer mixture
d(T)PCR50°C 50min85°C 5minRandom hexamersPCR25°C&
10min50°C 50min85°C 5min
PCR1 ul RNase H37°C 20min
cDNA -20°C
cDNAQ PCRcDNACt20~30
cDNA510505ul
primer express
2.0Real-time PCRSYBR Green
PCR80±2bpG/C%为40-60%Tm55°C18-23bp3'G/Cncbiblast
Mx3000pPCRdelta delta CtWTmRNA
cDNA10100100010,000100,0006Mx3000P&
Mx3000Pdissociation curve
WT95°C 30sec1 cycle95°C 5sec55°C 15sec72°C 10sec40 cycles95°C 1min55°C 30sec95°C 30sec1 cycle
delta delta
1 WT CtWTCtdelta Ct1CtCtdelta Ct2delta Ct1delta Ct2delta delta Ctpower2delta delta CtWT
Ct SD Treated
InddRnQ PCRCtWTWTXYSQRT(X)SQRT(Y)
Ct1delta Ct1SQRT(X)W1delta Ct1delta Ct2SQRT(Y)W2
Ct1delta Ct1SQRT(X)W3delta Ct1delta Ct2SQRT(Y)W4
power2W1M1power2W2M2power2W3M3power2W4M4
WT=M11= M2power2delta delta CtWT=1M3= power2delta delta CtM4
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【求助】请教大家反转录后PCR加多少模板cDNA的问题
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这个帖子发布于5年零268天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位高手请不吝赐教。。感激不尽。。。我做的RNA反转，现在提到的RNA浓度有1000ng/μl，然后用的TAKARA的反转试剂盒。是要做荧光定量的，所以想先做个普通的PCR看看引物的效果。。。请教大家用一个25μl的体系怎么样，怎么配比较好？。我是新手。。。完全没有概念。。。加cDNA模板的浓度要求是多少？谢谢大家⊙﹏⊙b。
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不要超过PCR体系的10%。逆转录的Buffer体系(主要是缓冲体系和镁离子)会影响后续PCR的Buffer 体系。另外，配制PCR体系，每种成分的加样量不要低于1ul，不然实验重复性会非常糟糕了；引物和PCR成分可以事先预混，cDNA可以稀释后再加。
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zcldf001 不要超过PCR体系的10%。逆转录的Buffer体系(主要是缓冲体系和镁离子)会影响后续PCR的Buffer 体系。另外，配制PCR体系，每种成分的加样量不要低于1ul，不然实验重复性会非常糟糕了；引物和PCR成分可以事先预混，cDNA可以稀释后再加。谢谢您的指点。。我是不是可以把除了 模板和taq酶之外的其他组分先配成MIX，然后分到每个管中？。。。我师姐说必须要按顺序一个一个的加。。。但是我觉得先混合成MIX没有区别啊
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如果用相同的引物，可以把模板之外的所有成分预混，最好所有PCR成分都预冷，预混后放冰上。在冰上操作是为了减少非特异性扩增，因为在低温时Taq酶的聚合活性较低。你师姐说的也有一定的道理：各成分绕PCR管加在壁上或者盖子上，最后离心混合，也是为了减少非特异性扩增。但是那样做的话加样误差太大，实验重复性不高。
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zcldf001 如果用相同的引物，可以把模板之外的所有成分预混，最好所有PCR成分都预冷，预混后放冰上。在冰上操作是为了减少非特异性扩增，因为在低温时Taq酶的聚合活性较低。你师姐说的也有一定的道理：各成分绕PCR管加在壁上或者盖子上，最后离心混合，也是为了减少非特异性扩增。但是那样做的话加样误差太大，实验重复性不高。谢谢你的指点。那混合后能不能涡旋一下？我听有人说有酶的都不能涡旋。。。但是我们一直都是涡旋一下再离心。。
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Taq 和pfu之类的酶都很强悍的，涡旋一下不会有影响的
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建议不要把引物和buffer还有酶预混，酶在低温也是有活性的，容易形成引物二聚体，而且万一你的引物设计的有问题，那你混好的东西就全浪费了。1000ng太高了，可以稀释成100ng/ul，然后加1ul就够了，甚至有人告诉我她用30ng也能扩出来，不过我一直用100ng
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cachita 建议不要把引物和buffer还有酶预混，酶在低温也是有活性的，容易形成引物二聚体，而且万一你的引物设计的有问题，那你混好的东西就全浪费了。1000ng太高了，可以稀释成100ng/ul，然后加1ul就够了，甚至有人告诉我她用30ng也能扩出来，不过我一直用100ng那么除了酶、模板之外其他的成分（buffer,mg,dNTP,水）先混起来做个Mix应该没有问题。对吧。。
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jessiezhc 那么除了酶、模板之外其他的成分（buffer,mg,dNTP,水）先混起来做个Mix应该没有问题。对吧。。恩，不过一定要按比例混匀，每次拿出来P的时候也最好涡旋一下
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cachita 恩，不过一定要按比例混匀，每次拿出来P的时候也最好涡旋一下 你好，你一直用的100ng/ul 是在做普通PCR时的cDNA的用量吗？ 谢谢
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你好，我现在也正在做普通PCR，想检测在细胞中一种基因是否存在，我提了RNA后逆转录cDNA ,40ul 体系的，RNA我加了4000ng。在做普通PCR时，cDNA加入多少量合适？ 多了是否会有影响？
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RT-PCR和Q-PCR；1、细菌总RNA反转录（RT-PCR）；1.在冰上融化RNA模板；2.根据表2-2，在冰上准备基因组DNA消除反应；注意:如果设置多个反应,准备一个主要的混合gDN；注意:这份成分表适用的RNA量是10pg至1μg；表2-2.基因组DNA消除反应成分；Tabel2-2GenomicDNAelimin；成分；gDNAWipeoutBu
RT-PCR和Q-PCR
1、细菌总RNA反转录（RT-PCR）
1.在冰上融化RNA模板。在室温(15-25℃)下解冻gDNAWipeoutBuffer,Quantiscript逆转录酶,QuantiscriptRTBuffer,RTPrimerMix,RNase-freewater。将每份溶液震荡混合于管中。离心机短暂离心并收集管中残余液体,然后放置于冰上。
2.根据表2-2，在冰上准备基因组DNA消除反应。混合。
注意:如果设置多个反应,准备一个主要的混合gDNAWipeoutBuffer和RNase-freewater体积大于10%,所需反应的总数。适当分配主要混合液于几个管,然后向单管中加入RNA样本。
注意:这份成分表适用的RNA量是10pg至1μg。如果使用&1μg的RNA,则反应规模成线性增长。例如,如果使用2μgRNA，则每个成分变成双倍，最后总体积成28μl。
表2-2.基因组DNA消除反应成分
Tabel2-2GenomicDNAeliminationreactioncomponents
gDNAWipeoutBuffer模板的RNA（最高用量为1μg）RNase-freewater总反应体积
体积/反应7×2μl适量(5μl)适量(7μl)14μl
*此数量包含所有RNA,包括任何rRNA,信使核糖核酸、病毒RNA,和载体RNA,无论使用的
引物、cDNA分析。
3.在42℃孵化2分钟,然后立即放置于冰上。
注意:不要在42℃培养超过10分钟
4.根据表2-2准备反转录混合液（thereverse-transcriptionmastermix）于冰上。混匀,然后保持在冰上。反转录混合液包含所有合成第一条cDNA所需的成分，但除了模板RNA。
注意:如果设置多个反应,准备主混合10%的体积大于所需反应的总数。分配适当的体积成单个管。
注意:如果使用&1μg的RNA,则反应规模成线性增长。例如,如果使用2μgRNA，则每个成分变成双倍，最后总体积成40μl。
表2-3.Reverse-transcripition反应成分
Tabel2-3.Reverse-transcripitionreactioncomponents
成分体积/反应
Reverse-transcriptionmastermix，1μlQuantiscriptReverseTranscriptaseQuantiscriptRTBuffer,5x
RTPrimerMix
模版RNA,Entiregenomiceliminationreaction终反应体积
DNA14μl(被添加在步骤5)
*还含有RNA酶抑制剂。①包括Mg2+和dNTPs.
②如果RTPrimerMix用于逆转录，为了方便,以1:4比例预混合RTPrimerMix和5xQuantiscriptRTBuffer。本预混料储存在-20℃时是稳定的。每20μl反应体系使用5μl预混料。
5.从步骤3添加模板RNA(14μl)到每个管，其中包含反转录混合液。混匀,然后放置在冰上。
6.在42℃孵育15分钟。
注意:在一些罕见的情况下(如果RT-PCR产品超过200个bp或者分析的RNA具有高度的二级结构),提高孵化时间至30min可能会增加cDNA产率。
7.在95℃保温3分钟，使Quantiscript逆转录酶的失活。
8.使reverse-transcription反应在冰上进行,直接进行实时PCR。若要长期储存,储存reverse-transcription反应应在-20℃。
注意:关于进行real-timePCR反转录操作后的详细信息,请参考AppendixCoftheQuantiTectReverseTranscriptionHandbook。适当控制的详细信息,请参阅AppendixD.进行real-timePCR我们建议使用Rotor-GeneKit,QuantiFastKit,或者QuantiTectKit。
9.为了检验反转录的得到的cDNA是否可以在接下来实验中使用，可以通过普通PCR检测cDNA质量。
QuantiFastSYBRGreenPCRKit为两步循环方案，分别为95℃的变性阶段和60℃的联合退火/延伸阶段。该方案对Tm值在60℃以下的引物有效。为了使SYBRGreen发挥高效作用，目的序列应当在60-200bp之间。该PCR过程必须以95℃作为第一步的起始孵育反应，以活化HotStarTaqPlusDNAPolymerase.对于96孔板，我们建议使用25μl的体系。以在2xQuantiFastSYBRGreenPCRMasterMix提供的Mg浓度为起始浓度若使用QuantiTectPrimerAssays，反应的终浓度为1x。并且，遵照表二中的循环方案。若使用iCycleriQ,iQ5或者MyiQ，合适的反应条件必须在每个实验开始前摸索清楚，这样可以弥补因加样吹打不均匀而造成的缺陷。步骤
1.溶解2xQuantiFastSYBRGreenPCRMasterMix，模版DNA，cDNA引物，RNase-freewater。将每个反应体系混匀。
2.按照表2-4准备好反应混合液。因为反应的起始是高温，所以并不需要在冰上进行操作或者在设计RT循环冰浴。
注意：我们强烈建议以2xQuantiFastSYBRGreenPCRMasterMix提供的Mg2+浓度为起始浓度。
将每个反应充分混匀，并在PCR管中分别添加合适体积反应。
表2-496孔板反应体系
Tabel2-4The96holeplatereactionsystem
2xQuantiFastSYBRGreenPCRMasterMix12.5μl
PrimerA*PrimerB*
模版DNA或者cDNA(第四步添加)
适量适量适量
≤100ng/反应
RNase-freewater反应终体积
3.添加模版DNA或者cDNA（≤100ng/反应）在每个单独的含有反应试剂的
对于两步RT-PCR，cDNA的添加体积（从未经纯化的RT反应中）不应超过PCR终体积的10%。
4.通过表2-5中的计划纲要，计划你的RT循环。数据的收集应该在联合退火延伸阶段进行。
5.将PCR管放在RT循环中，开始这个循环程序。
表2-5RT循环条件
Tabel2-5TheRTCyclingconditions
步骤PCR初始活化
最高值/快速模式
加热以活化HotStarTaqPlusDNAPolymerase
两步循环变性
最高值/快速模式最高值/快速模式
收集处理荧光数据
联合退火/延1min伸循环数目
循环数目参照模版DNA数目
6、进行熔解曲线曲线分析以验证PCR产物的特一性和同一性。熔解曲线分析是在RT循环程序中自带的软件，请遵照供应商提供的说明书进行。
7、琼脂糖电泳检测PCR产物的特一性。
3、数据处理
萘诱导处理后的赤红球菌RHD基因的表达数据经AppliedBiosystems7500软件呈现后采用ΔΔCT方法计算。
起始模板的相对含量比为
（1为检测基因，2为内参因子）。
不同样品间检测基因的相对表达量差异，即
（1为检测样品；2为对照样品），所得
的比值即为检测基因在不同样品间的表达量差异。
包含各类专业文献、各类资格考试、中学教育、应用写作文书、高等教育、行业资料、生活休闲娱乐、文学作品欣赏、外语学习资料、RT-PCR和Q-PCR及数据处理83等内容。　
　PCR)或者 RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。...由于 RNA 酶广 泛存在而稳定,可耐受多种处理而不...研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有... 　和添加剂,确定循环参数及制备高质量的模板等)以获得最佳的 RT-PCR 和 PCR。 ...对于多数 RT-PCR 反应, RNaseH 处理是可选的, 因为 95℃保温的 PCR 变性... 　RT-PCR的实验原理与操作步骤_基础医学_医药卫生_专业资料。提取组织或细胞中的总...5. 防止 DNA 的污染:采用 DNA 酶处理 RNA 样品,在可能的情况下,将 PCR ... 　Q) ** 探针完整,R 所发射的荧光能量被 Q 基团吸收 ,无荧光, R 与 Q ...PCR 每循环一次就收集 一个数据,建立实时扩 Real-time PCR 与 RT-PCR 是... 　越来越多的 研究文章中涉及 RT-PCR 的实验, 也基本上被 real-time qPCR 所...实验材料分为对照组(CON)和处理组(TRT)。 组内要有生物重复,可以数据分析此... 　写作“定量 PCR”(quantitative PCR)或者 RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)...PCR 则无需电泳 可以实时监测整个 PCR 的全程 并且由给出的 Ct 值及 ... 　qPCR与RT-PCR_生物学_自然科学_专业资料。虽然 Real-time PCR(实时荧光定量 PCR)和 Reverse transcription PCR(反转录 PCR)看 起来都可以缩写为 RT-PCR,但是,... 　pcr)或者 rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。...值及 standard curve 来判断 gene 拷贝 数的高低。...“平台”问题,基于 pcr 产物量进行分析所 得数据的... 　自己总结:透彻易懂PCR+RT-PCR原理_基础医学_医药卫生...PCR 扩 增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及...(quantitative PCR)或者 RTQ-PCR(real-time ...后使用快捷导航没有帐号？
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一步式 RT-PCR Mix 1mL说明书合成建文库用的 1st-strand cDNA:1. 按下表配制 RT 反应体系: RNA 模板 poly(A) mRNA 1 ug 或专一的 RNA 0.5-1 ug注意：RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。 引物 Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL 或随机引物(0.2 ug/uL) 1 uL 或 RNA 模板专一性引物 100 pmol 注意：随机引物于 RNA 模板的比例跟 cDNA 合成的平均长度成反比。 RNase-free 水 补水到 13 uL 2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。3. 再加入 5 uL RT Buffer（含 dNTP）。4. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保 温 5 分钟。如果使用随机引物，则改成 25℃ 5 分钟）。5. 加入 2 uL MMLV 逆转录酶（含 RI），反应终体积为 20uL。6. 42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟，然 后再转移到 42℃保温 60 分钟）。此步为 RT 反应。7. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以用于 第二链 cDNA 的合成或放置在-20℃长期保存。一步式 RT-PCR Mix 1mL说明书按下表配制 RT 反应体系:对照 RNA 模板(0.5 ug/uL) 2 uL引物Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL或随机引物(0.2 ug/uL) 1 uL或对照专用引物 2 uLRNase-free 水 补水到 13 uL2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。3. 再加入 5 uL RT Buffer（含标记 dNTP，本试剂不提供）。4. 37℃保温 5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是 25℃。5. 加入 2 uL MMLV 逆转录酶（含 RI），反应终体积为 20uL。6. 42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟，然后再转移到 42℃保温 60 分钟）。7. 加 1uL 0.5M EDTA，放置在冰上待用。8. 电泳检测。合成的 cDNA 的量一般有加入 RNA 总量的 50%以上，电泳一般能出现 1.1Kb 的片段（如果使用随机引物，将出现多个小片段）。一步式 RT-PCR Mix 1mL说明书产品介绍：产品及特点:本试剂盒提供合成 cDNA 第一链所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏 鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLV RT）高效合成 mRNA 的全长 cDNA 拷贝。1. 使用突变的反转录酶，内源 RNase H 活性低。2. 最长可合成 13 Kb 的 cDNA。3. 可以使用 oligo-dT、随机引物和 RNA 专一性引物三种引物（前两种本试剂盒提 供）。4. 总 RNA、poly(A)+RNA 或特殊 RNA 均可作为模板。5. 可用于 cDNA 文库构建、RT-PCR、探针标记等。C18H14N2Na2O8S2=496.42〖级别〗：AR〖含量〗：&85.0%&max：497～501nm(0.02 mol/L醋酸铵溶液)干燥减量、〖氯化物〗及〖硫酸盐〗总量：&0.2 %水中不溶物：&0.2 %〖砷〗：&0.0001%〖铅〗：&0.001%〖重金属〗(以Pb计)：&0.002%〖〖性状〗(以下信息仅供参考)〗：橙色或红色至紫红色粉末。〖用途〗：本品仅供科研，不得用于其它〖用途〗一步式 RT-PCR Mix 1mL说明书菌落 PCR 试剂盒 2.0&& &内毒素清除专用亲和介质微量核酸沉淀剂&& &Protein G 琼脂糖克必隆常态转化液&& &DEAE 交换介质细菌 RNAout&& &CM 交换介质细菌 RNAout&& &Q 交换介质克必隆 B 载体&& &SP 交换介质RNase-free CTAB 溶液 ,20%&& &苯基介质非酶 RNA 清除剂 1.0&& &丁基介质RNA &DEPC ( 焦碳酸二乙酯 )&& &丁基硫介质Taq DNA 聚合酶&& &天净沙甲基化 PCR 2.0 试剂盒Taq DNA 聚合酶&& &Phusion DNA 聚合酶Pfu DNA 聚合酶&& &E.coli DNA 聚合酶 &IdNTP 溶液，2.5mM&& &磁珠动物 DNAout&& &细菌蛋白酶抑
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