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PCR不必“摸条件”
PCR不必“摸条件”
来源：互联网
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PCR是分子生物学科研人员必做的实验，为了扩增目的基因，经常要对PCR的体系进行“摸条件”，特别是一些GC含量高的目的基因或者DNA纯度不高的样本! “摸条件”成为PCR实验最费时费力的工作！虽然市场上有很多PCR的MasterMix试剂，将酶、dNTP、反应缓冲液混合在一起，很方便客户的使用，但仅仅是简单的混合，极少公司对MIX的应用范围进行广泛的实验和优化，只能做一些不复杂的PCR。
百泰克通过长时间、无数次的实验优化，终于推出了适用范围广、稳定性良好的PCRMIX，是目前最“傻瓜”的PCR反应体系之一，不论是质粒、菌液、CDNA、基因组DNA、或者是直接裂解的粗提物，GC含量高达75%的模板，都能轻松扩增，不需要费力的“摸条件”！
本产品包含酶、dNTP、特殊稳定剂和优化的反应缓冲液，浓度为2x。DNA扩增时，只需加入模板，引物和水，使MasterMix溶液的浓度为1×即可进行反应。具有快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。进行PCR扩增可以减少操作时间，避免因多步操作带来的污染，特别适宜高通量筛选基因的扩增 ,Taq PCR MasterMix扩增产物可用于T/A克隆。本产品加入特殊稳定剂，37 ℃温度下48 h仍然保持95%以上的扩增效率．储存条件： -20 ℃一年有效，多次冻融不会影响活性，经常使用可放置于4 ℃。
本品为适应大部分PCR反应需要，Taq 酶量是按照PCR反应酶量上限所加，如出现PCR反应非特异性扩增明显或者背景过高，可将Taq PCR MasterMix反应液适当稀释后使用，可改善PCR扩增效果。
PCR反应液：
2× MasterMix
genomic DNA
灭菌蒸馏水至
PCR扩增实例：
一 plasmid DNA扩增：
1．提取的质粒DNA扩增
以pUC19质粒为模板扩增100，250，500， bp片段，以pBS质粒为模板扩增1500 bp片段。
模板：pUC19质粒30 ng/50 μL or pBS质粒30 ng/50 μL
PCR扩增程序：
2．质粒菌液直接扩增：
以pUC19菌液为模板扩增100，250，500，750，1000 bp片段，以pBS菌液为模板扩增1500 bp片段。
模板：菌液OD600=0.8时2 μL /50 μL
PCR扩增程序：同上a扩增程序同。
结果：Bioteke 2×power Taq PCR MasterMix试剂对于质粒或菌液均可高效率的扩增。取扩增产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析可见明亮条带。
二．genomic DNA扩增
1．大肠杆菌DNA扩增
模板：大肠杆菌DNA 50 ng/50 μL
PCR扩增程序：
2．高GC含量的片段扩增
a．人类基因组扩增（GC含量&60%）
模板：人类基因组 100 ng/50 μL
PrimerF：5′-GGGAGGGGACCGGGGAACAGAG-3′
PrimerR： 5′-GAACAGTCCGTCACTTCACGTG-3′
PCR扩增程序：
b．菌Streptomyces phaeochromo gene的片段扩增（GC含量&70%）
提取菌Streptomyces phaeochromo gene进行PCR扩增
模板：菌Streptomyces phaeochromo gene 100 ng/50 μL
Primer：71%GCPrimerF：5’-CCACCGGCCGCAGAGCAC-3’
71%GCPrimerR：5’-AGACGAGTCCCTTGGTTGGTAGC-3’
74.3%GCPrimerF：5’-CTCATCGTCGGCGCCGTCCTGGTC-3’
74.3%GCPrimerR：5’-CGGTCGGCTCGCTCCTGCTCTTCC-3’
PCR扩增程序：
结果：可见Bioteke 2×power Taq PCR MasterMix试剂对于原核或真核生物DNA均可高效。相较于同类的taq mix的扩增效率更高，且对于高GC含量也可得到很好的扩增。取扩增产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳如图可见明亮条带。
三 cDNA扩增
人类胎盘提取的总RNA反转录的cDNA扩增1.2 kbp片段
模板：人类胎盘提取的总RNA反转录的cDNA 200 ng/50 μL
PrimerF：5’-ATGGGCCTGGACATACAGAGCCTGGACA-3’
PrimerR：5’-ATTCGGAGATGACCCTCAGGGATGGCTT-3’
PCR扩增程序：
结果：取扩增产物10 μL用1%琼脂糖凝胶电泳可见清晰条带。
四 粗提液扩增
1. 人类头发粗提液扩增
对人类头发及血液等进行扩增时，通常的做法是将头发中的DNA抽提出来再进行基因分析，但该方法的DNA纯化步骤非常烦杂。这里探讨将头发经过裂解后直接作为样品的扩增实验。
操作流程：将采集到的1根男性毛发毛囊用70％乙醇洗涤一次；用蒸馏水冲洗毛发两次；在PCR管中加入15 μL裂解液65 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；将PCR管短暂离心，取4 μL裂解产物作为模板进行扩增
模板：人毛发粗提液4 μL
Primer： PrimerF：5’-TCCACTTTATTCCAGGCCTGTCC-3’
PrimerR：5’-TTGAAATGGAATGGGAACGAATGG-3’
PCR扩增程序：
2. 植物粗提液的扩增
部分实验室里经常进行植物的实验，从植物中抽提DNA作为样品进行PCR分析是个很繁杂而且费时的过程。在这里探讨用简便的一步法将植物组织处理后取其上清作为模板进行扩增分析的方法。
操作流程：截取1-2片0.5-0.7 cm的小麦叶片放入1.5 mL 离心管中，加入100 μL溶液L，确保叶片浸没在溶液中；95 ℃ 10 min；加入100μl溶液I；Vortex混合。取2 μL做模板扩增。
模板：植物粗提液2 μL
PCR扩增程序：同毛发程序同。
结果：采用本方法，以人毛发及小麦的粗提液为模板扩增，取扩增产物10 μl用1%琼脂糖凝胶电泳可确认到明亮的条带。
相关实验方法
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【求助】怎么摸一个新基因的PCR条件
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这个帖子发布于11年零163天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
怎么摸一个新基因的PCR条件？
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主要是退火温度,设计一个温度梯度,以55度为中心,如果你的PCR仪可以一起P几个温度的话,就很简单了
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PCR都一样，基本注意事项搞好了，就能出来。你在本版搜索一下，看看PCR的基本要求就可以了。
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建议你看看&PCR实验技术指南&会对你 有很大帮助!
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一般产家 会提供一个Tm值的，如果上游和下游引物相差不大或相同，则选用低于产家提供的温度3度开始摸起。如果上游和下游相差比较大，3度以上，那么就以产家提供的低温度开始。如果有带，而杂带比较多，那么就提高温度，减少非特异性条带。反之就降低温度。注明我用的是上海生工合成的引物，仅此以供参考。祝你成功！
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首先试试你们实验室别人最常用的条件，关键是退火温度，可以以你的引物的TM值为标准，以两度为梯度改变条件。然后逐渐改变镁离子浓度、模板浓度、DNTP的量，可以每次改变0.5UL或0.5MG/UL。还可以改变循环次数。祝你成功！
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谢谢楼上的高手们！
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求助:PCR的条件要怎么摸呢?
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这个帖子发布于12年零89天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我以前做PCR都是条件都是已经摸好的,现在自己设计引物后不知道怎么摸条件,是不是变性和延伸的温度不用摸,而复性的温度要一度一度得试?
还有,相同的基因片段在克隆到另一个载体上后,可以用原来的引物,那PCR条件要不要调整呢?
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在座PCR时，第一次一般用标准沉序，复性温度先定为引物（低的那个）-5度，然后根据扩增结果在设计反应。变性和延伸的温度基本上不变。一般先设计温度梯度，然后是摸板量，Mgcl2,酶量。相同的基因片段在克隆到另一个载体上后,可以用原来的引物,PCR条件可以不调整，不过有时需调一下模板量。
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你引物用什么软件设计的？一般的引物软件都会提供一个最合适的退火温度，自己在实验中根据具体情况适当调整即可。一般来说，如果产物杂带较多，可提高退火温度，产物量不够时可适当降低退火温度。当然这只是针对退火温度而言，其实影响PCR的条件还有不少，这里只回答您提出的问题。建议用primer5.0软件设计，很好用。变性和延伸的温度一般来说不要调整，在其他因素都考虑了后还不行再考虑吧。
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非常抱歉，刚忘了回答第二个问题一般可以不改变温度先做，如果不行，再做少量调整。
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公司合成的引物tm和软件上算得的tm不同，应该按哪个做啊！
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差别不大，我一般按软件上的做。注意是Opt的那个温度。
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mx710527 edited on
谢谢各位！
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【求助/交流】求教如何摸套式PCR的条件啊
求教如何摸套式PCR的条件啊？
第一次PCR完后泡个电泳看看有没有条带，如果有微弱的条带的话，接下来稀释的倍数要相应增大一些；如果啥都看不见的话也没有关系，接下来稀释倍数小一点。做的时候往往是梯度稀释的，不稀释1uL、稀释10-1000倍1uL这样做几个梯度。
用第一次PCR产物梯度稀释，然后各取1uL作为第二次PCR的模板。
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