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【整理总结】Transwell侵袭实验总结&[精华]
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正在做transwell的同学交流哈
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资料很好，谢谢大家的分享！
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做侵袭的时候是否能有乙醇代替甲醛？
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很全面，不愧是精华帖，楼主辛苦了，我也受教了
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听落雪 请教楼主啊，我想用3微米的小室做共培养，想研究B分泌的细胞因子对A的影响，按照实验指导，应该把A种于上室，B种于下室，但是由于上室空间有限，我所要接种的A细胞数量将为B的5倍，所以想将A种于下室，B种于上室，这样能达到效果吗？我也是做的和你差不多的试验，我也很疑惑，这种试验，一定要把A放在上面吗？
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收益颇多 感谢楼主
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感动得泪流满面啊。。找了很久的资料都摸不清头脑，此贴关于迁移和侵袭的相关信息应有尽有哇！！！
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请教一下 用OD值如何计算细胞数啊？
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非常不错，谢谢了！
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太好了，谢谢各位老师 师姐 师兄们！
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请问大家transwell用的什么公司？多大孔径？货号多少？我用的millipore的8μm的，在显微镜下仅能看到隐隐约约的细胞轮廓，细胞迁移后用结晶紫染色结果看不到有细胞被染上，但是在皿里细胞可以被染上，所以这说明结晶紫没问题，用DAPI染transwell可以看到迁移的细胞可见，细胞也已经迁移到膜的底层了。我分析是不是因为transwell的材质不是完全透明的所以遮挡了结晶紫的颜色？应该用透明的transwell?
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现在我们做细胞迁移和浸润，已经不用这个方法了，我们的新方法是引进了一个比较新的技术，可实现迁移浸润的自动检测，分享几个图，欢迎大家交流图片说明：A. 不同浓度梯度的VEGF介导的HUVEC细胞迁移。B. 不同浓度梯度的HGF介导的HUVEC细胞迁移。C和D分别是软件自动计算的VEGF和HGF诱导的时间依赖的EC50值。该技术可实现细胞迁移浸润的实时监测，提供了大量的生物学信息，通过这个实验，我的后续实验设计得到了优化，不用再做大量的预实验了。 实验步骤也比较简单，只需将含血清的培养基加入检测板下室，然后消化细胞、细胞计数并加入到检测板的上室中。就可以进行自动检测了，非常方便。
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freedom8116 edited on
谢谢，很详细、全面，学习了！
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超级感谢啊，太好啦~~
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谢谢您的有心总结 即使是多年后看到 依然十分受用 希望以后仍有机会向前辈学习
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非常感谢！收获颇多！
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lwjssry 第三节 Transwell的其他应用的实验步骤1．Transwell肿瘤细胞迁移实验
过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步骤做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：(1). 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca 2＋、Mg2＋，无血清的MEM。(2). 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。(3). 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。(4). 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。(5). 孵育后，经测定跨上皮电阻在Ω之间，即可用于电生理试验。显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片链接： 3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。链接： 4．mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验1%明胶处理的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后，上室加入100?l用serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及不同浓度的药物，下室加入0.6ml serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照，置于CO2培养箱中作用8小时，然后弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30分钟，0.1%结晶紫常温染色10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并拍照，最后用10%乙酸100?l/孔抽提10分钟，于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为：抑制率（%）=[(OD值给药组-OD值无刺激阴性对照)/（OD值不加药阳性对照- OD值无刺激阴性对照)] ×100%.链接： Transwell我只做过肿瘤细胞的侵袭和迁移，其他应用请有经验的战友跟帖吧。您好，我需要做迁移实验，有个问题，您刚才提到因为迁移实验不需要铺胶，细胞更容易通过，我觉得这样的话需要的细胞数应该少些啊，否则细胞计数是不是不太方便呢？还是说细胞数多一些，算迁移率更准确？
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freedom8116 现在我们做细胞迁移和浸润，已经不用这个方法了，我们的新方法是引进了一个比较新的技术，可实现迁移浸润的自动检测，分享几个图，欢迎大家交流图片说明：A. 不同浓度梯度的VEGF介导的HUVEC细胞迁移。B. 不同浓度梯度的HGF介导的HUVEC细胞迁移。C和D分别是软件自动计算的VEGF和HGF诱导的时间依赖的EC50值。该技术可实现细胞迁移浸润的实时监测，提供了大量的生物学信息，通过这个实验，我的后续实验设计得到了优化，不用再做大量的预实验了。 实验步骤也比较简单，只需将含血清的培养基加入检测板下室，然后消化细胞、细胞计数并加入到检测板的上室中。就可以进行自动检测了，非常方便。您好，您的方法是不是有实时监测的仪器呢？
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digestivepomelo 您好，您的方法是不是有实时监测的仪器呢？是的，细胞接种好之后，放在仪器上，仪器放在培养箱里，就可以自动检测了。这个仪器很方便，我一般都是周五把细胞放进去，然后周一来收集实验数据。
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freedom8116 是的，细胞接种好之后，放在仪器上，仪器放在培养箱里，就可以自动检测了。这个仪器很方便，我一般都是周五把细胞放进去，然后周一来收集实验数据。这么高级，什么仪器啊
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实时无标记细胞功能分析仪，挺好用的，我这个做的是迁移，有时候也做增殖实验。
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freedom8116 实时无标记细胞功能分析仪，挺好用的，我这个做的是迁移，有时候也做增殖实验。我也想做可是木有仪器，只能用土方子了
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digestivepomelo 这么高级，什么仪器啊这个仪器功能还挺全的，感觉比较有优势，我也在学习中，你可以看看这个链接，里面有挺多介绍的，
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freedom8116 这个仪器功能还挺全的，感觉比较有优势，我也在学习中，你可以看看这个链接，里面有挺多介绍的，这个仪器需要多少钱啊，看我们实验室买不买的起，哈哈
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digestivepomelo 这个仪器需要多少钱啊，看我们实验室买不买的起，哈哈具体多少钱，我可不知道哦，至少要几十万人民币吧。
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lwjssry 第一节 概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。1．Transwell关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。Fig1楼主太优秀了
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太好了，谢谢
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好牛！辛苦了
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正好准备做这方面的实验，非常感谢
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热点实验：细胞增殖毒性与Transwell(细胞迁移、侵袭)实验案例介绍
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关于transwell迁移和侵袭实验加药在上室还是下室的问题
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问题已解决悬赏丁当:2
我的课题是做一种关于某种金属离子对于肿瘤细胞的影响，MTT已经证实是起抑制作用。但是在接下来transwell进行迁移和侵袭实验的时候碰到了问题：由于我的药物配成液体后就自动分解成离子，而我研究的也是该金属离子对肿瘤细胞的抑制作用。那么，该金属离子的大小肯定是能够完全通过8um的transwell小室小孔。在坛子里看到的多是说，如果对细胞起到促进作用的话，要加入上室，而起抑制作用的话，则说的不多，按预想应该是加到上室，但是加到上室的话我的药物不就可以自由穿过小室而导致浓度变小了吗？也有战友说上下室保持药物终浓度一致，我用这种方法试了试，虽然效果很好，但是总有些不确定，求大神支招，给个权威的说法，在下论文确定要盲审，进度又很赶，所以拜托啦。PS：也有方法是药物处理过的细胞再接种到小室，但是有的细胞经过药物处理后细胞活性减低，无法确认能否正常检测这些功能吧？况且因为分开计数，所以无法确定接种细胞数量相差不大再PS：在我进行侵袭实验的时候，只把药物加入了上室，发觉结果和我之前做迁移的有很大不同，迁移的时候，做侵袭实验的时候，中浓度的药物（我的药物分为低中高三种浓度）与正常对照毫无区别，而做迁移实验的时候，因为上下室都有加药，所以中浓度药物对迁移实验的结果很明显，然而侵袭的结果照理说不该和迁移差这么多的吧？看遍了论坛的帖子，都没有讨论这个问题，**大神指导
不知道邀请谁？试试他们
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没做过加药的，但我觉得应该上下室保持一致浓度吧，看看其他大神的回答。
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我跟你遇到同样的问题，请问你查到解决办法了么？
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应该上下室都加药，有条件就把上下室单独加药也加上。上室加药，将在下室形成向下逐渐减弱的浓度梯度，如果你的是抑制作用的药，我觉得细胞应该是往药物浓度低的地方跑，就是往下室跑了下室加药，将在上室形成向上逐渐减弱的浓度梯度，细胞越向下爬受到的抑制作用越大，细胞应该也是不动了，应该和上下室都加结果类似上下室都加药，应该就抑制细胞运动了我是做细胞运动的，侵袭做的不多
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迁移实验，药物加到下室，药物干预实验，药物加到上室。
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joy_bear 我的课题是做一种关于某种金属离子对于肿瘤细胞的影响，MTT已经证实是起抑制作用。但是在接下来transwell进行迁移和侵袭实验的时候碰到了问题：由于我的药物配成液体后就自动分解成离子，而我研究的也是该金属离子对肿瘤细胞的抑制作用。那么，该金属离子的大小肯定是能够完全通过8um的transwell小室小孔。在坛子里看到的多是说，如果对细胞起到促进作用的话，要加入上室，而起抑制作用的话，则说的不多，按预想应该是加到上室，但是加到上室的话我的药物不就可以自由穿过小室而导致浓度变小了吗？也有战友说上下室保持药物终浓度一致，我用这种方法试了试，虽然效果很好，但是总有些不确定，求大神支招，给个权威的说法，在下论文确定要盲审，进度又很赶，所以拜托啦。PS：也有方法是药物处理过的细胞再接种到小室，但是有的细胞经过药物处理后细胞活性减低，无法确认能否正常检测这些功能吧？况且因为分开计数，所以无法确定接种细胞数量相差不大再PS：在我进行侵袭实验的时候，只把药物加入了上室，发觉结果和我之前做迁移的有很大不同，迁移的时候，做侵袭实验的时候，中浓度的药物（我的药物分为低中高三种浓度）与正常对照毫无区别，而做迁移实验的时候，因为上下室都有加药，所以中浓度药物对迁移实验的结果很明显，然而侵袭的结果照理说不该和迁移差这么多的吧？看遍了论坛的帖子，都没有讨论这个问题，**大神指导纠正一个我打错字的地方，对细胞起到促进的药物是加到下室，这个几乎是毫无异议的。就是起到抑制作用的药物，看到文献里有只加上室的，也有细胞经过药物预处理后再进行侵袭和迁移实验的。
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麦克林托克 应该上下室都加药，有条件就把上下室单独加药也加上。上室加药，将在下室形成向下逐渐减弱的浓度梯度，如果你的是抑制作用的药，我觉得细胞应该是往药物浓度低的地方跑，就是往下室跑了下室加药，将在上室形成向上逐渐减弱的浓度梯度，细胞越向下爬受到的抑制作用越大，细胞应该也是不动了，应该和上下室都加结果类似上下室都加药，应该就抑制细胞运动了我是做细胞运动的，侵袭做的不多我试过侵袭实验的，上下室都加和只加上室的效果差很多，上下室都加的话效果非常明显，而只加上室的话效果就差很多，感觉上下室都加A浓度的药物，和上室加上2A浓度药物（即药物剂量加倍）的效果差不多。按你的说法，是应该上下室都加吗？
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joy_bear 麦克林托克 应该上下室都加药，有条件就把上下室单独加药也加上。上室加药，将在下室形成向下逐渐减弱的浓度梯度，如果你的是抑制作用的药，我觉得细胞应该是往药物浓度低的地方跑，就是往下室跑了下室加药，将在上室形成向上逐渐减弱的浓度梯度，细胞越向下爬受到的抑制作用越大，细胞应该也是不动了，应该和上下室都加结果类似上下室都加药，应该就抑制细胞运动了我是做细胞运动的，侵袭做的不多我试过侵袭实验的，上下室都加和只加上室的效果差很多，上下室都加的话效果非常明显，而只加上室的话效果就差很多，感觉上下室都加A浓度的药物，和上室加上2A浓度药物（即药物剂量加倍）的效果差不多。按你的说法，是应该上下室都加吗？是的。在我的细胞运动的实验中，如果是起抑制作用的药物，上下室都加，效果最好。如果只加下室，也有效果。
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