利用PCR-RFLP技术鉴定部分沙梨（Pyrus Pyrifolia Nakai）品种S基因型--《华中农业大学》2006年硕士论文
利用PCR-RFLP技术鉴定部分沙梨（Pyrus Pyrifolia Nakai）品种S基因型
【摘要】：梨是世界及我国主栽果树之一，绝大多数品种自花授粉不能结实，相同S基因型品种间异花授粉也不能结实，在生产上必须合理配置授粉树才能获得目标产量和果实品质。自交不亲和S基因型的确定，对于沙梨授粉品种选择及其育种亲本选配具有重要意义。然而，中国沙梨品种的S基因型鉴定却很少报道。利用S基因特异性PCR-RFLP技术，对23个沙梨品种的S基因型进行了鉴定。结果表明：
1．采用CTAB法提取的沙梨基因组总DNA，大部分OD_(260)／OD_(280)在1.8左右，产率在200μg／g鲜重叶片以上，RNA去除干净，DNA无降解，能够用于本试验的后续分子生物学实验分析；
2．5个S基因型已知的日本沙梨品种，其鉴定结果与已知相符；
3．采用S基因特异性PCR-RFLP技术鉴定了18个未知S基因型沙梨品种的S基因型，其结果如下：金水1号(S_7S_x)、金水2号(S_3S_y)、江岛(S_5S_8)、华梨1号(S_1S_3)、湘南(S1_S_3)、翠冠(S_1S_S4S_5)、杭青(S3_S_7)、西子绿(S_1S_4)、新杭(S_1S_3)、清香(S_3S_7)、三花(S_7S_z)、黄蜜(今村夏)(S_1S_6)、黄花(S_1S_2)、二宫白(S_1S_w)、华梨2号(S_3S_4)、宝珠梨(S_7S_a)、苍溪雪梨(S_5S_b)、灌阳雪梨(S_7S_c)；
4．通过亲本S基因型分析，9个中国杂交沙梨品种，除华梨1号外，其余8个通过PCR-RFLP鉴定的S基因型均与亲本S基因型相符；所鉴定的华梨1号S基因型与其母本湘南同为S_1S_3，田间授粉试验结果也证明其异交不亲和；
5．通过F_1代S基因型分析，初步确定三花S_z为S_2，则三花S基因型为S_2S_7；
6．田间授粉试验结果表明，S基因型相同的华梨2号(S_3S_4)与新世纪(S_3S_4)异交，表现为不亲和，说明利用PCR-RFLP鉴定中国沙梨品种S基因型是准确可行的，通过本试验鉴定的华梨2号S基因型是正确的；
【关键词】：
【学位授予单位】：华中农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2006【分类号】：S661.2【目录】：
Abstract8-10
缩略词表10-11
1 前言11-21
1.1 问题提出11-12
1.2 前人研究进展12-20
1.2.1 植物自交不亲和性类型12-13
1.2.1.1 同型性SI12-13
1.2.1.2 异型性SI13
1.2.2 植物自交不亲和性研究进展13-16
1.2.2.1 配子体SI研究进展14-15
1.2.2.2 孢子体SI研究进展15-16
1.2.3 果树自交不亲和性基因研究16-18
1.2.3.1 果树自交不亲和性研究进展16-17
1.2.3.2 果树自交不亲和基因的数目17
1.2.3.3 果树自交亲和基因17-18
1.2.3.4 S基因表达水平的差异18
1.2.4 沙梨自交不亲和性基因型鉴定18-20
1.2.4.1 沙梨自交不亲和性基因型鉴定研究进展18-19
1.2.4.2 沙梨自交不亲和性基因型鉴定方法19-20
1.3 研究内容、目的与意义20-21
2 材料与方法21-29
2.1 材料21-22
2.2 方法22-29
2.2.1 主要试剂及仪器22-23
2.2.2 基因组总DNA的提取与质量检测23-24
2.2.2.1 基因组总DNA的提取23-24
2.2.2.2 所提取基因组总DNA的质量检测24
2.2.3 S基因特异性PCR扩增24-25
2.2.4 S基因特异性的限制性内切酶消化25
2.2.5 田间授粉试验25-26
2.2.5.1 花粉收集25-26
2.2.5.2 花粉离体萌发试验26
2.2.5.3 田间授粉座果率调查26
2.2.6 新S基因的克隆、测序及序列分析26-29
2.2.6.1 特异片段的回收26
2.2.6.2 连接26-27
2.2.6.3 大肠杆菌感受态细胞(DH5α)的制备27
2.2.6.4 转化27-28
2.2.6.5 阳性克隆的增值28
2.2.6.6 测序片段的选择28
2.2.6.7 目的片段序列测定28
2.2.6.8 测序片段的序列确认28
2.2.6.9 测序片段的序列分析28
2.2.6.10 系统树的构建28
2.2.6.11 新序列的提交28-29
3 结果与分析29-44
3.1 所提取基因组总DNA的质量检测结果29
3.2 S基因特异性PCR-RFLP结果29-33
3.2.1 S基因型已知的日本沙梨品种S基因型的验证29-30
3.2.2 S基因型未知的沙梨品种S基因型的鉴定30-33
3.3 所鉴定的沙梨品种S基因型的验证33-44
3.3.1 通过亲本／F_1代S基因型分析进行验证33-34
3.3.1.1 通过亲本S基因型验证F_1代S基因型33
3.3.1.2 通过F_1代S基因型验证亲本S基因型33-34
3.3.2 通过田间授粉试验验证部分品种S基因型34-38
3.3.2.1 花粉量34
3.3.2.2 花粉离体萌发率34-35
3.3.2.3 田间授粉试验验证部分品种S基因型35-38
3.3.3 通过PCR片段的克隆、测序验证新S基因38-44
3.3.3.1 金水2号S_y基因的验证38-39
3.3.3.2 宝珠梨S_a基因的验证39
3.3.3.3 苍溪雪梨S_b基因的验证39-40
3.3.3.4 灌阳雪梨S_c基因的验证40
3.3.3.5 沙梨S基因部分氨基酸序列的比对40-41
3.3.3.6 梨属植物S-RNases的序列分析41-44
4 讨论44-47
4.1 提高梨基因组总DNA提取质量的几点建议44
4.2 S基因型鉴定方法的探讨44-45
4.3 应用多种方法确定S基因45
4.4 S-RNases的序列多样性分析45-46
4.5 需进一步研究的问题46
4.6 自交不亲和基因型的应用46-47
参考文献47-56
图版和图版说明56-59
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京公网安备75号PCR－RFLP分析技术 - PCR实验 - 生物秀
标题: PCR－RFLP分析技术
摘要: Polymerase Chain Reaction –Restriction Fragment Length Polymorphism【实验目的】1．熟悉PCR—RFLP分析技术原理及实验步骤。2．掌握琼脂糖凝胶电泳检测方法。3．了解PCR—RFLP在遗传病基因诊断中的作用。【实验原理】聚合酶链式反应（PCR）是模拟体内DNA复制条件在体外酶促合成特异……
Polymerase Chain Reaction &Restriction Fragment Length Polymorphism
【实验目的】
1．熟悉PCR&RFLP分析技术原理及实验步骤。
2．掌握琼脂糖凝胶电泳检测方法。
3．了解PCR&RFLP在遗传病基因诊断中的作用。
【实验原理】
聚合酶链式反应（PCR）是模拟体内DNA复制条件在体外酶促合成特异DNA片段的循环反应，可使目的DNA片段得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置于高温(约93℃-95℃)下使之变性解链；人工合成的两个寡核苷酸引物在低温(约50℃-70℃)下分别与目的DNA片段两侧的互补序列复性结合；引物在DNA聚合酶作用（约70℃-75℃）下沿模板按5&&3&方向延伸，合成目的DNA片段的新互补链。如此经过n个周期，理论上扩增2n倍,一般PCR经30-40周期后可获得百万倍以上的目的DNA。
聚合酶链式反应&限制性片段长度多态（PCR&RFLP）分析技术是在PCR技术基础上发展起来的。DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增包含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应用PCR&RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。
本实验以家族性甲型血友病患者及其相关成员外周血DNA为模板，PCR扩增凝血因子FⅧ基因的583bp特异片段产物，其中包含MspⅠRFLP多态位点，经MspⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度（583bp或360bp+223bp），以此为遗传标记进行连锁分析，判断胎儿是否得到了带有缺陷FⅧ基因的染色体，从而做出间接基因诊断。
【实验用品】
1．DNA（50ng/&l）、引物Ⅰ和Ⅱ（20&Μ）、TaqDNA聚合酶（5U/&l）10&PCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）、灭菌蒸馏水、液体石蜡、限制性内切酶MspⅠ（20U/&l）、10&酶切缓冲液。
2．2%的琼脂糖凝胶、5&TAE、6&上样缓冲液、DNA Marker、溴化乙啶贮存液（10mg/ml）（EB）。
3．PCR自动热循环仪、紫外透射仪、微量加样器（20&l、200&l）、枪头（20&l、200&l）及(1ml、0.5ml)、容器盒、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、烧杯、保鲜膜、封口膜、浮漂、微波炉、250ml三角烧瓶、透明胶带、托盘天平、台式高速离心机。
【实验步骤】
一．PCR反应
PCR反应体系20&l，其成分如下：
按以上次序，将各物质加入到一只无菌的0.5ml中。轻轻混匀后，离心5秒钟，加入一滴液体石蜡盖于反应混合液的表面，然后放入PCR仪中进行循环反应。
PCR 反应循环温度：
94℃预变性3分钟，然后进行以下循环30次
最后经72℃再充分延伸7分钟。
反应结束后置4℃冰箱保存。
二．PCR产物的MspⅠ酶切
反应体系20&l其成分如下：
置37℃消化1小时，4℃保存。
三． 糖凝胶电泳检测
1．胶板的准备
取有机玻璃内槽，洗净晾干。取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（注意，将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上，不要留空隙）。将有机玻璃内槽置于一水平位置，在距离底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。
2．2%的糖凝胶的制备
称取1克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml 1&TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到2%琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2.5&l溴化乙啶贮存液（10mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5&g/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1小时左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。
3．将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳，预电泳10min。
4．每份限制酶切产物取10&l，加2&l 6&上样，混匀后加入到样品孔中，以100V 电泳50分钟。
5．断电后取出凝胶，放在紫外透射仪中观察并记录PCR&RFLP结果。
【实验结果与分析】
根据甲型血友病患者及其相关成员的亲属关系绘制遗传系谱图，观察并记录琼脂糖凝胶电泳分离的片段长度，绘制出家系各成员FⅧ基因MspⅠ RFLP等位片段与系谱相关图，进行连锁分析，判断胎儿是否是甲型血友病患儿。
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