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【求助】有做关于分离人外周血NK细胞的吗？
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这个帖子发布于4年零268天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我最近想做分离人外周血NK细胞（CD3-CD16+CD56+），但是具体方法还不太清楚，我看大多数都是选择免疫磁珠法，这个方法具体应该购买什么东西啊？我真是一窍不通啊，拜托各位给帮帮忙提供点线索……不胜感激
不知道邀请谁？试试他们
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不知道你的实验精度要求怎么样，NK细胞的磁珠分选有多种方法，比如1、用非NK的标记将NK以外的细胞去除，以得到表面未结合抗体的NK阴选法，此法适用于对功能试验要求高的2、用CD56单个标记阳选，是最简单的方法，单NK精度不够3、CD3阴选，CD56阳选，比方法2稍精确的4、再根据CD16进一步细分NK亚群的。。。。具体可以参考美天旎网站进行试验需要购置一个美天旎的磁铁，价格大概小一万，然后购买LS分选柱和磁珠，大概7000左右一个磁珠，买磁珠可以送分选柱。具体可以联系优维宁公司，是美天旎总代理。
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evilbatuu 不知道你的实验精度要求怎么样，NK细胞的磁珠分选有多种方法，比如1、用非NK的标记将NK以外的细胞去除，以得到表面未结合抗体的NK阴选法，此法适用于对功能试验要求高的2、用CD56单个标记阳选，是最简单的方法，单NK精度不够3、CD3阴选，CD56阳选，比方法2稍精确的4、再根据CD16进一步细分NK亚群的。。。。具体可以参考美天旎网站进行试验需要购置一个美天旎的磁铁，价格大概小一万，然后购买LS分选柱和磁珠，大概7000左右一个磁珠，买磁珠可以送分选柱。具体可以联系优维宁公司，是美天旎总代理。谢谢您，我去网站看看
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evilbatuu 不知道你的实验精度要求怎么样，NK细胞的磁珠分选有多种方法，比如1、用非NK的标记将NK以外的细胞去除，以得到表面未结合抗体的NK阴选法，此法适用于对功能试验要求高的2、用CD56单个标记阳选，是最简单的方法，单NK精度不够3、CD3阴选，CD56阳选，比方法2稍精确的4、再根据CD16进一步细分NK亚群的。。。。具体可以参考美天旎网站进行试验需要购置一个美天旎的磁铁，价格大概小一万，然后购买LS分选柱和磁珠，大概7000左右一个磁珠，买磁珠可以送分选柱。具体可以联系优维宁公司，是美天旎总代理。如果用免疫磁珠法提取NK细胞，那么1次大概能提多少NK细胞？这个磁珠能重复用吗？
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有没有用PBMC直接诱导NK的试验方法呢
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yingying860621 有没有用PBMC直接诱导NK的试验方法呢这个很困难吧！！！
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添加细胞因子 不是很困难，但就是不知道什么方法，还请高人指点啊！
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大春儿ff 我最近想做分离人外周血NK细胞（CD3-CD16+CD56+），但是具体方法还不太清楚，我看大多数都是选择免疫磁珠法，这个方法具体应该购买什么东西啊？我真是一窍不通啊，拜托各位给帮帮忙提供点线索……不胜感激有流式细胞仪带分选功能的话，Aria I II 或更新的机器，可以尝试流式分选。3标（CD3 CD16 CD56)或4标 （CD45 CD3 CD16 CD56),用Accudrop微球校准液滴延迟后就可以分选，按（CD3-CD16+CD56+)或(CD45+CD3-CD16+CD56+)分就行，但可能的风险是，不确定荧光抗体标记过的NK被分出后如遇后续培养操作，是否一定能一切正常。
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zark_00 有流式细胞仪带分选功能的话，Aria I II 或更新的机器，可以尝试流式分选。3标（CD3 CD16 CD56)或4标 （CD45 CD3 CD16 CD56),用Accudrop微球校准液滴延迟后就可以分选，按（CD3-CD16+CD56+)或(CD45+CD3-CD16+CD56+)分就行，但可能的风险是，不确定荧光抗体标记过的NK被分出后如遇后续培养操作，是否一定能一切正常。嗯，这个我问过，似乎会影响后续的培养，我用的是免疫磁珠
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你好，想问一下后来是用什么方法做的，我现在在用人外周血养单核细胞
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关于丁香园& 【求助】人外周血单核细胞的分离、培养
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【求助】人外周血单核细胞的分离、培养
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单核细胞？
单个核细胞？
外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有ficoll和percoll两种。
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请教楼主：这个步骤的目的是什么？为什么要这样做呢？PBMC不是悬浮型细胞么？这些未贴壁细胞都是些什么成分？
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单核细胞是贴壁细胞，淋巴细胞是悬浮细胞，据此可分离两种细胞。
曾听说单核细胞贴壁不是很牢固，但是我的感受是单核细胞贴壁相当牢固。我先是震荡，细胞没脱落；我用枪吹打，也没脱落，以为力度不够，换巴氏管猛烈吹打，还是没脱落；然后用胰酶边消化边摇晃，持续一分多钟仍有约20%没掉下来。而且我觉得消化下来的多是老弱病残，真正年轻力壮有活力的仍然贴在培养瓶上。百思不得其解，我的培养瓶是一次性塑料的，也没有经过特殊处理，为何贴壁这么牢固？望高人指点。
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楼上的PBMC怎么这么牢固啊?????
我的用吸管稍稍用点力气一吹，就下来啦……
我同实验室的，他们也普遍是这个情况啊……
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顶！我也正在提单核细胞，没有这位师兄做得好，希望能多交流！
出于人道不想在自己还没有完全搞清楚的情况下用人血做。之前用老鼠，效果不理想，明天想用检验科做血常规的废血做一下。可是一打听，那用的是EDTA抗凝管，看的文献是肝素，不知对单核有没有影响？还有这样的血算不算无菌，我提单核也是用来做细胞实验的，没什么大碍吧？急
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师兄用的是多大的培养瓶？
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好像有点乱。
首先搞清楚“外周血单个核细胞 peripheral blood mononuclear cells 即PBMC”和“单核细胞 Monocyte”是两个不同的概念，前者包括单核细胞、T细胞、B细胞等。体外培养能贴壁的，应该是单核细胞，不贴壁的当然是T、B等其他细胞了。你也可以用密度梯度离心法分离PBMC后，再用抗CD14的免疫磁珠分离单核细胞，优点是分离出的单核细胞较均一，活性好。加GM-CSF、IL-4、LPS等培养后可分化为树突状细胞DC。估计你是想获得DC吧。
以下是我用过的分离、保存PBMC的Protocol，供参考。可根据所需体积作相应调整。
B. Separation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
1.Fill in all required information on data sheet “Cryopreservation of Peripheral Blood Mononuclear Cells.”
2.Remove the rubber stoppers from the vacutainer tubes. Wipe off the top of each tube with an alcohol swab.
3.Transfer the blood to an appropriate size flask using a sterile pipet. Dilute the blood 1:1 with RPMI 1640. Use approximately 10 ml RPMI 1640 to rinse the vacutainer tubes, and combine with the rest of the blood.
4.Transfer 13 ml Ficoll (warmed to room temperature) to each 50 ml centrifuge tube needed to process the entire sample.
5.Carefully layer the diluted blood over the Ficoll.
6.Centrifuge at 2000 rpm for 15 minutes with centrifuge brake OFF.
7.Collect the cell band at the interface from each centrifuge tube, and transfer it to fresh centrifuge tubeMoon. Add RPMI 1640 for a final volume of 45 ml in each centrifuge tube. Centrifuge at 2000 rpm for 5 minutes. Remove the supernatant, combine the cells in all of the tubes into one tube in 45 ml RPMI 1640. Count the cells.&&
C. Cryo-preservation of isolated PBMC
1.Centrifuge cells at 2000 rpm for 5 minutes. Remove the supernatant.
2.Resuspend the cells at 20 x 106 cells/ml in freezing solution (50% FCS, 40% RPMI 1640, and 10% DMSO).
3.Transfer 1 ml of cells into each 1.8 ml cryovial that is labeled with donor’s name, hospital number, date, and cell type.
4.Transfer all cryovials to a pre-cooled freezing chamber and freeze using the appropriate program.
5.Once the program is complete, transfer the cryovials to a liquid nitrogen freezer
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原帖由 箭头儿 于
17:58 发表
好像有点乱。
首先搞清楚“外周血单个核细胞 peripheral blood mononuclear cells 即PBMC”和“单核细胞 Monocyte”是两个不同的概念，前者包括单核细胞、T细胞、B细胞等。体外培养能贴壁的，应该是单核细胞，不贴壁的当然 ... 多谢指点，确实有点乱，概念模糊，我把上面的帖子整理一下，有不妥的地方请继续指正。
还想请教一下，单核细胞体外培养需要加那些东西？我看见有人加地塞米松还有1，25（OH）2D3，这些是必须的吗？
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楼上的PBMC怎么这么牢固啊?????
我的用吸管稍稍用点力气一吹，就下来啦……
我同实验室的，他们也普遍是这个情况啊……
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这么好吹吗？我用20%新生牛血清1640+谷氨酰胺，一次性塑料培养瓶，你用的什么，差距怎么会这么大来？不解。
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谢谢指教，对PBMC以及单核细胞的了解又加深了不少！
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原帖由 bluelake 于
17:58 发表
师兄用的是多大的培养瓶？ 5的培养瓶，蓝盖的。不知道这么描述准确吗。
老鼠的血跟人的血的比重恐怕有差别，你用FICOLL分离效果可能会不好。检验科化验用的血每个人才几毫升量太小，而且不够新鲜，我也好像看过文献EDTA确实也有影响。所以你还是做出点牺牲，抽自己的吧，随抽随做，新鲜量又足，也不会有不人道感觉。
你要养这种细胞，希望分享你的经验和心得，共同进步。
你有没有加什么刺激因子？PBMC细胞；人外周血单核细胞
PBMC细胞；人外周血单核细胞
产品报价：￥10元
更新时间：访问人数： 19次
产地：美国产品资料：
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