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【求助】小片段亚克隆回收效率如何提高？
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这个帖子发布于8年零335天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
做了几个一百多bp不到200bp小片段的T载体，现在正在往目的载体上搬，但是回收效率实在让我头疼，具体情况是这样的：1）t载体大概3k，小片段都不到2002）由于买到的内切酶包括takara和neb两家的，不好混用，所以双切分两次做，也就是说要回收两次。作了几次，不断加大初始质粒的用量，可是一次回收，总量就少掉3分之2，两次后几乎就回收不到小片段了。。。。不知道takara和neb两家的内切酶是否能够混用，这样做一次回收，酶切体系和回收得率感觉都能优化一下。。。
不知道邀请谁？试试他们
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第一次回收你也是跑胶？用乙醇沉淀损失不了多少的此外第一次回收还可以用PCR回收试剂盒，几乎不损失而且片断小做连接时候用量就少，一点点就够了。
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有道理。。。第一步可以用pcr纯化盒子代替胶回收。。。
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不知道你是怎么想的，赶紧把酶统一公司，时间永远比金钱重要，然后双酶切，直接酶切产物过柱回收，我用的是BBI的，生工最近打的特价的。然后和胶回收的载体连接。（这里有个小窍门：你可以将小片段先连到和你目标载体抗性不同的载体上，这样只要你目的载体酶切完全，根本不必考虑假阳性）祝你好运！
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阿，谢谢阿，因为实验室原来就有不同厂家的酶，老板又觉得这是个小case，我前面也只好这么做了，花了好久还是没有能够做好，胶回收效率实在不怎么样，定量也不方便，最后几十微升一溶解，好大一个体系好低一个浓度。。。埃，决定统一酶体系了！
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最后溶解干吗加那么多水？最多加十几二十就足够了。再狠点干脆直接把连接体系往干燥的片断里面加，肯定够用
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汗，博大的kit用水洗效果不佳，以后再也不用水了，把连接体系往干燥的硅胶柱上加我还没想好后果会怎样。。。现在打算1）按原方案用洗脱缓冲洗脱看看能不能改善一下状况2）重新订统一的酶。。。
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想试试看第一步酶切用氯仿抽再用无水乙醇沉淀然后回收，这样似乎可以免去切胶过柱的损失，然后第二轮酶切再用胶回收，最后还是用乙醇沉淀浓缩体系，达到所需的浓度。。。。。。。orz我要去实践一下！
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我以前连的片段一个88 一个90bp,建议不要用T载体,直接连接表达载体会好一些,从上载体切下来的目的片段肯定比PCR的少,而且难回收.
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改用无水乙醇沉淀出来的，损失大概一半，不过溶解后的质量不错。继续尝试中。。。
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不同公司的酶是可以混用的，实际上，我从来就不考虑酶的来源。我甚至经常用两种Takara的酶作双酶切，但buffer使用NEB公司，也可能用Takara和NEB的酶，buffer使用Fermentas公司的，算如今也应该是身经百战了吧，但还没有在这方面发生问题。
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恩，我同学也干过，已经作好随时统一品牌的准备了。话说neb的bglII切的效率好像不是很好，50ul体系十几个小时总是切不完全。。。
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chilling 做了几个一百多bp不到200bp小片段的T载体，现在正在往目的载体上搬，但是回收效率实在让我头疼，具体情况是这样的：1）t载体大概3k，小片段都不到2002）由于买到的内切酶包括takara和neb两家的，不好混用，所以双切分两次做，也就是说要回收两次。作了几次，不断加大初始质粒的用量，可是一次回收，总量就少掉3分之2，两次后几乎就回收不到小片段了。。。。不知道takara和neb两家的内切酶是否能够混用，这样做一次回收，酶切体系和回收得率感觉都能优化一下。。。为什么两个公司的酶不能一起用？或者按照Takara的，或者按NEB公司的，完全可以共用的。我就这么做过，除非在同一个公司提供的buffer里找不到合适的，才会分两步酶切。我建议你还是一起酶切，看一下酶在buffer中的效率，只要最低效率&50%即可，这样可以大大节省时间。
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你这个还是小问题啊 我回收50bp左右的才是郁闷到自杀。快死了
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用好的回收试剂盒，德国MN的产品，65bp以上的片断回收效率达到90%，不好不要钱。李辉平
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丁香园中级站友
这个回收小片断,我还比较在行,我以前的片断只有100bp市售的试剂盒常常有小片断回收效率很低的问题。PCR产物经过酶切、回收等步骤后，损失太大。进入连接反应的PCR片断量太小常常是试验失败的原因。我的做法是，简化步骤、减少核酸在处理过程中的损失，让较多量的PCR产物和质粒片断进入酶连反应——以量取胜。我的做法是很粗放型的，但是成功率很高。如果愿意，你可以试试。大致的做法是：制作100微升PCR产物；酒精沉淀回收PCR产物；PCR产物及载体酶切；跑回收胶；将回收胶上的PCR产物和载体片断切下，回收到一个试管中；冰冻、碎胶，酚、氯仿抽提，酒精沉淀；加入8微升水、1微升连接酶和1微升连接buffer，4度过夜；转化涂板。具体的操作：PCR产物回收1. 制备100μL PCR产物。2. 将100μL PCR产物加入一1.5mL离心管中，再加入400μL双蒸水，颠倒混匀。加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。颠倒数次混匀。（提示 本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）3. 4℃静置30分钟，以利于核酸沉淀。4. 12000rpm 4℃ 离心15分钟，沉淀核酸。5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。）酶切直接在回收PCR产物的试管中配置酶切体系：PCR产物酶切－制作插入片断10×Buffer 6μLSal I 5μLPCR产物 —— 双蒸水 49μL合计 60μL要将PCR产物接入的质粒载体A，取A质粒（小提的质粒即可）3μL进行酶切。A质粒酶切－制作载体片断10×Buffer 3μLSal I 1μL质粒 3μL双蒸水 23μL合计 30μL混匀。37℃，酶切3小时。1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）1. 酶切产物加入10％量的上样Buffer，混匀。使用1%的琼脂糖回收胶，电泳回收酶切产物。2. 用手术刀切下所需要的大片断（载体）和小片断（插入片断），收入一个1.5mL离心管中。 （提示 切胶前，需用分别含酒精、NaOH和双蒸水的纸巾擦拭凝胶接触的台面，以防污染。 手术刀要火焰消毒，而后切胶回收。）3. 12000rpm 1分钟，将凝胶甩到管底。 -20℃ 冰冻20分钟。4. 取200μL Tip 头两只，在酒精灯上稍烤化Tip头尖端，两Tip头尖相对来回相接触，在Tip头顶部制成直径3mm左右的平头，准备用于碎胶。5. 从-20℃取出冻结的凝胶，立即使用200μL枪套上平头Tip头，捣碎凝胶。（提示 200μL的枪足够粗壮，不要用100μL的枪，小心折断！！！ 乘凝胶比较硬时就开始碎胶，轻而频率高地捣碎凝胶。胶碎裂不够细密可再次冰冻后碎胶。）6. 凝胶管中加入500μL双蒸水，盖紧，振摇200下。7. 加入500μL Tris饱和纯酚，盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心15分钟。8. 在一新1.5mL 离心管中加入 500μL 氯仿：异戊醇（24：1），将步骤7的上清加入本步骤离心管中。盖紧，振摇200下。 12000rpm 4℃ 离心5分钟。9. 在一新1.5mL 离心管中加入 900μL 预冷 无水乙醇、20μL 3M的醋酸钠。将步骤8的上清小心加入本步骤离心管中。颠倒数次混匀。12000rpm 4℃ 离心15分钟。（提示 吸取步骤8中的上清时，千万不要将有机相吸入，宁可放弃一些上清，否则影响后面的连接反应。 另外，本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。）10. 弃上清，将离心管导致于干净吸水纸巾上5分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管至于超净台吹风干燥。 如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风）连接向回收DNA的试管中加入8μL 双蒸水，盖紧，弹击管底使液体尽量接触管壁。瞬时离心将液体甩到管底，再加入1μL ligase Buffer，1μL T4 ligase（连接酶）。弹击管壁混匀，瞬时离心将液体甩到管底。 置4℃过夜。 （提示 Ligase Buffer应该在首次融解后分装，每管可2-3μL，-20℃存储。 4℃过夜可获得最多的转化克隆。）目前我用的最好的是TAKARA的D301试剂盒我后面把说明书发来.CLONTECH的NucleoTrap Gel Extraction Kit用3M 的NaCl或NaAc将回收胶浸泡过夜，然后用乙醇沉淀，就可以了。0mega我刚做了100bp的回收，回收率能达到40％。以下几点建议：1 尽量用新配制的TAE，（有人说TBE效果不好），但我用的是TBE2 Qiagen说100bp片段在溶胶后要加入异丙醇，但我发现容易产生沉淀，堵柱子。但我不知Omega用的是什么溶胶液，你可以试一下：溶胶后加入与胶等体积的异丙醇，如用0.1g胶，加100ul异丙醇，再进行一下操作3 回收的样品尽量上样多一点，我一般是用4ug/100ul其实我没有用Qiagen的盒子，只是看了他的说明书。一般说来，各个公司的溶胶液中用的都是NaClO4，这种溶胶液加入异丙醇产生絮状沉淀，堵柱子。你试一下Omega的看看行不行？其实最早的凝胶回收文献是在PNAS 1979的文章，用的是NaI，现在一般不用了，有毒。古老的方法不好，如果Omega的盒子加入异丙醇沉淀的话，用尽量多的产物上样，总能得到一点纯化的带，够用就行了。我做100bp，上样量4ug/100ul，最后用50ul水洗脱，回收率达10％，0.2ug/50ul，足够用了。片段太小，很难操作，是不是可以试试如下策略：引入外源基因扩大PCR产物长度进行克隆，外源基因可以选取克隆载体上的片断，在其多克隆位点之外（复制子下游非必需区）的一个酶切位点之间的序列（再设计一条引物），用60bp的PCR产物和质粒做模板再进行PCR，获得包含60bp和部分载体序列连接的序列，然后再酶切克隆。当然中间的引物要合成一个5‘与载体序列一致的。没做过，只是想法，供参考！Qiagen gel kit can facilitate your job.荐华舜的胶回收试剂盒回收效果好，经常回收完了只跑1微升电泳就能看到很浓的条带说说我的吧,我是将胶割下来,然后放到用21-规格的针头戳个孔的0.5ml管,将其至于1.5ml的管中,最大速度离心将胶断裂成小的,然后加TE溶液在65度作用2小时,或4度过夜,然后吸取溶液用乙醇,0.5倍体积的7.5M NH4Ac 沉淀,最好能加点肝糖原,效果停好的，我回收130和34bp的都这样,不烦试试!如果你的PCR产物比较纯，可以直接沉淀。推荐一种PEG8000沉淀法，适用于浓度0.1ug/ml，长度26bp以上片段：加入0.01倍DNA样品体积的1mol/L 氯化镁；加入0.5倍DNA样品体积的 40% PEG8000,混匀；室温沉淀10分钟12000g室温离心10分钟。70％乙醇洗涤，12000g室温离心5分钟；同样条件再次洗涤。重悬这样，关于核酸回收，建议不用国产的，当我们拆开用于吸附的柱子看看，一切就都明白了，国产的就是３０－５０层滤纸，而进口的就是尼龙棉柱，这就是根本区别，吸附为基础的柱子是因为沉淀的核酸有与尼龙柱特异结合的特性，这是胶回收，PCR回收，和质粒提取盒子的关键。而国产柱子为了降低成本尤其是小公司自制的柱子，（最近就有一个北京的试剂商在我们科研究核酸回收试剂盒，叫梁平，四川人，不知北京战友有没有人认识），就是用滤纸代替尼龙柱，用超滤拦截沉淀的核酸分子，你想，这不是胡闹么，滤纸哪能截得住分子？这就是造成国产核酸柱子回收率降低的根本原因。我也拆了几个国内公司的核酸回收试剂盒的柱子，不看不知道，一看吓一跳，全都是滤纸，只是有的层多一些有的层少一些。就没有一个是尼龙柱。尽管Omiga是立陶宛的公司，质量也稍微差劲，但是人家用的就是尼龙柱。进口核算回收柱我最喜欢Roch的，效率很高。Gibico的也还可以。也有战友说进口的柱子回收率也不高，原因在哪里呢？关键步骤：１，溶胶要充分２。温度不能太高，&５０Ｃ后磷酸基团自发脱落，会导致后续步骤的连接困难３。结合缓冲液，（含异丙醇，也有的试剂盒异丙醇后加），一定要反应充分，确保核酸彻底沉淀，异丙醇可以加过量，可以将试管在桌面上敲一敲，如果还有气泡产生就是反应不够充分，还应继续反应，直至没有气泡出现为止。４。洗涤缓冲液中的乙醇一定要过量，使用时间长了乙醇要挥发，一定要酌情添加，否则，洗涤的时候，核酸就溶在洗涤缓冲液中丢了。５。溶解缓冲液的量和PH值是否足够？有没有在室温下将其充分溶解？玻璃奶试剂盒从低熔点凝胶提取DNA。纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。用低熔点胶电泳后切下含目的带的胶条，置液氮中处理几分钟，捣碎胶块，加入一定量的TE溶解之，再用酚/氯仿抽提取上清沉淀即可。试剂盒回收若要提高大片段的回收率需要加入异丙醇。
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版大发的这个太厉害了！！！可以精华了！！！！
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关于丁香园如果pcr产物电泳结果不单一，怎么改善和提高实验质量
如果pcr产物电泳结果不单一，怎么改善和提高实验质量
09-10-21 &匿名提问
RACE技术的简介 cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。RACE(rapid-amplification of cDNA ends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。 RACE的优点 与筛库法相比较，有许多方面的优点 1）此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。 2）节约了实验所花费的经费和时间。 3）只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。 实验室现有的RACE试剂盒的简介 RACE是一种从一个相同的cDNA模板进行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链PCR。 使用此方法的要求是必须知道至少23－28个核苷酸序列信息，以此来设计5’末端和3‘末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。 RACE引物的设计： 基因特异性引物（GSPs）应该是： 23－28nt 50－70％GC Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果 需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。 反应中涉及到的一些事项 cDNA的合成起始于polyA RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。 RACE PCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。 在进行5‘和3’RACE PCR的时候应该使用热启动。 表4中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。 引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和 如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。 降落PCR可以明显的增加RACE PCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。 形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。 验证基因特异性引物的对照： 单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。 利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。 制备和抽提polyA RNA 不要使用DEPC处理过的水。 纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。 具体的实验步骤 cDNA第一条链的合成： 我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。 注意： 在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。 将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。 直接进行第二链的合成。 cDNA第二链的合成： 第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4 DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。 建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。 通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。 接头的连接及连接产物的稀释 按照程序进行连接反应。 如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTA buffer制备接头连接的ds cDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行以下的RACE PCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。 RACE－PCR扩增 进行5’和3’的RACE－PCR扩增。 利用以下的程序进行降落PCR反应： 注意： 我们建议使用降落PCR反应，这就要求GSP的Tm值≥70度。 当循环结束时，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物5μl，使用适当的分子量marker。 可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带，在68度多加5个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在2－5kb的时候，经常使用4min，0.2-2kb的时候将延伸时间减到2－3min，对于5－10kb的条带，延伸时间增加到10min。 RACE产物的验证： 应该对RACE的片段进行验证,以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员，验证是非常有用的。 有3种验证RACE产物的方法： （1）比较由GSP和NGSP获得RACE产物。 （2）Southern blot （3）克隆并测序 我们建议最好测得RACE产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。 比较由GSP和NGSP获得RACE产物 对于5‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。 对于3‘末端的RACE产物，比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。 如果条带是正确的，在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。 RACE产物的克隆和测序： 可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。 电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。 将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中. 对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4 DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。） 一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。 全长cDNA的获得 通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。 通过PCR的方法获得全长cDNA： 扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。 根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。 进行如下的热循环： 94度 30秒 25个循环 94度 5秒 72度 2－15分钟 延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如：预期得到6kb的条带，用6＋2＝8分钟的延伸时间。 注意：如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；或者优化PCR的条件。 在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。 制备1.2%的TAE buffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBE buffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。 将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。 利用长波紫外观察cDNA（≥300nm）切下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射。 利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTA buffer 30μl重新悬浮DNA样品。 将全长的cDNA克隆到T/A型的 PCR克隆载体中。
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我想用乙醇沉淀法纯化pcr产物，求助份具体步骤？谢谢查看完整版本请点击这里：
birdfish ( 10:43:26)
不喜欢用苯酚和氯仿，用的另一种方案：
加1/10的3N醋酸钠，再加3倍量无水乙醇，冰浴30min，13600rpm离心20min，弃上清.加75%乙醇，再离心20min，弃上清，真空干燥，加水溶解。
BUK ( 10:43:44)
离心时间越长回收率越高，尤其是小片段。
ending ( 10:44:04)
这种方法好用吗，与跑胶再胶回收的方法相比有什么优点
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抗人乙酰胆碱受单链抗体1956#的可溶性表达、纯化及其功能鉴定.pdf68页
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标题: 如何用乙醇沉淀连接产物和胶回收的线性DNA?(连接产物,胶回收)
摘要: [如何用乙醇沉淀连接产物和胶回收的线性DNA?(连接产物,胶回收)] 请教大家:怎样用乙醇沉淀连接产物和胶回收的线性DNA?谢谢! 关键词:[连接产物 胶回收]……
请教大家:怎样用乙醇沉淀连接产物和胶回收的线性DNA?谢谢!
回复你这句话不太通顺。回复怎样用乙醇沉淀胶回收的线性DNA载体?还有怎样沉淀重组载体?回复你的DNA都胶回收了，还乙醇沉淀干什么啊？保存？回复用宝试剂盒连DNA和线性载体,它建议把试剂盒的胶回收DNA再乙醇沉淀,去处盐质连接后我要做电转
请问怎么做回复用宝试剂盒连DNA和线性载体,它建议把试剂盒的胶回收DNA再乙醇沉淀,去处盐质连接后我要做电转
请问怎么做回复胶回收的时候可以不用试剂盒带的溶解Buffer，直接用超纯水溶解洗脱即可，不用考虑盐分，回收效率一致。如果要乙醇沉淀回收，直接向你的体系里加2V的无水乙醇（或95％乙醇）和1/10V的3M的NaAc（pH5.2)，混匀静置，12000g离心10min，70％酒精洗涤沉淀两遍，晾干酒精，超纯水溶解即可。要注意的是，乙醇沉淀的时间不要太长，低温（有利于DNA，特别是小片段的沉淀，一般可以控制在-20度）静置，10min之内离心收集沉淀，否则盐分也会沉淀很多；另外，70％乙醇漂洗要严格一点，要彻底把沉淀打起来，以为这步就是洗盐的。另外，我不太清楚电转化对质粒的离子强度要求是否有这么严格，一直都没有特意的去除盐，我直接连接产物电转都没关系的啊
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