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肺结核做药敏实验都需要准备什么
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我是肺结核吃药吃吃停停的吃了一年多都没效果想做下药敏实验该准备什么没有痰
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&&&&&&病情分析：&&&&&&肺结核患者抗结核治疗，不能规律服药，怀疑耐药，可以做药敏试验选择敏感药物，在试验之前应该停药3天，然后采集夜间痰、晨痰送样最好。&&&&&&指导意见：&&&&&&肺结核病患者诊断和治疗，国家有相关的免费政策，胸片、痰涂片、痰培养、肝肾功能等，都是免费的。建议你去结核病专科医院做药敏试验。
副主任医师
擅长: 胃十二指肠溃疡,冠心病,颈椎病,胆囊炎,肾结石,肺
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郝医生医师
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.64株不动杆菌的再鉴定和药敏试验[J].临床检验杂志,1-242
64株不动杆菌的再鉴定和药敏试验
中文关键词:&&
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苏州医学院附属第一医院，宜兴市和桥镇人民医院
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&&&&&&６４株不动杆菌的再鉴定和药敏试验王月娟①张险峰杨仁洪张联璧（苏州医学院附属第一医院，江苏苏州２１５００６）关键词不动杆菌耐药率不动杆菌是一种机会致病菌，可引起多种临床感染。我们对从临床标本中分离的６４株不动杆菌重新作了鉴定和药敏试验，结果如下。１材料...纸片法抗菌药物敏感实验操作标准
测定细菌在体外抗菌药物敏感性（以下称药敏试验）的试验方法很多。绝大多数临床实验室以琼脂扩散法作为常规方法测定常见的快速生长的病原菌。本文介绍的是标准纸片扩散法。本文提出的一系列建议有助于药敏试验的标准化。具体地叙述了现行推荐方法的操作步骤，及其适应性和局限性。本文还重温了国际协作研究会（ICS）的有关建议和食品药物管理局（FDA）的有关规定，并采纳了其中的有关章节。
只根据是否出现抑菌环而不考虑其大小来判断细菌对抗菌药物敏感性的试验方法，结果是不准确的。纸片扩散法试验必须遵循标准的方法学原理，并根据抑菌环与最低抑菌浓度的相关性，并结合临床上已知敏感或耐药菌株的状况进行标准化，结果才能可靠。
要得到可靠结果，必须严格地按照本文的方法进行操作。美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）下设的纸片扩散法药敏试验分委员会推荐的标准方法，以Bauer等介绍的方法为基础，是目前叙述最完整的试验方法。其中的解释标准是综合临床和实验室的数据发展而来，并得到证实。
&&&&本文介绍的是现行纸片扩散法药敏试验的操作、质量控制以及解释标准。当发现新问题并有所改进时，将并入新版本，以非正式文件补充发布。
2 做药敏试验的指证
任何细菌引起的感染均需要治疗。如果依细菌的种类不能预知其敏感性，就应做药敏试验。通常，鉴定和药敏试验是同时进行的。当致病菌属于一种对一般常用抗菌药物耐药的细菌，最需要做药敏试验。细菌耐药机制包括：产生灭活药物的酶，药物耙位改变，或药物进入细胞的方式发生变化。有些细菌的抗菌药物敏感性可以预知。当感染由一种对某高效抗菌药物敏感的细菌引起时，就不必做药敏试验（如，化脓性链球菌对青霉素专性敏感）。但对青霉素过敏的病人，分离出的化脓性链球菌也许要测一下红霉素和四环素的敏感性，以便发现有无耐药性。细菌耐药性流行病学研究及新抗菌药物的研究也需要做药敏试验。
做药敏试验，应从分离平板上挑选各种疑为致病菌的单个菌落，同时做菌种鉴定。不同菌种不可在同一平板上做混合细菌药敏试验。一般避免用临床标本（如无菌体液和尿液）直接做药敏，除非临床上急需且革兰氏染色只见到单一菌种，但随后应再以标准方法重做。对感染性质不同，标本中混有浑浊细菌或正常菌群的情况，其中的细菌也许与感染治疗关系不大，常不必做药敏，不然反会招致错误的引导。
3 常规测定药物的选择
要测定和报告给哪些药物，须与感染科医生、医院的药品委员会及感染控制委员会协商，然后由实验室制定最合适的方案。表1和表1A列出了治疗各类细菌感染有效的药物，其体外药敏试验结果也有助于感染的控制及流行病学研究。
3.1 常规报告
表1和表1A列出的抗菌药物是我们目前认为比较适合的。选药时做了多方面考虑，包括微生物学、临床药理学因素及美国FDA认可的临床适用性和疗效。
为了避免误导，给临床医生的报告应只包括治疗上有用的药物，如表1和表1A。根据情况需要，可在此基础上增减。为了积累分类学和流行病学资料也可选择用于治疗以外的药物，但结果仅限于实验室内的感染控制医生或医院感染流行学专家用，不可报给临床医生。
使用认可的名称&&
所有抗菌药物均采用官方认可的名称以避免混淆。为了强调大多数现用抗生素之间的关系，按药物的种类分组如下：
3.2.1&β－内酰胺类&&
所有β－内酰胺类药物都具有相同的中央β－内酰胺环结构，并以抑制细胞壁合成为主要作用机理。β－内酰胺环上的取代环结构或取代基决定了药物属于青霉素类、头孢烯类、碳头孢烯类、碳青霉烯类或单环类。
3.2.1.1&青霉素类&&
青霉素主要针对不产β－内酰胺酶的革兰氏阳性菌和某些娇嫩革兰氏阴性菌。酰胺类青霉素（氨苄西林和阿莫西林）和酰脲基青霉素（美洛西林和哌拉西林）对革兰氏阴性菌的抗菌范围更大，对很多假单胞菌有效。耐青霉素酶的青霉素（氯唑西林、双氯西林、假氧西林、乙氧西林和苯唑西林）主要针对革兰氏阳性菌如产青霉素酶的葡萄球菌。
3.2.1.2&β－内酰胺类/β－内酰胺酶抑制合剂类&&
这类药物由一种青霉素和一种抗菌活性小但可抑制某些β－内酰胺酶作用的物质组成合剂。目前使用的抑制剂有三种：棒酸、舒巴坦和他唑巴坦。合剂的抗菌效果不可仅靠合剂中青霉素药敏试验的结果预测。
3.2.1.3&头孢烯类（包括头孢菌素类）
3.2.1.4&碳青霉烯类&
&&碳青霉烯类药物在结构上与青霉素稍有不同，对β－内酰胺酶有更强抗水解力，对革兰氏阳性和阴性菌的抗菌谱更广。
3.2.1.5 单环类&
&单环类结构独特，仅对须氧革兰氏阴性菌有作用。目前，氨曲南是美国FDA唯一通过的单环类药物。
3.2.2&粘肽类&
&粘肽类化学结构复杂，主要抑制细胞壁合成，但作用位点不同于β－内酰胺类。这类药物主要针对革兰氏阳性菌。万古霉素主要用于治疗对青霉素过敏病人的革兰氏阳性菌感染。还用于治疗β－内酰胺类药物耐药的革兰氏阳性菌，如MSRA和某些肠球菌。
3.2.3&氨基糖苷类&&
这类药物结构类似，在核糖体水平抑制蛋白质合成。由于对氨基糖苷灭活酶的耐受性的差异，不同药物的抗菌谱也有所不同。此类药物主要治疗须氧革兰氏阳性菌感染，或主要作用于细胞壁的抗生素联合治疗某些耐药革兰氏阳性菌，如肠球菌。
3.2.4&大环内脂类&&
此类药物结构相似，在核糖体水平抑制蛋白质的合成。此类中仅有几种现仍用于测试革兰氏阳性菌或柔嫩革兰氏阳性菌。
3.2.5&四环素类&&
此类药物在核糖体水平抑制某些革兰氏阳性和阴性菌的蛋白质合成。此类药物极为相似，少有例外，常规测四环素即可。
3.2.6&喹诺酮类&&
此类药物结构相似，主要是抑制许多革兰氏阳性菌和阴性菌的DNA螺旋酶活性。各药的抗菌谱不完全一致，应分别测定。
3.2.7&磺胺类和甲氧苄氨嘧啶（TMP）&&
此类药物包括几种化疗制剂，抗菌谱相同，可抑制细菌的叶酸代谢。磺胺甲基异噁唑最常用，主要用于治疗尿路感染。药敏试验可选此药。磺胺甲基异噁唑常与TMP合用，它们分别在革兰氏阳性菌和阴性菌叶酸代谢的两个步骤中起抑制作用。
3.2.8&其他药物&&
氯霉素、克拉霉素和利福平均是抑制蛋白质合成，但彼此在结构上没有关系，均需作体外测试。呋喃妥因在核糖体水平抑制蛋白质合成，此药在体液中浓度极低，通常只用于泌尿系感染。
3.3& 选药指南
为使常规药敏试验合理，应限制测定药物的数量。表1和表1A足以满足大多数临床实验室常规工作的需要。该表按特定菌或菌群分若干组，将各种抗生素择优次序排列，供常规实验室选择。表中每格列的一组相似抗生素，疗效相似，不必重复选择。以“或”相连的药物，抗菌谱类似，表现为交叉耐药。因此，每格（一类或相关组）中的药物只需选择一种。一般，每种药物的药敏结果必须经过测定后才能报告，个别情况可以根据另外的药物的结果推测（如葡萄球菌对头孢类的结果可根据苯唑西林的结果推测）。选择的药物应与医院常用药物吻合。
3.4& 常规报告和选择性报告的原则
如表1和表1A所列，属于A组的药物，是常规首选药物，对每一特定的菌类应做相应的报告。
B组包括了临床上重要的药物，特别是对院内感染，应该作为首选药。但是，报告是有条件的：只有当A组中同类药物不敏感时才报告。其他情况还有：特定的标本（如CSF中分离的肠杆菌应测三代头孢菌素，或泌尿系菌株测TMP/SMZ）；混合感染；多部位感染；药物敏感，明显副作用，或对A组药物治疗失败；为控制感染收集流行病学指标等。
C组包括替代或后备药物，其适用的情况包括：治疗某些地方或流行性疾病，或对首选药物（特别是同类药，如β－内酰胺类或氨基糖苷类药物）多重耐药的菌株；治疗对首选药物过敏的病人；治疗不常见的菌种（如氯霉素治疗沙门氏菌或某些假单胞菌）以及为控制感染收集流行病学资料（如产杆菌测氯霉素和卡那霉素）的等。
D组包括仅限于泌尿系感染使用的药物（如呋喃妥因和有机酸类），其他部位感染的细菌无需测定。每个实验室都应决定哪些药物（表1和表1A）作为常规（A组）报告，哪些只是作为选择性报告（B组）报告，这需要与传染科医生、药品委员会及医院感染控制委员会成员共同商讨。选择性报告须有助于对该报告的理解，并促进降低由于滥用抗菌药物所造成的耐药菌增加。虽然B组药物的试验结果不作为常规报告，但是，一旦临床需要应该及时提供，或者对特定的标本作为常规报告。异常耐药应该报告，如对二线药物耐药但对一线药物敏感的现象。
4.1&Mueller-Hinton琼脂
在现有的许多培养基中，我们认为Mueller-Hinton琼脂最适合于常规敏感试验，理由是：（1）产品批间试验结果重复性好；（2）磺胺、甲氧苄氨嘧啶、四环素的抑制物含量低；（3）绝大多数致病菌生长较好；（4）大量有关敏感试验的数据是由此培养基得出的。尽管Mueller-Hinton琼脂通常是可靠的，但是偶然产品也有批间差。如果一批培养基不能很好地保证细菌生长，抑菌环则增大，超出质控范围，造成错误结果。只有按NCCLS
M6-P做过试验并符合规定的培养基才能使用。
4.1.1&制备Mueller-Hinton琼脂
制备Mueller-Hinton琼脂的步骤如下：（1）按产品说明用干粉培养基制备；（2）高压灭菌后立即放40－50℃水浴；（3）平皿置水平台上，新制备的培养基待凉后倒平板，琼脂厚度为4mm。内径14cm的平皿需要培养基约60－70ml，内径9cm平皿约需25－30ml。玻璃或塑料平皿均可使用，但平皿底应平坦；（4）待平板冷至室温，留下当日使用的，其他放入冰箱（2－8℃）保存；（5）平板许在7日内用完。如用塑料袋包裹，水份不蒸发的可适当延长使用期。过期培养基须以质控菌株按4.3节介绍的方法测定，合格者方可使用；（6）每批制备的平板，应抽样30－35℃
24小时以上，检查是否无菌。抽样的平板不可再用。
4.1.2&pH值
每批Mueller-Hinton琼脂，制备时应检查pH值。检查方法依实验室所具备的设备条件。培养基的pH值室温下应为7.2-7.4，测pH值应在琼脂凝固后进行。如果pH值偏低，某些药的活性会下降（如氨基糖苷类和大环内脂类），另一些药的活性可能会增强（如青霉素类）；如果pH值偏高，效果相反。pH值测定方法有：（1）将pH电极浸入融化的琼脂培养基中；（2）琼脂放入烧杯中融化，然后使其凝固在pH电极上；（3）使用平面电极。
4.1.3&水份
使用前，琼脂平板表面如有水份，须放恒温箱（35℃），恒温箱门半开，使水份蒸发（10－30分钟）。琼脂表面应潮湿，但不应有水珠。培养时，平皿盖上也不应有水珠。
4.1.4&胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶的作用
如培养基含有过量的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶，磺胺药和甲氧苄氨嘧啶的活力被抵消，则抑菌环较小或不清楚，甚至无抑菌环，导致假耐药的报告。购买培养基时，应注意挑选无胸腺嘧啶核苷的Mueller-Hinton琼脂。可以用标准的质控菌株粪肠球菌ATCC2测试复方磺胺的纸片，评价新批号的Mueller-Hinton琼脂。培养基上出现直径大于20mm的抑菌环为合格。不合格的培养基上不出现抑菌环、环内有细菌生长或抑菌环小于20mm。
4.1.5&二价离子的影响
二价离子，主要是镁和钙离子，影响四环素、多粘菌素、氨基糖苷类药物对绿脓假单胞菌的测定结果。阳离子过量抑菌环变小，浓度过低抑菌环增大。锌离子可影响羧基青霉素的结果。每批培养基都应测试，看是否符合表3的质量控制要求。应细致观察质控菌株的测定结果，观察是否有由培养基引起的误差。
4.1.6&被测菌株生长不好的解决办法
只有能够在未强化的Mueller-Hinton琼脂培养基上生长良好的须氧菌或兼性厌氧菌才能在此培养基上做药敏试验。某些娇嫩细菌，如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、β溶血链球菌在未强化的Mueller-Hinton琼脂培养基上生长不良。这类细菌，需用经强化或另外的培养基，具体做法见第六节。（另见表4）
4.2&药敏纸片的保存
药敏纸片应注意保存在干燥环境。按下法保存：（1）在8℃以下保存，或－14℃以下冷冻保存。β－内酰胺类药的纸片应密封冷冻保存，仅取少量作为日常使用，在冰箱里保存约一周。有些不稳定的抗生素（如头孢拉定、棒酸合剂）须冷冻保存，用时取出；（2）纸片应在使用前1－2小时从冰箱取出，暖至室温再打开，以避免出现冷凝水；（3）纸片启封后应放入可密封的有干燥剂的容器中；（4）纸片只能在有效期内使用，过期应弃去。
4.3&标准比浊管
用硫酸钡比浊管（0.5麦氏比浊标准），标定接种菌液浓度。比浊管制备方法如下：（1）0.048mol/L
BaCl2，（1.175% w/v
BaCl2·2H2O）0.5ml，加到99.5ml的0.18
mol/L（0.36N）H2SO4（1％v/v）溶液中，制成比浊管；（2）用光径为1cm的分光光度计测定光吸收来标定比浊管。0.5麦氏标准比浊管在625nm波长的吸收光度应为0.08-0.1；（3）选管径与制备菌液试管相同的螺口试管，每管分装4－6ml；（4）将试管帽拧紧，放室温暗处保存；（5）用前，将比浊管在旋转振荡器上混匀。如出现大颗粒，应更换；（6）每个月更换比浊管或复检比浊管的浊度。
5&操作步骤
5.1&制备接种菌液
5.1.1&增菌法&
步骤如下：（1）选琼脂平板上形态相同的菌落至少4－5个，用接种环挑其顶部，移至4－5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中；（2）置35℃培养至菌液浓度达到或超过比浊管浓度（一般需2－6小时），浓度约1－2&108CFU/ml；（3）用生理盐水或肉汤校正菌液浓度，与比浊管相同。可用光电比浊。目测比浊须在适当光照下以黑色线条为反衬。
5.1.2&直接菌悬液法&
步骤如下：（1）做常规药敏试验，可直接用过夜培养的菌落（必须用无选择性培养基平板，如普通琼脂培养基）在盐水或肉汤中制备接种菌液。菌液浓度调至0.5麦氏管；(2)此法适用于在肉汤培养基中生长不好的细菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和链球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐药试验；（3）当用此法做复方磺胺药的试验时，从平板上直接挑菌落时会携带相当量的拮抗剂，造成敏感菌株的抑菌环内出现轻微的生长菌膜。
5.2&接种平板&
步骤如下：（1）校正的菌液须在15分钟内使用。用一无菌棉试子蘸取菌液并在上端管壁旋转挤压几次，去掉过多的菌液；（2）用试子涂布整个琼脂平板表面，反复涂布几次，每次将平皿旋转60度，保证涂布均匀。（3）将平皿盖打开3－5分钟，使培养基表面的水份吸收掉。然后贴药敏纸片；（4）注意：避免用过浓的菌液，禁用未经稀释菌或其他不标准菌液接种平板。
5.3& 贴纸片&
（1）接种平板后，贴上药敏纸片。用镊子或针尖压一下纸片使其与培养基表面贴牢。纸片要贴得均匀，纸片与纸片中心距离不得小于24mm。原则上，直径150mm得平板贴12张纸片，直径100mm平板贴5张纸片。纸片贴后不应再移动，因为有些药物会立即扩散；（2）贴上纸片15分钟内，须把平板倒放在35℃恒温箱中。因为抑菌环解释标准是在普通环境中标定的，所以除嗜血杆菌和淋病奈瑟氏菌外，平板不可放在高CO2的环境中。CO2与某些因素作用可使抑菌环增大。
（1）经16－18小时培养后，观察结果。菌液浓度适合且涂得好，抑菌环规则，细菌呈融合生长。如果出现单个菌落，说明接种量小，需重做试验，测量抑菌环直径须包含纸片直径：手持平皿从背面目测检查每快平板，借反射光（黑色无放光背景），用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌环直径，单位为毫米。培养基中如果加了血液，须打开平皿盖，借反射光，从正面量抑菌环。如果是葡萄球菌或肠球菌，须培养24小时后，经投射光检查苯唑青霉素和万古霉素的抑菌环内有无耐药菌株的生长。抑菌环内有任何生长的表现都表明是耐药菌株。（2）肉眼见不到细菌明显生长的区域为抑菌环边缘，有很难辨认的细小菌落不算。如抑菌环内有大量细菌生长，须再移植出来，重新鉴定，重新做药敏试验。变形菌在某些抗菌药物纸片周围可弥漫生长到抑菌的区域内，当抑菌环边缘清楚，弥漫生长不算。甲氧苄氨嘧啶和磺胺药的拮抗剂会支持细菌生长，因而测这类药时可忽略轻微生长（80％以上受抑制），以浓密生长的区域作为抑菌环的界限。用加血的培养基测链球菌，测量抑菌环时不包括溶血环。（3）参照表2的标准对抑菌环的大小作出解释，以敏感、中介或耐药的形式解释结果。
6& 娇嫩细菌
Mueller-Hinton培养基只适用于快速生长的细菌，一般不适于测定娇嫩细菌。娇嫩细菌的药敏试验如果要用纸片法做，培养基、质量控制方法、解释标准都须做修改以适合每种细菌。以下介绍的纸片方法用于流感嗜血杆菌，淋病奈瑟氏菌和肺炎链球菌等娇嫩细菌，结果是准确的。其他细菌须用稀释法测定。厌氧菌不能用纸片扩散法测定抗菌药物敏感性。
6.1& 嗜血杆菌
纸片扩散法试验适用的培养基称为：嗜血杆菌试验培养基（HTM），配方如下：（1）Mueller-Hinton琼脂；（2）15μg/mlNAD；（3）15μg/ml牛血红素；（4）5μg/ml酵母粉；（5）pH7.2-7.4；配制HTM，先配制血红素贮存液：50mg血红素加到100ml
0.01M热NaOH液中，搅拌至粉末完全融解。此贮存液30ml加入到1000mlM-H琼脂中，再加入5g酵母粉。高压灭菌，冷却后，加入3mlNAD贮存液（50mgNAD溶于10ml蒸馏水，过滤除菌）。不能用巧克力M-H琼脂做嗜血杆菌的药敏试验。
操作步骤&&
用过夜培养的巧克力平板上的菌落制备接种菌液，操作如下：（1）直接用过夜培养的巧克力平板上的菌落在M-H肉汤或生理盐水中调制菌悬液，用光度仪与0.5麦氏比浊管比浊，校正浓度。合格的菌液浓度为：1－4&108CFU/ml。制备菌液应特别注意，菌液浓度过高可导致出现对某些β－内酰胺类药物的假耐药结果，特别是某些产β－内酰胺酶的流感嗜血杆菌。菌液须在15分钟内使用。（2）其他步骤按5.2操作，不同处在于：直径150mm平板至多贴9张纸片。（3）平板放5－7％CO2环境，35℃过夜孵育16－18小时，测量抑菌环直径。
抑菌环解释标准&&&
嗜血杆菌应测的药物浓度见表1A，按表2A列出的抑菌环解释标准判定结果。除此之外无需测定其他药物。
6.2& 淋病奈瑟氏菌
测定淋病奈瑟氏菌的标准培养基是加有1％添加剂的GC琼脂，不必补充其他添加剂，也不能用强化的巧克力琼脂。
（1）直接用过夜培养的巧克力平板上的菌液在M-H肉汤或生理盐水中调至菌悬液，用光度仪与0.5麦氏比浊管比浊，校正浓度。菌液须在15分钟内使用。（2）其他步骤按5.2操作，不同之处在于：直径150mm平板至多贴9张纸片，100mm平板至多贴4张。（3）平板放5－7％CO2环境35℃孵育20－24小时后，测量抑菌环直径。
抑菌环解释标准&&淋病奈瑟氏菌应测的药物见表1A，按表2B列出的抑菌环解释标准判断结果。除此之外无需测其他药物。
注：在10U青霉素纸片周围产生的抑菌环≤19mm的菌株，一般均产生β－内酰胺酶。确认这种由质粒决定的耐药性菌株，应当做β－内酰胺酶试验。质粒决定的对四环素耐药的菌株，抑菌环直径≤19mm（30μg四环素纸片）。此外，由染色体决定的对青霉素和四环素耐药的菌株所产生的抑菌环较大，解释标准见表2B。
6.3& 肺炎链球菌和其他链球菌
培养基&&&用加5％脱纤维羊血的M-H琼脂做肺炎链球菌和其他链球菌的药敏试验。
（1）直接用过夜培养的血平板上的菌落在M-H肉汤或生理盐水中调制菌悬液，用光度仪与0.5麦氏比浊管比浊，校正浓度。菌液须在15分钟内使用。（2）其他步骤按5.2操作，不同处在于：直径150mm平板至多贴9张纸片，100mm平板至多贴4张。（3）平板放5％CO2环境35℃孵育20－24小时后，测量抑菌环直径。
抑菌环解释标准&
肺炎链球菌和其他链球菌应测的药物见表1A，按表2C列出的抑菌环解释标准判定结果。
注：对青霉素敏感的菌株，苯唑西林抑菌环直径≥20mm。耐药和相对耐药的菌株抑菌环直径≤19mm，不能报告对青霉素耐药或中度耐药，须测MIC。苯唑西林药敏结果只能推测肺炎链球菌对青霉素的药敏，不能推测其他链球菌对青霉素的药敏。从无菌部位（如脑脊液、血液、骨髓等）分离的草绿色链球菌须测青霉素MIC。草绿色链球菌的青霉素药敏试验不能用纸片法。
甲氧苯青霉素耐药的葡萄球菌&&&
仍有不少实验室在检测MRS时会遇到问题，为了更好检出这种菌株，需了解以下几点：（1）用苯唑西林纸片而不是甲氧西林或乙氧西林。因此，用1μg苯唑西林纸片检测甲氧西林/苯唑西林的耐药性。（2）直接用菌悬液法（5.1.2）接种。（3）检测MRS必须在35℃孵育满24小时（而不是16－18小时）。（4）借透射光仔细检查苯唑西林纸片周围抑菌环内有无细小菌落或轻微弥漫生长。（5）MRS通常对多种抗生素耐药，包括β－内酰胺类、氨基糖苷类、大环内脂类、氯霉素类和四环素类。了解是否多重耐药有助于推测对甲氧西林耐药性。（6）如果纸片法结果有疑问，需以筛选试验验证。（7）甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌对所有头孢菌素类和β－内酰胺类如阿莫西林/棒酸、阿莫西林/舒巴坦和依米配能耐药，无论体外试验结果如何。因为，至今的文献报道，β－内酰胺类药物治疗甲氧西林耐药的感染效果很差，几乎没有治疗成功的资料。
6.5& 耐药肠球菌
青霉素/氨苄西林药敏试验&&&
肠球菌对青霉素和氨苄西林耐药系因为产生低亲和力的青霉素结合蛋白（PBPs），个别菌株是由于产生β－内酰胺酶。纸片法药敏试验可准确测定PBPs改变的菌株，但对产β－内酰胺酶的菌株结果不可靠。此类菌株应测β－内酰胺酶。
万古霉素药敏试验&
肠球菌的纸片法万古霉素药敏试验，平板必须孵育24小时（而不是16－18小时），借投射光仔细检查抑菌环内有无小菌落或弥漫生长。纸片法结果为中介度时应测MIC.
氨基糖苷类高水平耐药试验&&&
对氨基糖苷类药物高水平耐药，可提示不能用青霉素或粘肽类与氨基糖苷类联合用药治疗肠球菌的感染。用高浓度庆大霉素（120μg）和链霉素（300μg）纸片筛选这类耐药菌株。无抑菌环为耐药，抑菌环≥10mm为非高水平耐药。抑菌环在7－9mm之间再用稀释法筛选试验测定。特殊高浓度纸片的质控见表3。不必测其他氨基糖苷类药物，因为没有比庆大霉素或链霉素更强的同类药。
测定产超广谱β－内酰胺酶的革兰氏阳性杆菌&&&
超广谱β－内酰胺酶（ESBLs）是新认识的一类由质粒介导的β－内酰胺酶，如TEM-1、TEM-2、SHV-1。ESBLS导致肺炎克雷白氏菌、产酸克雷白氏菌、大肠埃希氏菌和另外几种肠杆菌出现对头孢三嗪、头孢他啶、氨曲南和广谱青霉素类及结构相关的β－内酰胺类药物的耐药。某些ESBLs导致高水平耐药，须用纸片法检测。另有低水平耐药株或只能用某个β－内酰胺类药才能测出来。这类菌株的MIC达不到NCCLS规定的耐药分界点，但临床治疗无效。克雷白氏菌和大肠埃希氏菌的临床分离株如果对博拿霉素、头孢他啶、氨曲南、头孢胺噻肟或头孢三嗪的抑菌环减小，提示具有ESBL。细菌产生ESBL时，加入棒酸，抑菌环增大。ESBL测定的可靠方法尚在研究中。目前可参考表1和表4。
7& β－内酰胺酶试验
目的&&对嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和卡他莫拉氏菌，快速β－内酰胺酶试验比纸片法药敏试验的结果快。对产β－内酰胺酶的肠球菌，这是唯一可靠方法。
β－内酰胺酶试验阳性可推测：（1）淋病奈瑟氏菌、嗜血杆菌、卡他布兰汉氏菌对青霉素、氨苄青霉素和羟氨苄青霉素的耐药；（2）葡萄球菌对青霉素及氨基、羧基和酰尿基青霉素类药物的耐药性。
β－内酰胺酶试验阴性不排除由其他耐药机制引起的耐药。不要测肠杆菌、假单胞菌和其他须氧革兰氏阴性菌的β－内酰胺酶，因为其结果不能预测临床治疗效果。
7.2&β－内酰胺酶试验方法的选择&&
以Nitrocefin为基质的方法测定淋病奈瑟氏菌、嗜血杆菌和卡他布兰汉氏菌、葡萄球菌及肠球菌，结果可靠。酸法青霉素酶试验用于测嗜血杆菌，淋病奈瑟氏菌和葡萄球菌结果可靠。碘法可用于淋病奈瑟氏菌，但卡他布兰氏菌只能用Nitrocefin方法。葡萄球菌β－内酰胺酶需要诱导，须在Nitrocefin培养基孵育1小时。简便的诱导方法是从苯唑西林纸片抑制环边缘挑菌落。只有操作必须仔细结果才能准确，试验时必须同时做阳性和或阴性对照。
8& 结果解释
抑菌环解释标准&&抑菌环解释标准见表2、2A、2B和2C。表中所列的敏感类别首先是经过将抑菌环直径与肉汤或平板稀释法测定的最低抑菌浓度（MIC）进行比较，并且根据已知敏感和抗菌株的抑菌环或MIC的群体分布得出的。然后再结合MIC与抑菌环直径的相关分布，结合药物常用剂量的临床药物代谢动力学关系进行分析。最终还要结合临床的治疗效果对体外试验和药理的数据做综合评价。
8.2& 敏感度分级
表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效。禁忌症除外。
指MIC接近药物的血液浓度或组织液浓度疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量（如β－内酰胺类药物）被抑制，或在药物生理性浓集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介还表示“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释（如某菌种极少对某药物敏感或抑菌环完全不会在此测定范围内，或培养基的差异影响了药物，或药物的中毒界限很窄）。
被测菌定为耐药是指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理（如β－内酰胺酶），所以临床治疗效果不佳。
8.3&&与敏感度相关的MIC分界点&&
抑菌环直径与用标准方法（一般指肉汤稀释法）测得的MIC呈负相关。表2，2A，2B和2C列出与抑菌环敏感度分界点相关的MIC分界点。这些与抑菌环直径相对应的MIC分界点是根据抑菌环和MIC相关性的研究，以及药物代谢动力学和临床疗效的分析，并且与NCCLS
M7标准（Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibiity Tests for
Bacteria that Grow
Aerobically）所定的MIC分界点相似得出的。然而，由于方法学上和原始数据方面的差异，会存在偶然的细小差别。
9& 质量控制方法
目的&&质控的目的是监测以下几个方面：（1）药敏试验操作的精确度与准确度。（2）试验中试剂的情况。（3）操作者的工作情况。使用遗传上稳定的参考菌株即可达到上述目的。
为了控制药敏试验的精确度和准确度，须从可靠来源获得指控菌株。质控菌株如下：（1）大肠埃希氏菌 ATCC 25922
，(2)大肠埃希氏菌 ATCC 35218，（3）绿脓假单胞菌 ATCC 27853,(4)金黄色葡萄球菌 ATCC
25923，（5）粪肠球菌 ATCC 29212，（6）流感嗜血杆菌 ATCC 49247(用于表3A的HTM)，（7）流感嗜血杆菌
ATCC 49766（用于表3A的HTM），（8）淋病奈瑟氏菌ATCC 49226（用于表3B的GC琼脂），（9）肺炎链球菌 ATCC
49619(用于表3C的羊血M-H琼脂)。
&&& 大肠埃希氏菌
ATCC 35218仅用于β－内酰胺酶抑制剂合剂的质控。粪肠球菌ATCC 29212（或ATCC
33186）用于测试培养基中磺胺抑制剂的水平。粪肠球菌ATCC 29212还用于高浓度庆大霉素纸片的质控。
质控菌株测试和保存方法如下：
（1）须用与临床分离菌所用相同的抗生素测试质控菌株。
（2）日常用的质控菌株在大豆酪蛋白消化液琼脂（M-H琼脂）上（普通菌株）或强化的巧克力琼脂上（娇嫩细菌）4-8℃保存，每周传代一次，如具备有长期保存的条件最好长期保存。用适当的保护剂，如50%小牛血清肉汤或脱纤维羊血，在-20℃以下保存。以上方法都不会改变细菌的抗菌药物敏感性。
（3）日常使用的质控菌株应至少一个月更换一次，由冻干保存菌种移种或购买新菌种。
（4）测定时，先将菌种接种肉汤，孵育4-18小时，然后划种平板，得到单个菌落。
（5）按推荐的方法，挑取菌落，制备接种菌液。
（6）用这种质控菌株测出的抑菌环平均值如未出现明显差异，该菌株就可以继续用来监测准确度和精确度。如平均直径有明显改变，且该差异不可能是由方法学造成的，表示质控菌株污染或敏感性发生变异，此时应更换新菌株。
9.3& 抑菌环质量控制界限
表3，3A，3B和3C列出了一个质控结果允许出现的最大和最小抑菌环直径。一般情况下，每20个测定结果只允许有一个失控(即，超出列表中所列的准确度控制范围)。20个连续测定中任何多于一个以上的失控结果都必须对操作进行修正（如，一旦出现第二个失控结果，马上修正）。另外，如果一个质控结果超过质量控制界限范围中间值上下四个标准差范围时也必须进行修正。修正后，继续观察连续20次测定的结果。
注意：本节指的是失控情况下如何处理，务必不要与在实验条件稳定时所进行的一周一次的质量控制项混淆（见9.43节）。
9.4& 质控测定的次数
每批新的M-H琼脂或新的抗菌药物纸片必须用质控菌株检测。质控菌株每天与常规工作一起测定，来检测整个操作过程。只有在实验结果合乎要求后，才能减少检测次数。通过以下几个方面可以判断实验是否符合要求。（1）同常规标本一起连续测定质控菌株30天。（2）每种药物对每种细菌，30个抑菌环中（如一个药物对一种细菌的连续30天测定结果），超出表3所给的范围的应不多于3个。
注意：本过程是为了建立稳定的制片扩散法药敏试验的质量控制方法，以达到最终可以进行每周监测一次的目的，务必不要与9.3节中有关失控进行修正的措施相混淆。
达到以上要求，以后每周至少应测一次。如果试剂有变动，须连续监测。每周监测一次时，如发现有不符合要求的结果，应立即改为每日监测，寻找原因以便解决。按下法查找原因：(1)连续5天测定质控菌株。（2）每种药物对每种细菌，所测的这5个抑菌环不得超出表3的准确度范围。每种药物对每种细菌，连续测定的这5个抑菌环的范围不应超出表3，3A，3B和3C的精确度范围。
如果达不到上述要求（只要有一个抑菌环直径超出准确度范围或抑菌环范围大于精确度所允许的范围），必须连续进行每日监测。只有在以后连续测定了30次质控菌株且结果合格后才可以改为每周监测。
产生误差常见的原因&
只要有一次质控结果超出表3，3A，3B和3C的允许范围，应从以下诸方面查找原因。（1）记录质控结果有无笔误；（2）测量抑菌环时是否读错；（3）质控菌株污染或有其他改变；（4）接种菌液过浓或过淡；（5）比浊管没有混匀；（6）孵育温度或孵育环境不对；（7）M-H琼脂有批间差——每批培养基用前应鉴定；（8）药敏纸片在保存和使用中是否失效。
一旦发现结果失控，先再仔细检查一下平板，往往很容易解决。如果找不出明显的操作失误，就必须连续5天，每天测定质控菌株。当这连续5个结果均在允许的准确度范围且所有值都不大于允许的精确度最大范围，则可改行每周监测。但只要有一个抑菌环超出准确度范围或精密度允许范围，就必须做每日监测。直到当按9.4节方法另做了30次质控并达到要求后，才可以恢复每周监测。
10& 方法的局限性
对各类细菌的适用性&&
本文介绍纸片方法是由快速生长的致病菌标定的，菌株包括肠杆菌科、葡萄球菌、肠球菌、绿脓假单胞菌、不动杆菌。经适当改动可用来测定嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和链球菌。对那些未在表中列出的细菌，如使用的培养基不同、孵育环境不同或生长率不同等，尚没有重复性好的标准方法。这类细菌的实验结果不易解释，不应用纸片法测定。
易引起误导的结果&
当用某些抗生素测试某特定细菌时，可能出现严重的误导，主要包括以下几种情况（但不限于这几种）：第一、第二代头孢菌素和氨基糖苷类测沙门氏菌和志贺氏菌；所有β－内酰胺类抗生素（除了苯唑西林、甲氧西林和乙氧西林）测耐甲氧西林葡萄球菌；头孢菌素、氨基糖苷类（除了高水平耐药试验）、林可霉素和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异恶唑测肠球菌；头孢菌素测李斯特菌。
出现抗药性&&
长期使用某些抗生素治疗，可出现抗药性。所以，开始敏感的菌株可能在开始治疗3到4天内便耐药。肠杆菌、枸橼酸杆菌和沙雷氏菌对三代头孢菌素，铜绿假单胞菌对所有抗生素，葡萄球菌对喹诺酮类常出现这种情况。
质量保证措施&&
须用本标准介绍的质量保证方法监测各种试验参数。质控结果合格并不能保证每个病人的结果都准确。当病人分离菌株有非典型或不一致结果时，应重复试验和重鉴定，以确保结果准确。每个实验室应该制定相应的措施，确认非典型药敏实验结果准确性。
肠杆菌科抑菌环解释标准和相应MIC分界点
抑菌环直径，精确到mm
相应MIC分界点（μg/ml）
内酰胺/内酰胺抑制剂
阿莫西林/棒酸
氨苄西林/舒巴坦
哌拉西林/单菌胺
替卡西林/棒酸
头孢烯类（包括头孢菌素、头霉素、碳头孢烯类和氧头孢烯类）
头孢呋辛钠
羟羧氧酰胺菌素
头孢他美脂
碳青霉素类
氨基糖苷类
minocyclin
1.25/23.75μg
250或300μg
绿脓假单胞菌（绿脓杆菌）和不动杆菌抑菌环解释标准和MIC分界点
抑菌环直径，精确到mm
相应MIC分界点（μg/ml）
测绿脓假单胞菌
测不动杆菌
测绿脓假单胞菌
测不动杆菌
测绿脓假单胞菌
测不动杆菌
测绿脓假单胞菌
测不动杆菌
测绿脓假单胞菌
内酰胺/内酰胺抑制剂
氨苄西林/舒巴坦
哌拉西林/他佐巴坦
测绿脓假单胞菌
哌拉西林/他佐巴坦
测不动杆菌
替卡西林/棒酸
测绿脓假单胞菌
替卡西林/棒酸
测不动杆菌
头孢烯类（包括头孢菌素、头霉素、碳头孢烯类和氧头孢烯类）
羟羧氧酰胺菌素
碳青霉素类
氨基糖苷类
minocyclin
1.25/23.75μg
250或300μg
葡萄球菌抑菌环解释标准和MIC分界点
抑菌环直径，精确到mm
相应MIC分界点（μg/ml）
苯唑青霉素
内酰胺/内酰胺抑制剂
阿莫西林/棒酸
氨苄西林/舒巴坦
哌拉西林/他佐巴坦
替卡西林/棒酸
头孢烯类（包括头孢菌素、头霉素、碳头孢烯类和氧头孢烯类）
头孢呋辛（口服）
头孢呋辛钠（静脉）
羟羧氧酰胺菌素
碳青霉素类
氨基糖苷类
minocyclin
大环内酯类
1.25/23.75μg
氯林可霉素
250或300μg
表3 非娇嫩细菌的抑菌环质量控制范围
大肠埃希氏菌
金黄色葡萄球菌ATCC25923
绿脓假单胞菌
大肠埃希氏菌
阿莫西林/棒酸
氨苄西林/舒巴坦
阿奇红霉素
头孢他美酯
clinafloxacin
doxycycline
minocycline
羟羧氧酰胺菌素
哌拉西林/他佐吧坦
sulfisoxzole
250/300μg
替卡西林/棒酸
1.25/23.75μg
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