痰诱导细胞学正常参考值
痰诱导细胞学正常参考值
痰诱导细胞学正常值篇一：痰细胞学的报告语言与标准 痰细胞学的报告语言与标准
痰中查癌细胞是一种非损伤性和有价值的肺癌检查方法。与其他部位的细胞学检查不同的是痰细胞学并不检查癌前病变，而主要为检出恶性肿瘤细胞或癌细胞，因为癌前病变的细胞不易脱落和随痰排出体外。
为提高痰检的敏感度，必须从咳痰、送检到涂片、镜检等各方面进行质量控制。
1 痰标本的收集和标本制作 1.1 咳痰：最好是晨痰。嘱病人吐尽口水，用力从肺内咳出，可以多咳几次。口水痰和鼻吸痰是无用痰，其中的细胞不能表达肺部肿瘤的诊断意义。有些医院采用雾化吸入诱咳采痰.也有在支气管镜检查后取痰的. 1.2 痰的收集和送检：咳痰时最好有医护人员在现场，指导病人正确咳痰。肉眼观察痰液是否合格：粘性有灰白色物样痰、陈旧性血丝样痰、脓性痰及无粘性坏死样痰等为合格痰。痰量不限，一次送痰一般1－3口痰。盛痰的痰合采用直径大于7cm以上的一次性培养皿式痰盒，其内应干糙无水分。注意不能采用盛药物的瓶子。痰液收集好以后应立即送检，以保持标本新鲜，切忌久置不送或痰液干燥后再送。一般收集后一小时内送检。每次检查连续送检三次。送检前应在标本盒上做好标记。液基薄层制片技术的标本可直接咳入专用的细胞保存液中送检.支气管镜检查后几小时内痰,必须标明.可以采用各种化黏液剂。 1.3 接收标本：在接到标本后应立即验明送检单与标本合上的标记（姓名、床号、科别等）是否一致？若不一致，应立即电话告知临床科室核对。 1.4 痰液标本的大体观察：痰液标本接收后应立即处理制片。先观察标本形状及颜色。用3X倍率放大镜仔细观察粘液中物质的情况并详细记录。 1.5 制片：轻轻拨开痰液并用镊子取出灰白色或陈旧型血丝部分进行涂片，若太厚则用另一张玻片贴压涂两张片，操作必须细致。涂好后立即投入固定液中固定，不能久置干燥。剩余标本及盛具置1％过氧乙酸液中进行处理,不得置于生活垃圾中或置于水池中处理。在制片和处理标本过程中，操作者须要有一定的保护措施，如戴口罩和手套等。 1.6 镜检：全面细致的观察涂片每一视野，不能有死角。在发现有坏死及异型细胞的视野时应沿粘液丝走向展开观察，这样可以节约镜检时间。好的标本中应该有吞噬细胞,而鳞状细胞较少.后者的出现代表大多数情况下是口腔上皮的出现。坏死的出现意味着结核或鳞状细胞癌的可能,提示寻找进一步的证据。影细胞的形态表现,可以分辨是何种细胞;若是淋巴细胞的影细胞,可能是结核；若是多边形影细胞,则可能是鳞状细胞癌;若是小圆细胞的影细胞,则可能还有深染的未分化癌细胞。腺癌细胞大多数有团状结构,腺样结构,菊形结构,梁状结构或球型结构等。要注意咽喉部的化生细胞,其核有时深染并有畸形,有可能误为鳞状细胞癌的细胞表现。 1.7 核对：发报告前应核对报告单、送检单及片号是否一致，诊断结果与病史、体征等实际情况是否一致，杜绝差错及张冠李戴的现象发生。报告发后还应随访，与最后的结果对照。
2 描述性报告
2.1 标本满意度评估
2.1.1 满意标本
2.1.2 不满意标本，不能作出诊断意见。
2.2 阴性 2.3 异常细胞或异常线索:
2.3.1 发现异常线索
2.3.2 发现异常细胞，但不能肯定恶性
2.4 发现癌细胞
2.4.1 发现癌细胞，但不能肯定类型
2.4.2 发现癌细胞，类型为：
2.4.2.1 鳞状细胞癌
2.4.2.2 腺癌
2.4.2.3 小细胞未分化癌
2.4.2.4 其他
2 痰细胞学报告语言(描述性语言)
2.1 标本满意度评估
2.1.1 满意标本:细胞成分多,有吞噬细胞,口腔鳞状细胞(成熟表层鳞状细胞)少见,可见黏液。阳性者可见较多量的异型细胞。染色佳,固定效果好,细胞核染色质结构清晰。
2.1.2 不满意标本：涂片中缺乏吞噬细胞或量少,口腔鳞状细胞(成熟表层鳞状细胞)多见,黏液少见或无,细胞干燥,固定和染色效果差,或涂片无标记,不能确认是患者的标本。不满意标本不能作出诊断意见。
以上评估必须写入报告中,以便及时将标本满意度信息反馈给临床医师。 痰涂片中所见的鳞状细胞癌、腺癌和小细胞未分化癌
2.2 阴性：细胞学阴性是指镜下涂片中未见恶性改变或具异型性的细胞,并不代表该病人未患恶性疾病或病人完全正常。细菌/真菌等微项目可根据感染情况由诊断医师决定是否报告。若发现干酪样坏死、上皮样细胞或多核巨细胞等，须提示特殊染色染查找结核菌。（图）
2.3 异常细胞或异常线索:
2.3.1 发现异常线索：凝固性坏死或多边形、小圆形“影细胞”等。（图）
2.3.2 发现异常细胞，但不能肯定恶性：有分化好的成片腺细胞，无明显异型性；有分化好的、核胞质比例轻度异常、核深染和核有异型性的角化型鳞状细胞；少量深染和染色不均的小裸核状细胞。（图）
以上判断必须是在全面阅片的基础上未再发现更进一步的恶性变化后，才能作出的诊断。
2.4 发现癌细胞
2.4.1 发现癌细胞，但不能肯定类型（图）
有一些病例由于痰液中细胞的数量少,或在制片过程中未能将多数有效成份涂于在玻片上,或染色不佳而不能完全判断,或肿瘤细胞分化差而细胞表现不典型等,不能明确判断的类型,仅能确定其恶性性质,此种情况应建议进一步检查.
2.4.2 发现癌细胞，类型为：
2.4.2.1 鳞状细胞癌:细胞的形状和大小差别很大,从圆形、多边形或梭形,到奇形怪状的细胞,这其中有纤维形,蛇形和蝌蚪形等,这些细胞以散在分布为主,可以三五成群.大小方面以小细胞为主,虽小但也有大小不一。细胞核有明显的畸形改变,深染如墨炭状,极少见核仁或核仁不清.胞质丰富,常染为深伊红或桔红色,而非角化型癌细胞则染为浅蓝色或绿色.涂片中除癌细胞外,常伴有坏死或外形似鳞状细胞的影细胞,文献称”鬼影细胞”。这些常成为进一步寻找癌细胞的证据.另外有时可见细胞封入,被称为”鸟眼细胞”,常为恶性的证据之一。
鉴别诊断:咽喉部的感染可引起喉部化生细胞的提前角化,这种细胞体积小,胞质红染,核有轻度增大,与角化型癌细胞很相似,由巴氏在自己的痰液中发现,故被命名为巴氏细胞。（图）
2.4.2.2 腺癌:痰液中腺癌细胞常以成团的形式出现，细胞团外周呈圆弧状膨出，单个细胞很少游离出现；细胞为圆形或卵圆形，胞质量较少，着色较淡或嗜碱性，有时可见胞质中有空泡；细胞核大而饱满，核染质呈粗颗粒多中心稀疏分布，核膜略有畸形，核仁肥大而显著，可有嗜酸。核位偏在。（图）
支气管腺癌成团的细胞可呈腺样、球形、梁状和乳头状等，每个细胞团中的细胞数较多，一般为十数个到数十个细胞紧密重叠。支气管肺泡细胞癌则以小球形或小团状出现，每个细胞团有数个或十数个细胞，胞质嗜酸红染。细胞的异形往往不如其他腺癌的异型性明显。当然仅靠细胞学是不能确定肺泡细胞癌的，只能用来定性或提示进一步进行电镜观察。（图）2.4.2.3 小细胞未分化癌:癌细胞体积小是其特点，细胞以散在分布为主，也可以呈小簇状或小团状出现。散在的细胞由痰中黏液在涂片时的带状嗜碱性黏液中形成队列式排列，文献中描述为印地安队列式（美国早期西部片中的印地安人的马队，单列数行式奔跑），细胞由于黏液的拉长而略有变形。细胞间可见有连接结构，数个细胞可构成镶嵌样结构，即细胞间有等距离空白区，说明癌细胞是有胞质的，由于着色淡而显示无胞质样。癌细胞核染质呈灰尘状，可有小的核仁或核仁不明显。在液基薄层片中，细胞表现为小圆形、三五成群或散在分布于涂片中，在细胞少时很易漏诊。（图）
2.4.2.4 其他
除上述类型的癌细胞外，痰涂片中还可以发现如下的肿瘤细胞：
转移性的各种上皮性恶性肿瘤，如食管鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌等，除了上述分类外，还要一个有原发癌病理结果的病史和细胞学特征，才能提示有可能为转移癌的信息。若无此病史，则作描述性分析。（图）
恶性黑色素瘤的肺转移较常见，如果恶性肿瘤细胞质中发现黑色素，诊断就较容易，但还必须与尘细胞鉴别，诊断时也要注意肿瘤病史。（图）
肺的原发性恶性淋巴瘤或肺门淋巴瘤牵涉到肺的情况虽然很少见，但不是不可见，偶然的例子也发生于痰涂片中，该瘤的提示必须在除外常见的小细胞未分化癌的基础上，后者也是小圆细胞，有时两者很难鉴别，诊断者还必须有淋巴瘤细胞病理学的诊断经验。（图）
肉瘤的肺转移是乎很常见，但痰液涂片中却很少被检出，其原因尚不明了，偶然的例子也许会出现，经验还需积累。只要发现与上皮性肿瘤有明显的不同，并有间叶肿瘤的细胞病理学诊断经验，应当有所发现。（图）
参考文献（略）细胞学涂片中所见的Langhan?s细胞：痰、支气管镜刷检手工涂片、支气管镜刷检液基涂片。痰诱导细胞学正常参考值篇二：痰诱导方法-汇总 诱导痰检测的方法学及其在气道炎症评价中的应用 罗炜 综述 赖克方 钟南山 审校 【摘要】 气道炎症在哮喘、慢性支气管炎和间质性肺炎等一系列疾病中扮演着重要的角色，而且被认为是导致气道结构改变的主要因素之一。诱导痰检测作为一种无创、安全和可靠的气道炎症评价方法正日益受到重视和利用。 关键词? 诱导痰；气道炎症；哮喘；慢性阻塞性肺部疾病
气道炎症在哮喘、慢性支气管炎和间质性肺炎等一系列疾病中扮演着重要的角色，而且是导致气道结构改变的主要因素之一。气道炎症的评估对于研究气道疾病的发病机制起着重要作用。而且，能发现无临床症状、无气道高反应性和肺功能正常的早期气道疾病[1]。以往，气道炎症通常用纤维支气管镜取材进行评价，但由于其属于有创检查，难以重复进行，使其应用受到限制[2]。 痰液检查已经有100多年的，最初主要用于肺结核和肺肿瘤的诊断。未经处理的痰液涂片，细胞分布不均，而且混在粘液中不易识别，使痰细胞学检查的准确性受到影响。1958年Bickerman 等[3]首次建立了诱导痰检测方法，对不能自然咳痰的患者进行高渗盐水雾化获得痰液，利用二硫苏糖醇（DTT）等粘液溶解剂对痰进行处理，消除粘液的影响。1992年Pin等[4] 首先开始用诱导痰分析哮喘患者的气道炎症状况。近年来，诱导痰检测作为一种无创、安全和可靠的气道炎症评价方法正日益受到重视。下面就诱导痰检测的方法学及其在气道炎症评价的应用作一综述。 1? 方法学 在Pin和Fahy两种方案[4，5] 的基础上，诱导痰检测方法经过多年的发展和改进，现已基本成熟，但各家报导的方案稍有不同。下面就目前常用的痰液诱导和处理程序作一简介。 1.1? 痰液的诱导? 诱导前10分钟让病人吸入喘乐宁（沙丁胺醇气雾剂），随后检测一秒最大呼气量（FEV1），当FEV1&70%，对病人进行自然咳痰或等渗盐水诱导处理，反之使用高渗盐水诱导。常用的盐水雾化程序有两种：单一浓度高渗盐水进行长时间的诱导；梯度高渗盐水从低浓度到高浓度间断的短时间诱导，两种方法总的诱导时间都小于30分钟。单一法的盐水浓度常采用4%或4.5%，该方法具有操作简便、盐水对痰中细胞和可溶成分的影响可估量等优点。梯度法常采用3%、4%、5%作为诱导浓度，此方法虽然操作繁复，较难估量盐水对痰中细胞和可溶成分的影响，但能通过诱导间隔进行FEV1检测，选择是维持相同浓度还是采用下一个梯度浓度继续诱导，如果FEV1降低超过20％则终止诱导，提高诱导的安全性和成功率。也有研究者选用5%、7%、9%作为梯度浓度。痰液诱导过程还要注意采用各种方法，尽量减少唾液对痰的污染和稀释[6]，由于肥大细胞在高渗溶液和Ca2+存在的环境中容易被激活并释放组胺，所以研究肥大细胞时应尽量避免采用高渗盐水进行诱导或通过咳痰前的漱口来减少痰液中高渗盐水的残留量 [7]。痰液诱导出来后必须进行细胞分类和活力检测，合格标准一般为上皮细胞&20%，细胞存活率&40%。 另外据文献报道甘露醇和5’三磷酸盐尿嘧啶也可作为诱导物[8，9]，但由于甘露醇具有较明显的刺激支气管收缩作用，对于哮喘病人不适用，临床通常将其作为激发试验的刺激物使用。尿嘧啶一方面能刺激气道上皮P2Y2受体，打开Cl－通道，使分泌物穿越粘膜进入气管腔，另一方面促进粘膜下的腺体和杯状细胞分泌粘液，同时增加气道纤毛的清理作用，与高渗盐水诱导相比，痰量增加了一倍，而患者的SaO2和PEF等指标的下降比高渗盐水诱导明显降低，同时两种方法的痰细胞总数和分类的结果相近。由于尿嘧啶诱导法具有以上优点，有望成为一种评价呼吸系统疾病特别是哮喘的气道炎症的手段，具有一定的应用前景。 1.2? 痰液的处理? 当前痰的处理主要有两种方法，一种是全取法[10] ，即收集患者咳出的全部痰，另一种是选取法[11]，即挑选痰栓或痰的粘稠部分进行处理。据Antonio报道[12]，选取法的细胞存活率（80.6%）、嗜酸粒细胞比例（15.3%）和嗜酸粒细胞阳离子蛋白（ECP）浓度（548ug/L）显著高于全取法的细胞存活率（71.8%）、嗜酸粒细胞比例（8.3%）和ECP浓度（105ug/L），而选取法的中性粒细胞比例（33.3%）则显著低于全取法（42.7%），使用上述两种方法对正常人的痰进行处理时，亦显示选取法优于全取法。 由于嗜酸粒细胞主要分布在痰栓中，加入和痰等体积的0.1%DTT或其光学异构体DTE漩涡震荡2分钟，37℃水浴15分钟能有效地溶解粘液，使痰均匀化以便进行检测。实验证明[13]在室温或37℃下，DTT都能提高细胞和可溶物质的检测质量，而且不会刺激嗜酸粒细胞释放ECP，嗜碱粒细胞和肥大细胞释放组胺；并在不影响细胞分类计数的前提下，提高细胞的回收率；对细胞因子的检测也无干扰。 2? 可行性和安全性 由于高渗盐水是支气管激发剂，对病人特别是未完全控制的哮喘或慢性气道阻塞患者进行诱导时有一定危险性。据Vlachos-Mayer报道[14]，由熟练的研究人员严格按照操作规范对304例哮喘和25例慢阻肺患者进行痰诱导，73%的患者使用小于5%的高渗盐水，其中又有28%的患者使用生理盐水，成功率可达93%，只有8%的哮喘患者FEV1降低超过20%，而这些患者在诱导完成后吸入舒喘宁（200ug-400ug），FEV1都在30分钟内基本恢复到诱导前水平。另据Anneke报道[15]，使用0.9%、3.0%和4.5%梯度盐水对93例重症和难控制性哮喘患者进行痰诱导，成功率也能达到74%，只有22%的患者FEV1降低超过15%。以上报道与其他文献[16]共同提示诱导痰技术对于临床研究气道炎症是一种较安全和成功率较高的检测手段。需要强调的是，诱导前必须准备好相关的抢救设备和药物，诱导过程必须小心处理，如果病人出现呼吸道不适症状，建议马上终止诱导。 3.? 有效性与重复性 正常人和哮喘、慢阻肺病人的痰细胞成分、炎症介质和细胞因子等存在明显区别。由于PBS灌洗液对支气管肺泡灌洗液（BALF）造成不同程度的稀释，所以对炎性介质和细胞因子等检测受到限制。痰与BALF相比，含有更多的中性粒和嗜酸粒细胞，较少的单核和淋巴细胞。痰嗜酸粒细胞分类与支气管灌洗液、BALF的嗜酸粒细胞分类相关性较好。据Pin 和 Spanavello报道，在同一诱导技术的前提下，不同时间里对症状稳定的患者进行痰细胞分类和痰内可溶性介质检测，其重复性除了淋巴细胞之外都非常好，相关系数分别达到0.7和0.6以上[17,18]。 4.? 应用 4.1? 诊断方面? 痰是呼吸道粘膜的分泌物，主要成分是粘液和细胞。据Belda报道正常痰液细胞主要是吞噬细胞(61%)和中性粒细胞(36%)，嗜酸粒细胞和淋巴细胞较少见[19]。细胞分类计数的异常提示不同的气道炎症和诱因。研究表明嗜酸粒细胞增高(&3%)是支气管哮喘、嗜酸粒细胞支气管炎和过敏性疾病[20，21]的特征性标志，同时痰细胞计数是嗜酸粒细胞支气管炎的主要诊断依据[22]。而且痰嗜酸粒细胞比起血清ECP，更能灵敏和准确地反映哮喘患者的气道炎症状况[23]。它不但能反映哮喘发病的进程，并与气道阻塞和气道高反应性成正相关。哮喘发作时痰嗜酸粒细胞呈二至三倍的增长[24,25]，同时痰ECP、IL-5也伴随有显著的增高，随着过敏原的消失或吸入激素治疗后，痰嗜酸粒细胞和ECP也会随之减少。痰和血清ECP的浓度并无相关性，当痰ECP伴随症状改善而下降时血清ECP浓度并无改变。这些研究结果提示痰嗜酸粒细胞和其脱颗粒产物的水平对于描述炎症的程度有重要作用。由于肥大细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞在哮喘的气道炎症特征如支气管痉挛收缩、气道阻塞和气道高反应上扮演重要的角色，所以检测痰粘液中上述细胞的产物有助于哮喘的诊断和发病机理的研究。据Birring报道CVA和EB病人的诱导痰中组胺、白三烯、前列腺素D2、E2和白介素8与正常人相比都有显著差异[26]。但由于炎症介质和细胞因子的检测容易受到痰处理过程的各种因素的干扰而且费用昂贵，通常不作为疾病诊断的首选指标。另外如果利用上下班不同时段对诱导痰进行连续监测，该技术还可应用于职业性哮喘的研究[27]。 COPD患者痰内主要是中性粒细胞， Keatings和Thompson研究发现呼吸道内中性粒细胞浸润程度达到70%[28,29]，BALF里中性粒细胞是正常人的二至三倍[29,30]。中性粒细胞可以产生大量的弹性蛋白水解酶，导致肺实质的弹性纤维破坏和弹性下降，最终导致肺气肿。患有气道阻塞的患者其严重程度与痰中性粒细胞的百分比成正比。小气道和肺泡管是COPD患者气道阻力增加的主要部位[31]，该部位炎症的变化与气道的阻塞相关联[32]。可以肯定诱导的痰液包含着下呼吸道的物质，所以诱导痰是一种研究COPD气道炎症的有用工具。
目前世界卫生组织建议将在呼吸道分泌物中找到抗酸杆菌作为诊断肺结核的首要依据，但由于该方法的敏感性不高而且有相当部分的疑似病人不能自然咳出合格的痰而局限了该方法的应用。Conde等人[33]发现通过诱导痰这种无创的，安全的方法能解决上述无法自然咳痰的问题，而且结果与纤维支气管镜取材结果相一致，从而能大大提高结核的检出率。
对于肺癌病人，最佳的防治方案是能在早期或者症状出现前确诊。Vignola发现[34]通过检测诱导痰其特异性的致癌基因、抑癌基因表达、基因组的不稳定性和异常甲基化等指标，有可能在患者临床诊断肺癌前几年即可以分子生物学方法进行诊断。 4.2? 治疗方面? 由嗜酸粒细胞或中性粒细胞引起的不同炎症，其治疗方案各有不同。慢性咳嗽、哮喘或COPD患者的痰嗜酸粒细胞数量常预示其对激素治疗效果的好坏[35]。伴有嗜酸粒细胞增多的慢性咳嗽和COPD对吸入激素治疗效果显著，足量的激素治疗可使嗜酸粒细胞降低到正常水平，但非嗜酸粒细胞增多的慢性咳嗽和COPD则一般对皮质类固醇无效 [36]。通过观察嗜酸粒细胞数量衡量激素治疗效果的哮喘患者的要考虑几个因素，第一，病人的依从性；第二，病人生活或工作环境中是否存在频繁的变应原刺激；第三，激素治疗剂量不足；第四，诊断错误，是中性粒细胞而非嗜酸粒细胞性哮喘或激素耐受型哮喘。痰细胞计数在治疗由吸烟或肺气肿引起的慢性气道阻塞也有一定帮助[37,38]，痰嗜酸粒细胞的增高提示可用强的松改善症状，中性粒细胞的增高提示患者有感染，可施以抗菌治疗。 5.? 存在问题与展望 虽然诱导痰检测技术的优点有目共睹，但其不足之处也不容忽视。首先目前国内外尚无统一的诱导痰标准化处理方案,不同方案处理得出的结果有一定的差异[39]，影响资料的可比性和该方法的广泛利用。其二，由于处理过程中，盐水和唾液对不同标本的稀释度存在差异，或在测定痰液上清炎症介质时，DTT、蛋白酶或其它未知成分的复合物对免疫测定或其他检测程序的潜在干扰因素都会影响结果的可靠性，而且可溶性介质的正常范围也没确定，降低其对于临床的提示作用[40]。其三，由于痰液存放时间较短，4℃只能存放2小时，标本不能留待批量处理，而痰的诱导和处理过程手工步骤多、耗时较长等都是影响该方法作为常规检测项目的不利因素。 如何延长痰液的存放时间、简化处理程序和缩短处理时间是目前的当务之急。可喜的是已有研究报道，利用适量的防腐剂如二甲亚砜可以相对延长痰液的存放时间而不会对细胞的形态和内含物造成明显的影响。目前诱导痰的研究重点主要放在与哮喘关系较大的嗜酸粒细胞及其相关介质上，随着本技术的广泛开展和深入研究，对中性粒细胞和淋巴细胞及其相关介质的研究也将陆续开展。在临床方面，应该重点研究如何利用检测结果为疾病诊断、指导用药、观察疗效、防止复发等方面提供更直接的依据。
Induced SputumSputum induction and collection. Induced sputum samples were collected and measured for radioactivity at 40 min after aerosoldeposition. We followed the method published by Pin and coworkers (20) with some modifications. In brief, forced expiratory volume in one second (FEV1) and vital capacity (VC) were measured beforesaline inhalation to determine baseline values. The FEV1 values that matched a 20% fall from baseline were determined and recorded. An ultrasonic nebulizer was filled with 30 ml of 5% hypertonic saline (NaCl) for the first of two 12-min inhalations. Duringeach inhalation period, the subject was encouraged to come offthe mouthpiece at any time to cough if a sputum sample from the lower airways (i.e., not from the back of the throat) was ready for expectoration. A separate sterile container designated aswaste was used to collect saliva-salt water that collected in the mouth and throat during the inhalation periods. After the12-min inhalation period and before expectoration, subjects underwenta three-step cleansing procedure: (1) Gargle and rinse the mouth with water. (2) Scrape and clear the back of the throat (to avoidthe inclusion of nonairway fluid samples), and then expectoratethis into the sink. (3) Blow one's nose. Next the subjects delivered a chesty cough and expectorated the secretions into a sterile specimen jar, which was capped and placed on ice. Each subject coughed as many times as he or she felt necessary in order forairway secretions to be expectorated. This was typically 5 to 7 cough attempts. A postinduction measurement of FEV1 was then performed. Provided the FEV1 decreased by less than 20% from thebaseline value, the subjects repeated the second 12-min inhalationperiod with 5% saline followed by the cleansing procedure andcoughattempt. Sputum Analysis Immediately after sputum induction, the expectorated sample and waste container were weighed and taken to a scintillationcounter (Nuclear Data Sodium Iodide [NaI] Scintillation CSmyrna, GA) to determine the level of radioactivity (counts) present in each. The sputum sample was transferred to a sterile Petri dish and its characteristics macroscopically (or microscopically if necessary with an inverted microscope) recorded in terms of color, consistency, and degree of salivary contamination. The sputum plugs were manually separated from surrounding saliva with sterile forceps, selected, and transferred to a preweighed testtube. Radioactivity was measured on the selected sputum sample and recorded. The radioactive counts associated with the sputumsample were normalized to the amount of activity deposited inthe lung for each day. The sample was then weighed and a volume of 0.1% dithiothreitol (DTT) equal to 4× the sample weight wasadded to the sample. Separate experiments determined that DTThad no effect on the integrity of the 99mTc label to remain affixed to the SC particles. The sample was gently aspirated with a pipette and agitated (bench rocked) for 15 min. A volume of Dulbecco's phosphate-buffered saline (D-PBS) equal to 4× the sample weight was then added to the sample, and the sample was bench rocked for 5 min. The sample was then filtered through a 48- to 52-μm diameter nylon mesh and the weight of the cell suspension was recorded. After this, the sample was centrifuged (1,000 rpm, 5 min) and the supernatant collected into a separate tube. A separate experimentalso showed that this level of centrifugation was not capable of spinning down the &free& SC particles in solution. The level of radioactivity was measured in the cell pellet and supernatant.Next, a Neubauer hemocytometer and trypan blue exclusion staining(1:1 dilution of sample:trypan blue) were used to determine the
total cell count (excluding squamous epithelial cells) and cell viability. Normalization of Sputum Radioactivity to Deposited Radioactivity The radioactivity measured in the sputum samples by the scintillation detector was also dependenton the total amount of activity deposited in the lung for either the central or peripheral depositions. It was therefore necessary to normalize these sputum counts inorder to make both intrasubject and intersubject comparisons. This normalization was accomplished as follows: NRC (normalized radioactive counts) = The whole lung gamma camera counts were determined from the initial deposition image (i.e., Figure ) (before beginning the sputum induction procedure) and the rectangular regions bordering the left and right lungs. For each subject and study day, themeasured counts were first background-corrected and decay-corrected (99mTc has a 6-h half-life) to the time of the initial gamma camera deposition image. Statistical Methods Statistically significant differences between multiple study end points were assessed using a repeated-measures one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's multiple comparisonposthoc analysis. Analysis between two study end points was assessedusing Student's t test (two-tailed). Welche's correction was appliedwhen equal variances could not be assumed or were found to besignificantly different. A p value of & 0.05 was considered statisticallysignificant. CHANGES IN CELLULAR AND BIOCHEMICAL PROFILES SPUTUM AFTER ALLERGEN-INDUCED ASTHMATIC ? OF INDUCED痰诱导细胞学正常参考值篇三：诱导痰在气道炎症评价中的应用 诱导痰检测的方法学及其在气道炎症评价中的应用 罗炜 综述 赖克方 钟南山 审校 友 情 连 接 【摘要】气道炎症在哮喘、慢性支气管炎和间质性肺炎等一系列疾病中扮演着重要的角色，而且被认为是导致气道结构改变的主要因素之一。诱导痰检测作为一种无创、安全和可靠的气道炎症评价方法正日益受到重视和利用。 关键词? 诱导痰；气道炎症；哮喘；慢性阻塞性肺部疾病
气道炎症在哮喘、慢性支气管炎和间质性肺炎等一系列疾病中扮演着重要的角色，而且是导致气道结构改变的主要因素之一。气道炎症的评估对于研究气道疾病的发病机制起着重要作用。而且，能发现无临床症状、无气道高反应性和肺功能正常的早期气道疾病[1]。以往，气道炎症通常用纤维支气管镜取材进行评价，但由于其属于有创检查，难以重复进行，使其应用受到限制[2]。 痰液检查已经有100多年的历史，最初主要用于肺结核和肺肿瘤的诊断。未经处理的痰液涂片，细胞分布不均，而且混在粘液中不易识别，使痰细胞学检查的准确性受到影响。1958年Bickerman 等[3]首次建立了诱导痰检测方法，对不能自然咳痰的患者进行高渗盐水雾化获得痰液，利用二硫苏糖醇（DTT）等粘液溶解剂对痰进行处理，消除粘液的影响。1992年Pin等[4] 首先开始用诱导痰分析哮喘患者的气道炎症状况。近年来，诱导痰检测作为一种无创、安全和可靠的气道炎症评价方法正日益受到重视。下面就诱导痰检测的方法学及其在气道炎症评价的应用作一综述。 1? 方法学 在Pin和Fahy两种方案[4，5] 的基础上，诱导痰检测方法经过多年的发展和改进，现已基本成熟，但各家报导的方案稍有不同。下面就目前常用的痰液诱导和处理程序作一简介。 1.1? 痰液的诱导? 诱导前10分钟让病人吸入喘乐宁（沙丁胺醇气雾剂），随后检测一秒最大呼气量（FEV1），当FEV1&70%，对病人进行自然咳痰或等渗盐水诱导处理，反之使用高渗盐水诱导。常用的盐水雾化程序有两种：单一浓度高渗盐水进行长时间的诱导；梯度高渗盐水从低浓度到高浓度间断的短时间诱导，两种方法总的诱导时间都小于30分钟。单一法的盐水浓度常采用4%或4.5%，该方法具有操作简便、盐水对痰中细胞和可溶成分的影响可估量等优点。梯度法常采用3%、4%、5%作为诱导浓度，此方法虽然操作繁复，较难估量盐水对痰中细胞和可溶成分的影响，但能通过诱导间隔进行FEV1检测，选择是维持相同浓度还是采用下一个梯度浓度继续诱导，如果FEV1降低超过20％则终止诱导，提高诱导的安全性和成功率。也有研究者选用5%、7%、9%作为梯度浓度。痰液诱导过程还要注意采用各种方法，尽量减少唾液对痰的污染和稀释[6]，由于肥大细胞在高渗溶液和Ca2+存在的环境中容易被激活并释放组胺，所以研究肥大细胞时应尽量避免采用高渗盐水进行诱导或通过咳痰前的漱口来减少痰液中高渗盐水的残留量 [7]。痰液诱导出来后必须进行细胞分类和活力检测，合格标准一般为上皮细胞&20%，细胞存活率&40%。 另外据文献报道甘露醇和5’三磷酸盐尿嘧啶也可作为诱导物[8，9]，但由于甘露醇具有较明显的刺激支气管收缩作用，对于哮喘病人不适用，临床通常将其作为激发试验的刺激物使用。尿嘧啶一方面能刺激气道上皮P2Y2受体，打开Cl－通道，使分泌物穿越粘膜进入气管腔，另一方面促进粘膜下的腺体和杯状细胞分泌粘液，同时增加气道纤毛的清理作用，与高渗盐水诱导相比，痰量增加了一倍，而患者的SaO2和PEF等指标的下降比高渗盐水诱导明显降低，同时两种方法的痰细胞总数和分类的结果相近。由于尿嘧啶诱导法具有以上优点，有望成为一种评价呼吸系统疾病特别是哮喘的气道炎症的手段，具有一定的应用前景。 1.2? 痰液的处理? 当前痰的处理主要有两种方法，一种是全取法[10] ，即收集患者咳出的全部痰，另一种是选取法[11]，即挑选痰栓或痰的粘稠部分进行处理。据Antonio报道[12]，选取法的细胞存活率（80.6%）、嗜酸粒细胞比例（15.3%）和嗜酸粒细胞阳离子蛋白（ECP）浓度（548ug/L）显著高于全取法的细胞存活率（71.8%）、嗜酸粒细胞比例（8.3%）和ECP浓度（105ug/L），而选取法的中性粒细胞比例（33.3%）则显著低于全取法（42.7%），使用上述两种方法对正常人的痰进行处理时，亦显示选取法优于全取法。 由于嗜酸粒细胞主要分布在痰栓中，加入和痰等体积的0.1%DTT或其光学异构体DTE漩涡震荡2分钟，37℃水浴15分钟能有效地溶解粘液，使痰均匀化以便进行检测。实验证明[13]在室温或37℃下，DTT都能提高细胞和可溶物质的检测质量，而且不会刺激嗜酸粒细胞释放ECP，嗜碱粒细胞和肥大细胞释放组胺；并在不影响细胞分类计数的前提下，提高细胞的回收率；对细胞因子的检测也无干扰。
2? 可行性和安全性 由于高渗盐水是支气管激发剂，对病人特别是未完全控制的哮喘或慢性气道阻塞患者进行诱导时有一定危险性。据Vlachos-Mayer报道[14]，由熟练的研究人员严格按照操作规范对304例哮喘和25例慢(本文来自： 教 师 联 盟网:痰诱导细胞学正常参考值)阻肺患者进行痰诱导，73%的患者使用小于5%的高渗盐水，其中又有28%的患者使用生理盐水，成功率可达93%，只有8%的哮喘患者FEV1降低超过20%，而这些患者在诱导完成后吸入舒喘宁（200ug-400ug），FEV1都在30分钟内基本恢复到诱导前水平。另据Anneke报道[15]，使用0.9%、3.0%和 4.5%梯度盐水对93例重症和难控制性哮喘患者进行痰诱导，成功率也能达到74%，只有22%的患者FEV1降低超过15%。以上报道与其他文献[16]共同提示诱导痰技术对于临床研究气道炎症是一种较安全和成功率较高的检测手段。需要强调的是，诱导前必须准备好相关的抢救设备和药物，诱导过程必须小心处理，如果病人出现呼吸道不适症状，建议马上终止诱导。 3.? 有效性与重复性 正常人和哮喘、慢阻肺病人的痰细胞成分、炎症介质和细胞因子等存在明显区别。由于PBS灌洗液对支气管肺泡灌洗液（BALF）造成不同程度的稀释，所以对炎性介质和细胞因子等检测受到限制。痰与BALF相比，含有更多的中性粒和嗜酸粒细胞，较少的单核和淋巴细胞。痰嗜酸粒细胞分类与支气管灌洗液、BALF的嗜酸粒细胞分类相关性较好。据Pin 和 Spanavello报道，在同一诱导技术的前提下，不同时间里对症状稳定的患者进行痰细胞分类和痰内可溶性介质检测，其重复性除了淋巴细胞之外都非常好，相关系数分别达到0.7和0.6以上[17,18]。 4.? 应用 4.1? 诊断方面? 痰是呼吸道粘膜的分泌物，主要成分是粘液和细胞。据Belda报道正常痰液细胞主要是吞噬细胞(61%)和中性粒细胞(36%)，嗜酸粒细胞和淋巴细胞较少见 [19]。细胞分类计数的异常提示不同的气道炎症和诱因。研究表明嗜酸粒细胞增高(&3%)是支气管哮喘、嗜酸粒细胞支气管炎和过敏性疾病[20，21]的特征性标志，同时痰细胞计数是嗜酸粒细胞支气管炎的主要诊断依据[22]。而且痰嗜酸粒细胞比起血清ECP，更能灵敏和准确地反映哮喘患者的气道炎症状况[23]。它不但能反映哮喘发病的进程，并与气道阻塞和气道高反应性成正相关。哮喘发作时痰嗜酸粒细胞呈二至三倍的增长[24,25]，同时痰ECP、IL-5也伴随有显著的增高，随着过敏原的消失或吸入激素治疗后，痰嗜酸粒细胞和ECP也会随之减少。痰和血清ECP的浓度并无相关性，当痰ECP伴随症状改善而下降时血清ECP浓度并无改变。这些研究结果提示痰嗜酸粒细胞和其脱颗粒产物的水平对于描述炎症的程度有重要作用。由于肥大细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞在哮喘的气道炎症特征如支气管痉挛收缩、气道阻塞和气道高反应上扮演重要的角色，所以检测痰粘液中上述细胞的产物有助于哮喘的诊断和发病机理的研究。据Birring报道CVA和EB病人的诱导痰中组胺、白三烯、前列腺素D2、E2和白介素8与正常人相比都有显著差异[26]。但由于炎症介质和细胞因子的检测容易受到痰处理过程的各种因素的干扰而且费用昂贵，通常不作为疾病诊断的首选指标。另外如果利用上下班不同时段对诱导痰进行连续监测，该技术还可应用于职业性哮喘的研究[27]。 COPD患者痰内主要是中性粒细胞， Keatings和Thompson研究发现呼吸道内中性粒细胞浸润程度达到70%[28,29]，BALF里中性粒细胞是正常人的二至三倍[29,30]。中性粒细胞可以产生大量的弹性蛋白水解酶，导致肺实质的弹性纤维破坏和弹性下降，最终导致肺气肿。患有气道阻塞的患者其严重程度与痰中性粒细胞的百分比成正比。小气道和肺泡管是COPD患者气道阻力增加的主要部位[31]，该部位炎症的变化与气道的阻塞相关联[32]。可以肯定诱导的痰液包含着下呼吸道的物质，所以诱导痰是一种研究COPD气道炎症的有用工具。 目前世界卫生组织建议将在呼吸道分泌物中找到抗酸杆菌作为诊断肺结核的首要依据，但由于该方法的敏感性不高而且有相当部分的疑似病人不能自然咳出合格的痰而局限了该方法的应用。Conde等人[33]发现通过诱导痰这种无创的，安全的方法能解决上述无法自然咳痰的问题，而且结果与纤维支气管镜取材结果相一致，从而能大大提高结核的检出率。 对于肺癌病人，最佳的防治方案是能在早期或者症状出现前确诊。Vignola发现[34]通过检测诱导痰其特异性的致癌基因、抑癌基因表达、基因组的不稳定性和异常甲基化等指标，有可能在患者临床诊断肺癌前几年即可以分子生物学方法进行诊断。 4.2? 治疗方面? 由嗜酸粒细胞或中性粒细胞引起的不同炎症，其治疗方案各有不同。慢性咳嗽、哮喘或COPD患者的痰嗜酸粒细胞数量常预示其对激素治疗效果的好坏 [35]。伴有嗜酸粒细胞增多的慢性咳嗽和COPD对吸入激素治疗效果显著，足量的激素治疗可使嗜酸粒细胞降低到正常水平，但非嗜酸粒细胞增多的慢性咳嗽和COPD则一般对皮质类固醇无效[36]。通过观察嗜酸粒细胞数量衡量激素治疗效果的哮喘患者的要考虑几个因素，第一，病人的依从性；第二，病人生活或工作环境中是否存在频繁的变应原刺激；第三，激素治疗剂量不足；第四，诊断错误，是中性粒细胞而非嗜酸粒细胞性哮喘或激素耐受型哮喘。痰细胞计数在治疗由吸烟或肺气肿引起的慢性气道阻塞也有一定帮助[37,38]，痰嗜酸粒细胞的增高提示可用强的松改善症状，中性粒细胞的增高提示患者有感染，可施以抗菌治疗。 5.? 存在问题与展望 虽然诱导痰检测技术的优点有目共睹，但其不足之处也不容忽视。首先目前国内外尚无统一的诱导痰标准化处理方案,不同方案处理得出的结果有一定的差异[39]，影响资料的可比性和该方法的广泛利用。其二，由于处理过程中，盐水和唾液对不同标本的稀释度存在差异，或在测定痰液上清炎症介质时，DTT、蛋白酶或其它未知成分的复合物对免疫测定或其他检测程序的潜在干扰因素都会影响结果的可靠性，而且可溶性介质的正常范围也没确定，降低其对于临床的提示作用[40]。其三，由于痰液存放时间较短，4℃只能存放2小时，标本不能留待批量处理，而痰的诱导和处理过程手工步骤多、耗时较长等都是影响该方法作为常规检测项目的不利因素。 如何延长痰液的存放时间、简化处理程序和缩短处理时间是目前的当务之急。可喜的是已有研究报道，利用适量的防腐剂如二甲亚砜可以相对延长痰液的存放时间而不会对细胞的形态和内含物造成明显的影响。目前诱导痰的研究重点主要放在与哮喘关系较大的嗜酸粒细胞及其相关介质上，随着本技术的广泛开展和深入研究，对中性粒细胞和淋巴细胞及其相关介质的研究也将陆续开展。在临床方面，应该重点研究如何利用检测结果为疾病诊断、指导用药、观察疗效、防止复发等方面提供更直接的依据。 参考文献（略）
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