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【求助】请教关于分子量14kDa蛋白的western blot？？
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这个帖子发布于4年零292天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近在做western blot，测一个小分子量蛋白（14kDa），一直没有结果。我的电泳条件：1、普通聚丙烯酰胺凝胶，上层胶5%,下层胶15%；2、电泳80V,30min左右，待marker散开后，加电压110V-150V,继续电泳约503、转膜80V,30-50min。请教各位前辈：1、普通聚丙烯酰胺凝胶能跑出来吗？是否有必要用Tricine-SDS-PAG？
2、电泳时间、转膜时间是否合适？
3、其他还需注意些什么？
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14kd的蛋白用普通15%的westen可以的，不会跑出来，根据你的溴酚蓝来决定跑胶时间。电转条件没什么问题。如果是夏天电转，记得槽内放冰袋。否则温度过高。
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蛋白分子量比较小，建议你用PVDF膜，不要用NC，因为NC对小分子蛋白的截留能力不好。另外，如楼上所述，转印时尽量保证低温。
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第一个就是用SDS-PAGE胶是可以的，15%的浓度也没问题，再就是要用0.22um的PVDF膜，转膜液里面不要加SDS，不知道你用的什么仪器转膜，你用横流试试，200mA 45min,注意降温，仅供参考
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能跑出来，转膜 60V 30min，0.22 NC膜，没问题，能出来
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应该用0.22um的PVDF膜
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麻烦请问下如果一个蛋白质的分子量在8-9kDA，那相对分子质量是多少？按8.5计算吗？
麻烦请问下如果一个蛋白质的分子量在8-9kDA，那相对分子质量是多少？按8.5计算吗？
有依据吗？
1Da即相对分子量为1 1kDa=1000Da，所以8-9kDa即Da，所以相对分子量为
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【求助】关于透析袋截留分子量的问题？
看到有的文献上介绍用透析方法提纯的时候，作者所使用的透析袋截留分子量是一个区间，例如（molecular weight cut off )，这是怎么回事呢？根据截留分子量的定义：留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，它应该是一个数值才对呀，怎么能是区间呢，看到试剂公司的网站上也是这样写的。如“透析袋（分子量）”
另外“Size　25mm(DM20）”代表什么意思呢，25mm是宽度，DM20是直径的意思吗？
请大家帮忙参考一下
那光写10000不就行了，为什么还要写14000呢？
是不是这个区间的分子量一部分可能析出，一部分可能留在透析袋，而14000以上的肯定能留在透析袋里啊？
对啊，我猜的是的都有可能
哦，是这样啊，还是您解释的比较合理，非常感谢！
透析主要是利用不同分子量的（高）分子尺寸不同。定义就是，小于这个分子量的可以透过。
所以这是比较粗糙的。
因为：一、不同的高分子和溶剂的相互作用参数不同，尺寸也不一样。
& && &二、高分子的分子量是统计意义，还要考虑分子量分布。
& && &三、透析袋其实是一种尺寸比较均一的高分子多孔膜，很难做的非常均一。
所以MWCO是一个区间是正常的。其实也有些产品直接给一个数值，比如12000。
考虑这些因素，MWCO只能作为参考，比如MWCO 12000的透析袋，一般可以用来除掉MW<4,5K的分子，再往上效果就不好了。
还有，就是，透析袋的孔析是会溶胀的，在不同的溶剂不同尺寸，所以只是一个参考值。
非常感谢您细致、准确的指导，谢谢你，受益了，谢谢！
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【求助】WB检测小分子量蛋白（小于10kDa）的问题请教
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这个帖子发布于8年零17天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近用WB检测小鼠脑组织beta淀粉样蛋白，做了一次，背景很高，准备再摸索一下条件。请教：有谁能分享一下WB检测10kDa以下的蛋白表达的注意事项和特殊要求吗？谢谢。
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wh2008 edited on
对于分子量仅为4KD左右的蛋白（严格来说肽段）而言，在WB检测中主要是注意：一、SDS-PAGE时候控制好电泳时间，别跑丢了；二、另外就是转膜的时候很容易“穿透”，选择小孔径的膜很有必要（对付小分子蛋白一般都是0.22um的印迹膜），听说whatman还有0.1um的印迹膜可供选择；三、最后就是abeta的丰度在脑组织中丰度到底有多高，会不会已经超出WB检测的灵敏度范围？我曾经原核表达过带有tag的abeta蛋白，WB检测时候很正常。
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谢谢提醒，这几个问题你回复得比较到位，恳请版主给予加分鼓励。
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回答你第1个问题：SDS-PAGE不好掌握时间,可以跑Tricine-SDS-PAGE,适合于分离小分子量的蛋白,分离范围为1~100kD
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请问Tricine-SDS-PAGE怎么配。谢谢！
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Tricine gel:Separating gel (16.5% T,3%C)30% Acrylamide
19.2mlGel buffer*
11.7mlGlycerol 4.6ml10% APS 150ulTEMED 15ulStacking gel (4%T, 3%C)30% Acrylamide 825ulGel buffer 1.55ml10%APS
50ulTEMED 5ulwater 3.875mlAnode buffer 0.2M Tris, pH 8.9Cathode buffer 0.1M Tris, pH 8.25**0.1M Tricine0.1% SDS*Gel buffer: 3M Tris, pH 8.45, 0.3% SDS**no need to adjust the pH.另外，C好象是指polyacrylamide的交联率，在commercial的瓶子上好象有列出实际16.5%这里就是指其浓度，分子克隆上最高的也只列到15％，这里16.5%算是很特殊的了,所以Tricine胶是用于分离很小的蛋白／肽段的
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以下是详细说明书：
Tricine/Polyacrylamide Gel ElectrophoresisUsed for pilin processing analysis but generally useful for resolution of small (15-35 Kdal) proteins of similar size. SeeStrom, M. S., D. N. Nunn, and S. Lory. 1993. A single bifunctional enzyme, PilD, catalyzes cleavage and N-methylation of proteins belonging to the type IV pilin family. Proc. Natl. Acad. Sci., 90:. or Strom, M. S., and S. Lory. 1992. Kinetics and sequence specificity of processing of prepilin by PilD, the Type IV leader peptidase of Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 174:. Original citation: Schagger, H. and G. von Jagow. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166: 368-379. Reagents:
Anode Buffer (+): 200 mM Tris pH 8.9 (can dilute from 10X stock)
Cathode Buffer (-): 100 mM Tris/100 mM Tricine/0.1% SDS (no need to pH, but will be ~8.25) these can be made as 10X stocks and diluted before use
Gel Buffer: 3.0 M Tris, pH 8.45/0.3% SDS Note: the pH's given for the anode and gel buffers are essential
Stacking acrylamide: 48% acrylamide/1.5% bis-acrylamide
Separating acrylamide: 46.5% acrylamide/1.5% bis-acrylamide
Sample buffer: (add equal volume to sample), for 20 ml:
5 ml 0.5 M Tris, pH 6.8
4 ml 20% SDS
1 ml 2-mercaptoethanol
4 ml 50% glycerol
0.004 g bromophenol blue
6 ml water
Pouring Gels For each minigel (Hoeffer &Mighty Small& or BioRad &Mini Protean-II&--scale up as required):
1. Separating gel:
2 ml separating acrylamide
2 ml gel buffer
2 ml 50% glycerol
1.22 ml separating acrylamide
2 ml gel buffer
2 ml 50% glycerol
0.78 ml waterpolymerize with 75 ul 10% APS and 7.5 ul TEMED
2. Stacking gel:
0.25 ml stacking acrylamide
0.75 ml gel buffer
2.0 ml water
20 ul 10% APS
2 ul TEMED
Polymerize both the stacking and separating gels at the same time (I used small disposable tubes), and pour stacking gel directly onto the separating gel (pour carefully but quickly--they won't mix but the separating gel polymerizes within 2-3 minutes). Make each separating gel mixture separately and add TEMED and APS right before pouring. Multiple stacking gel mixtures can be made in the same tube, but you have around 10 minutes before these start to polymerize too. Sample loading and electrophoresis:
For the minigels, 5-10 ul per well gives best results. Layer the samples in the well very carefully, and be sure to flush out any unpolymerized acrylamide before loading.
Electrophorese at 25-35 mA (constant current) per gel in minigel setup. Foam will appear on the top (cathode), and additional cathode buffer may have to be added during the run.
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我有个问题，看文献讲，有的胶用3C，有的用6C，那种好一些？为什么？
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本人曾看過一篇專門討論大膠的跑膠時間,電壓,電流,以及C%等的條件,剛才去找了一下,沒找到.偶的印象是,除非是很特殊的實驗,否則C的影響不大,不必專門關心. 試想,在丙烯酰胺單體溶液中,3%的二聚體與6%的二聚體,對整個體系的影響,差別能有多大?
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180KDa分子量的蛋白western求助！！！
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各位老师，我最近在做甲基化转移酶的western blot，其中一个蛋白分子量180，但只跑出来过一次，其他的都没有，见下图，请各位老师帮我分析原因，像这样的分子量电泳、转膜需要注意什么，电压，时间怎么控制？谢谢！
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100V两小时应该就可以，抗体浓度逐渐加倍试试看，孵育时间建议最少16小时
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大神们，你们在哪儿，需要帮助啊！
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首先你要确定转膜时间，我做过19kda蛋白，我转膜条件为100v,60min,膜为pvdf,一抗浓度稍微大一点按照说明书做，我想应该能做出来
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一念执着00 首先你要确定转膜时间，我做过19kda蛋白，我转膜条件为100v,60min,膜为pvdf,一抗浓度稍微大一点按照说明书做，我想应该能做出来抗体浓度已经比说明书的大了，至于转膜是pvdf，2小时，100v。
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最后一张图显然是有结果的。只是曝光时间太长，机器噪点很重。建议用胶片，会很漂亮。
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Dnmt我感觉不是那么好压，一抗4℃摇晃过夜，转膜300mA稳流2h。二抗浓度低一点，曝光时间长点。
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我用200ma转90分钟做180kd出来了，不过滤纸是上下各2mm
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200mA 转膜2小时，感觉你二抗浓度有点高，一抗和二抗什么牌子的？
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先问下你一抗用的哪个货号的？
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昆仑散人 先问下你一抗用的哪个货号的？一抗Abcam的，应该没问题吧，我用同学的肿瘤细胞提的蛋白跑出了，我的蛋白是成纤维细胞的。
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shadowflee007 200mA 转膜2小时，感觉你二抗浓度有点高，一抗和二抗什么牌子的？一抗Abcam，二抗是cst的。
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感觉蛋白的问题 建议重新提 转膜300ma 2.5h应该也可以
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做western记住以下几点：1.确定合适的蛋白上样量，好像是20-60ug2.确定合适的分离胶浓度，分子量越大用的浓度越小3.电泳：开始低电压把蛋白压齐，后用高电压跑。我师姐教的初学者电压为先40v跑，当maker跑开后80v跑4.转膜：首次切胶时注意目的蛋白不一定在180左右，可能要切宽一点，转膜时胶放负极（黑面），膜放正极（白面，膜要用甲醛提前泡一下），我们实验室转膜恒流转200MA，时间略长于其分子量大小5.洗膜：组织蛋白3次，每次10分钟，细胞每次5min。感觉楼主的背景很高，不知道是没洗干净还是二抗浓度太高~6.抗体浓度：我师姐教的一抗一般1：1000，二抗1：5000希望对楼主有用！
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小乐乐512 做western记住以下几点：1.确定合适的蛋白上样量，好像是20-60ug2.确定合适的分离胶浓度，分子量越大用的浓度越小3.电泳：开始低电压把蛋白压齐，后用高电压跑。我师姐教的初学者电压为先40v跑，当maker跑开后80v跑4.转膜：首次切胶时注意目的蛋白不一定在180左右，可能要切宽一点，转膜时胶放负极（黑面），膜放正极（白面，膜要用甲醛提前泡一下），我们实验室转膜恒流转200MA，时间略长于其分子量大小5.洗膜：组织蛋白3次，每次10分钟，细胞每次5min。感觉楼主的背景很高，不知道是没洗干净还是二抗浓度太高~6.抗体浓度：我师姐教的一抗一般1：1000，二抗1：5000希望对楼主有用！非常感谢！?
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小小医者wsg shadowflee007 200mA 转膜2小时，感觉你二抗浓度有点高，一抗和二抗什么牌子的？一抗Abcam，二抗是cst的。换我们公司的一抗和二抗，用我们的专用大分子wb条件做胶跑胶转膜，如果你在华东地区，我们给你提供免费试用抗体，
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你用的膜是0.22还是0.45
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白add黑 你用的膜是0.22还是0.450.22的。
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小小医者wsg 一念执着00 首先你要确定转膜时间，我做过19kda蛋白，我转膜条件为100v,60min,膜为pvdf,一抗浓度稍微大一点按照说明书做，我想应该能做出来抗体浓度已经比说明书的大了，至于转膜是pvdf，2小时，100v。180以上的，需要用NC膜。PVDF膜做大分子的，显色背景高
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请问你的这个蛋白是合成出来的么？你是怎么得到这个蛋白的？
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eryelian8990 请问你的这个蛋白是合成出来的么？你是怎么得到这个蛋白的？细胞中提取的。
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7.5%的胶跑，转膜用30mA恒流过夜（10h以上），你试试
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