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报道：基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sgRNA(Small
guide RNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。
目前,已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sgRNA设计和/或脱靶效应评估软件,但不同的软件各有优缺点。来自华中农业大学,农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室等处的研究人员发表综述，重点对16款sgRNA
设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述,通过制定38项评估指标对不同软件进行了比较分析,最后对11种用于检测基因组编辑效率和脱靶的实验方法,以及如何筛选高效且特异的sgRNA进行了归纳总结。
基于CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9
系统介导的基因组编辑技术，是继锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription
activator-like effector nuclease,
TALEN)后的第三代基因组编辑技术，主要是源于对细菌的获得性免疫系统改造而成。一经问世，在食蟹猴(Cynomolgus monkey)、小鼠(Mus
musculus)、大鼠(Rattus norveaicus)、斑马鱼(Zebrafish)、猪(Sus scrofa)、拟南芥(Arabidopsis
thaliala)、烟草(Nicotiana tabacum)、高粱(Sorghum bicolor)和水稻(Oryza
sativa)等多个物种中实现了基因组编辑。
CRISPR/Cas9技术主要由两部分组成：一是sgRNA，通过碱基互补配对与基因组特异结合；其次是Cas9核酸酶，可靶定到具有下游前间区序列邻近基序(Protospacer
adjacent motif,
PAM)的特定基因组序列并进行切割。目前，CRISPR/Cas9技术依然在不断改进中。如何改善和提高基因组编辑效率，同时最大限度降低脱靶风险成为亟待解决的问题，这篇围绕这一核心问题进行了综述，并重点介绍了sgRNA的设计要点。
文章详细介绍了CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑效率与脱靶效应、sgRNA设计与脱靶效应评估软件和基因组编辑效率与脱靶检测方法及软件三方面内容，其中包括CRISPR
Design、ZiFiT、E-CRISP、CRISPR-P、Cas-OFFinder、CHOPCHOP、flyCRISPR、CCTop和sgRNAcas9等多个软件。
作者指出，利用CRISPR/Cas9技术关键的两个问题是：如何提高CRISPR/Cas9技术基因组编辑效率？如何最大限度降低脱靶风险？影响基因组编辑效率和特异性的因素很多。目前业界对CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑效率和脱靶效应研究尚不够深入，观点还不统一。这反映在不同sgRNA设计与脱靶预测软件中，对sgRNA的活性和特异性评估标准不一致。
比如“CRISPR Design”软件对脱靶位点最大仅考虑4个碱基错配，未考虑种子序列的特异性。而sgRNAcas9软件允许脱靶位点最大含
5个碱基错配，还考察了长度为12
bp的种子序列。CRISPRdirect和COSMID软件将脱靶位点是否存在碱基插入与缺失纳入评估范围，Off-Spotter软件允许自定义种子序列位置和长度。E-CRISP软件还评估sgRNA与脱靶位点的二级结构及基因组位置等。
目前很多软件并未对预测的脱靶位点进行验证，因而无法比较不同软件评估脱靶效应算法灵敏度高低。sgRNA
和PAM类型影响基因组编辑效率和特异性，而不同sgRNA活性和特异性有差异。因此，选择sgRNA需慎重。选择高效且特异的sgRNA需要注意的因素有：
(1)sgRNA的长度为17~20nt；(2)可选3'末端含GG的sgRNA，避免使用含“TTTT”转录终止序列的sgRNA，GC%含量为40%~60%；(3)如果构建U6或T7启动子驱动的sgRNA表达载体，为提高转录效率，可限定sgRNA的5'末端为G或GG；(4)如需造成基因移码突变，尽量选择在功能域或编码区内部设计sgRNA；(5)检查sgRNA靶标位点基因组序列是否存在SNPs；(6)针对Cas9单切口酶设计“paired-gRNA”，需限定两个sgRNA之间的距离，建议为C2~32nt；(7)分析脱靶位点可限定最大允许5个碱基错配，并同时评估种子序列的特异性。另外还可评估是否存在碱基插入或缺失。
总之，应选择合适的软件设计sgRNA并进行脱靶分析。一个基因建议选择2~3个sgRNA进行实验验证，再选择活性高的sgRNA开展下一步的功能实验。
在对上述资料分类整理的基础上，这一研究组成员建立了一个CRISPR-Cas9
技术资源信息网(/cn/)，以方便广大科研工作者使用。与其他基因组编辑技术相比，CRISPR/Cas9技术的特点是操作简单且功能强大。因此，该技术不仅在模式动物基因功能研究领域得到广泛应用，也在农业经济动物(如猪)的遗传育种领域得到开发，并展现出广阔的应用前景。Hai等[6]率先利用CRISPR/Cas9技术，结合受精卵显微注射法获得了vWF基因遗传修饰猪。Sato等[7]利用该技术成功敲除猪胚胎成纤维细胞的α-1,
3-半乳糖基转移酶基因。Whitworth等利用该技术，结合体细胞核移植技术或受精卵显微注射方法，获得了CD163
和CD1D基因敲除猪。Zhou等利用此技术，同样结合体细胞核移植技术，成功构建了酪氨酸酶基因和PARK2与PINK1双基因敲除小型猪，并且分别建立了人类白化病和帕金森综合征猪模型。尽管CRISPR/Cas9技术目前存在编辑效率低且具有一定的脱靶风险，但随着研究的深入，这些问题势必会得到解决，即可推进功能基因组学和分子育种领域的发展。
（）系列文章：
原文检索：
谢胜松,张懿,张利生,李广磊,赵长志,倪攀,赵书红. CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估[J]. 遗传, ):
Shengsong Xie,Yi Zhang,Lisheng Zhang,Guanglei Li,Changzhi Zhao,Pan Ni,Shuhong
Zhao. sgRNA design for the CRISPR/Cas9 system and evaluation of its off-target
effects. HEREDITAS(Beijing), ): .
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Genome-CRISP& CRISPR-Cas9 产品与服务
-RNA导向的精确、灵活的基因组编辑工具
CRISPR-Cas系统（The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats-associated protein systems）是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。CRISPR-Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。多个科研小组的研究都显示，与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在细胞或斑马鱼中具有相似甚至更高的效率。
在II型CRISPR系统中，CRISPR RNA（crRNA）与转录激活crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）。 这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA（single-guided RNA）进行简化。基因组的靶序列中有长约20bp的片段与crRNA或sgRNA互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域PAM（5’-NGG-3’）为Cas9识别位点，是实现剪切功能的关键。
CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而强大的工具。该体系其中一个最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基因组位点
图&1. CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理图
Horvath P, Barrangou R (January 2010). "CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea". Science 327 (5962): 167–70.
Marraffini LA, Sontheimer EJ (February 2010). "".
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基因组编辑应用
转录激活样效应因子（TAL Effectors）和CRISPR-Cas9可高效且精确地改造细胞系及模式动物的基因组。具体的基因组编辑应用可见下表。
基因组修饰
基因组编辑工具
内源基因标记
A加入融合标签（如荧光素酶、GFP等），跟踪内源性启动子活性或内源性蛋白的表达与定位。
TALEN 或CRISPR
内源基因突变
在内源基因序列中引入点突变
TALEN 或CRISPR
内源基因敲除
引入缺失或插入（如：筛选标记）敲除内源基因
TALEN 或CRISPR
若需建立敲除细胞系，则强烈建议使用。
内源基因表达激活
靶向激活内源基因表达
TALE-TF或 CRISPR-TF
内源基因表达抑制
靶向抑制内源基因表达
TALE-R 或CRISPR-R
敲入外源ORF或其他遗传因子到人或小鼠基因组的safe harbor位点
TALEN或CRISPR
& 与CRISPR-Cas9系统对比
CRISPR-Cas9
蛋白质-DNA
甲基化敏感性
染色质结构敏感性
潜在脱靶效应较TALEN和ZFN高
多重靶向编辑
Genome-CRISP& Cas9核酸酶表达克隆
Cas9核酸酶表达克隆装载并表达CRISPR关联蛋白（Cas）9号的基因序列。当crRNA与tracrRNA（或融合的sgRNA）存在时，Cas9核酸酶会被导向至宿主基因组中的靶点，引发双链断裂（DSBs）。随后，细胞的非同源末端连接修复机制（NHEJ）重新连接断裂处的基因组DNA，并引入插入或缺失突变。另一种情况是，一个外源双链供体DNA片段可以通过同源重组（HR）整合进断裂处的基因组。目前，CRISPR/Cas9系统已已用在人胚胎干细胞（ES）和诱导多功能干细胞（IPSCs）的基因修饰稳定株的制备，还用于大鼠，线虫，斑马鱼等基因敲除动物模型的构建。
图&2. Cas9核酸酶表达克隆质粒图谱
图3. CRISPR-Cas9介导的基因编辑。（左）：sgRNA引导Cas9核酸酶作用于基因组，形成的DSBs被非同源末端连接（NHEJ）机制修复；（右）：sgRNA引导Cas9核酸酶作用于基因组，形成DSBs，同源重组（HR）作用下，供体质粒上的目标基因及筛选标记（或其他遗传元件）在断裂处被整合进基因组。
Genome-CRISP& Cas9切口酶表达克隆
Cas9切口酶表达克隆装载并表达工程酶Cas9切口酶的基因（图4）。野生型的Cas9蛋白含有两个催化结构域&&一个切割sgRNA靶向识别的结合链，而另一个切割其互补链。Cas9 D10A切口酶基因的序列对比野生型在D10A位置有一个有义突变。这个有义突变使得切割互补链的催化结构域失活，将Cas9核酸酶转变成只在靶标序列的结合链切出单链缺刻的切口酶。
图4: Cas9切口酶表达克隆质粒图谱
图5: 切口酶在结合链生产单链缺刻原理图
Genome-CRISP& sgRNA设计与克隆定制服务
GeneCopoeia为客户感兴趣的基因提供sgRNA（single-guide RNA）设计与克隆定制服务。sgRNA克隆表达一个单链的融合sgRNA（由crRNA和tracrRNA融合而成）。当Cas9核酸酶存在时，sgRNA能识别靶标DNA序列并引导Cas9核酸酶剪切靶标位点，形成DNA双链断裂（DSBs），进而实现基因敲除、敲入及突变等基因组编辑。多个sgRNA克隆与一个Cas9克隆共转染可同时在基因组中编辑多个位点，使实验设计更高效、更灵活。
Cas9核酸酶
筛选标记/报告基因
pCRISPR-SG01
Hygromycin
pCRISPR-CG01
载体含有CMV启动子启动表达的Cas9核酸酶基因
Neomycin / mCherry
pCRISPR-CG02
载体含有CBh启动子启动表达的Cas9核酸酶基因
图6. HUWEI-sgRNA/Cas9靶向HEK293T细胞中的HUWEI基因。（A）HUWEI-sgRNA与基因组PCR引物设计；（B）在6孔板中，HUWEI-sgRNA/Cas9克隆与sgRNA/Cas9对照克隆（泳道2）转染HEK293T细胞。转染40h后收集细胞，提取基因组DNA并用HUWE特异的PCR引物进行PCR扩增，凝胶纯化PCR产物，将纯化后的产物与缓冲液混匀，经变性、退火后在37℃水浴下T7 ENI剪切60min。HUWEI经PCR后的产物片段长度应为520bp，T7 ENI剪切后的产物应分别为330bp和190bp。
图7. CRISPR-Cas9多重靶向编辑多个基因。实验组（1-4泳道）为Cas9表达克隆及分别表达靶向p53, HUWE1, NCL3&和 GFP基因的sgRNA克隆质粒共转染HEK293t GFP稳转细胞。对照组（5-8泳道）为Cas9表达克隆质及随机sgRNA表达克隆的质粒共转染HEK293t GFP稳转细胞。通过T7核酸内切酶检测分析基因组DNA各个靶点上同时存在的插入缺失。*号标记的条带显示Cas9核酸酶及分别靶向多个靶点的sgRNA都在目标靶点上有效地诱发了插入缺失突变（1-4道）。PCR产物条带及T7核酸内切酶酶切产物条带大小：GFP: 720bp (完整), 340bp + 380bp (酶切); NCL3: 765bp (完整), 295bp +470bp (酶切); HUWE: 520bp (完整), 190bp + 330bp (酶切); P53: 825bp (完整), 475bp + 350bp (酶切).&
CRISPR-Cas9 客户定制服务
GeneCopoeia提供基于CRISPR-Cas9体系的靶向基因组修饰因子的设计，构建和验证服务。
代理报告基因检测
细胞水平功能验证。通过共转染后检测报告基因的表达水平验证CRISPR-Cas9系统的功能。
T7核酸内切酶I 酶切检测
染色体水平功能验证。通过检测CRISPR-Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）在染色体靶点上生成的插入缺失突变验证其功能。(图6& 图7)
供体克隆服务
供体克隆设计与构建
我们会依据您的实验需求，提供供体克隆客户定制服务。供体克隆能将您感兴趣的基因、筛选标记或遗传因子通过CRISPR-Cas9介导的同源重组整合到宿主细胞的基因组内。我们提供一系列含有不同筛选标记及遗传因子的供体载体设计以满足您的实验需求。.
稳转细胞株服务
单克隆细胞株
含有CRISPR-Cas9介导的基因组修饰的单克隆细胞系。
为含有CRISPR-Cas9介导的基因组修饰的单克隆细胞系建库。
供体载体类型
Puromycin/TK
Neomycin/TK
Puromycin/TK
Neomycin/TK
Cas9 核酸酶表达克隆
在宿主细胞中表达Cas9核酸酶。Cas9核酸酶能在sgRNA引导下剪切靶标DNA，形成双链断裂(DSBs)。
Cas9 切口酶表达克隆
在宿主细胞中表达Cas9切口酶。Cas9切口酶能在sgRNA引导下剪切靶标DNA的结合链，在其上造成单链缺刻。
sgRNA 克隆
在宿主细胞中转录sgRNA。sgRNA能识别靶标DNA，并引导Cas9蛋白到靶点行使基因组编辑功能。
* 同时订购sgRNA克隆时价格减为￥2400
& GeneCopoeia提供多层次的TALENs,TALE-TFs和其他基于TALE的靶向基因组修饰工具的设计，构建和验证服务。
&&&专为基因敲入实验与应用设计，能将你的目标基因、筛选标记或其他遗传因子靶向敲入人类第十九号染色体上的AAVS1 safe harbor位点。在AAVS1位点上插入外源基因片段能保证转入基因片段的功能，对细胞无已知的副作用。.
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