朊病毒蛋白体外转化
（1.中国农业大学动物医学院 国家动物海绵状脑病实验室， 北京 海淀 .广东省农业科学院兽医研究所， 广东 广州 510640）
朊病毒疾病，包括新型变异型克雅氏病（vCJD）、牛海绵状脑病（BSE）、鹿慢性消耗性疾病（CWD）和羊痒病等，都属于神经退行性疾病。这种难以灭活并且不含常规核酸的非传统性病原体被命名为朊病毒。朊病毒由错误折叠的PrPSc(Proteinase-resistant Protein)组成，并通过一个自我繁殖过程诱导宿主编码的糖蛋白PrPc（Cellular Prion Protein）经过一种构象改变形成新的PrPSc分子。
目前对于传染性PrPSc蛋白诱导宿主PrPc转变成为PrPSc，进而形成新的PrPSc分子的机制还不明确。特别还不清楚在体外产生新的朊蛋白除了PrPSc和PrPc之外是否还需要其他物质。其转变过程的结构和化学动力学上的机制也不明确。现在国外报道的体外转化技术主要有以下几种。
1&朊病毒体外转化的两种主要技术
&&& 对于PrP（Prion Protein）体外转化技术目前主要有两种类型（见表1）。最初，Caughey和他的同事研究出了一种使用纯化的PrP分子的不含细胞的放射标记转化技术。这种方法包含了朊病毒在体内转变的许多特征，并且已经成功地概括了PrPres（类似于PrPSc的分子）形成的几个重要分子方面的性质。Saborio和Soto创建了一种名为朊病毒错误折叠循环扩增（PMCA-protein misf& olding cyclic amplification）的方法，在有阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）存在的条件下这种方法可以通过重复扩增直接超声波降解产物,并在豚鼠大脑匀浆中有效扩增PrPres。与用纯化的PrP进行的PrPres转变相比，PMCA转化法中PrPc的比例大大超过PrPSc，并产生了一定量的PrPres扩增产物。并且，不含细胞的纯化的PrP转化法要求PrPSc50倍于PrPc才能启动PrPres的合成，PMCA法则在PrPSc∶PrPc小于1∶100时就能进行。
表1& 体外PrP转化技术比较（略）
2&改良的PMCA技术
已经发现PrPres在体外转化中粗的脑组织匀浆比纯化的效率更高，这个发现暗示着对于高效率的PrPres转化可能还需要其他未知的宿主因素。因此，又发明了一种改良的PMCA技术用于研究PrPres合成的生物化学机制。
2.1& PrPres扩增的几个基本参数& 超声波降解和SDS这两个因素都能使生物大分子变性，已有研究表明这两种因素对PrP的结构有影响。试验表明在缺乏超声波降解和SDS的条件下，可以通过将正常的脑组织匀浆与1∶50倍稀释的羊痒病脑组织匀浆混合，能够产生6倍的PrPres。在体外扩增PrPres时，最适的pH值为6～8，但也因物种而有所差异。这些因素说明PrPc转化为PrPres将在pH值环境最佳的细胞部位发生，比如细胞膜的外表面或是细胞质内。动力学和温度控制试验表明PrPres扩增的适宜温度为25℃～37℃，而不是4℃。
2.2& 巯基能够抑制PrPres的扩增 选择性的硫醇阻断化合物试验表明，在PrPres体外扩增时要求不含巯基。有几个证据证明硫醇阻断剂可以有效抑制PrPc向PrPres的体外转化：（1）N-己基马来酰亚胺（NEM-N-ethylmaleimide）和两种选择性的硫醇阻断剂在体外可以抑制PrPres扩增。（2）在纯化的膜反应物中硫醇阻断剂也能抑制PrPres扩增。（3）预淬灭的NEM可以阻止抑制的发生。（4）将正常的脑组织匀浆用NEM进行预处理，可以抑制PrPres的扩增。
2.3& 蛋白多糖可以刺激PrPres扩增 现已证明硫酸多糖中名为粘多糖（GAGs）和含GAG的蛋白多糖是另一类可以刺激朊病毒体外转化的分子。特别是乙酰肝素硫酸GAGs富含神经性硫酸多糖，因此研究者致力于硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HPSG）在朊病毒转化过程中作为辅助因子的研究。在不含细胞的放射性转化试验中，硫酸乙酰肝素和多聚硫酸戊聚糖都能促进纯化的PrPc转变为PrPres。在培养的朊病毒感染细胞中，用肝素酶Ⅲ或雌二醇β-D木糖苷（一种糖基化蛋白多糖抑制剂）进行处理，可以降低PrPSc的水平。氯酸钠是一种GAG硫酸盐抑制剂，在朊病毒感染的细胞中也能抑制PrPSc的形成。HPSG分子是PrP的共受体，并且HPSG在PrP相互作用的位点已被确认。这些来自不同试验的结果表明内源性的HPSG分子在PrPSc的体外和体内形成中可能都起重要作用。
3& RNA分子刺激朊病毒蛋白的转化PrP体外扩增试验表明特异性的RNA分子可以促进PrPSc的形成& 第一个证明RNA可能在PrPSc形成中起作用的证据是，发现在一个试验中胰腺核糖核酸酶可以抑制PrPSc扩增。体外PrPSc扩增可以通过纯化的核糖核酸酶A和核糖核酸酶T1阻断，这些酶可以通过不同的催化机制裂解单链RNA。但是PrPSc扩增并不会被其他酶包括脱氧核糖核酸酶和肝素酶阻断。试验证明增加RNA的总量可以刺激PrPSc扩增，但是其他的聚阴离子，比如单链DNA、多腺苷酸、硫酸乙酰肝素、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、硫酸戊聚糖等在相似条件下都不能刺激PrPSc扩增。进一步的试验证明RNA辅助因子刺激PrPSc扩增是有种特异性的。豚鼠和大鼠的RNA可以有效刺激PrPSc扩增，但是来自埃希氏大肠杆菌、啤酒酵母、果蝇的RNA并不具有活性。这些数据说明无脊椎动物缺少可以有效刺激哺乳动物细胞PrPSc扩增的特异性RNA分子。试验证明在PMCA技术中RNA分子可以有效刺激PrPSc的扩增。&
4&体外氧化过程转化重组的PrPc成为类PrPSc样物质这种转化技术只需要纯化的重组PrPc，普通的化学物质，而并不需要感染的脑组织或PrPSc。在适度的碱性环境，并有大量的盐和适当的盐酸胍，然后将pH值逐渐下降到中性环境，去除变性剂。实验证明，加入酶蛋白抑制剂后转变的PrP不能被消化。并且这种转化后的PrPc的性质与PrPSc相似。如果加入转化后的PrP，可以增加转化的效率。
5&在活体细胞中表达PrPSc样物质
5.1 在酵母内质网中表达PrP& 在酵母内质网中植入PrPc的22个氨基酸的氨基酸末端信号序列，同时它的23个羧基端氨基酸被移出，并将小鼠的PrP序列（23～231个氨基酸）与信号肽Ka2蛋白序列融合。结果发现在酵母的分泌物中有几种形式的PrP。实验证明，这种PrP并不溶于去污剂也不能被蛋白酶K所消化。并且实验也证明来自酵母PrP的抗消化片断与PrPSc完全相同。
5.2& 在成神经瘤细胞中转化PrP& 将表达PrP的神经2A鼠成神经瘤细胞中加入二硫苏糖醇（DTT）或衣霉素。在对照的细胞中，3种不同的PrP（未糖基化的，单一的和双糖基化的）均有表达。在只含DTT的组中，糖基化PrP增加，而衣霉素组中的糖基化PrP下降。在含有DTT或衣霉素的组中的PrP溶解性被改变，并且不能被酶蛋白K消化。说明在含DTT或衣霉素时能够促进PrP的转化。目前，急需一种快速和灵敏的朊病毒检测技术以控制北美地区的CWD和欧洲的BSE和vCJD的传播。这种技术应能确认新的感染病例，促进以消灭这些疾病为目标的公共卫生项目的开展。
PrPSc的体外扩增在原则上可以用于增加建立在PrPSc上的检测技术的敏感性，比如标准化的酶蛋白消化——蛋白印迹法、过滤法、ELISA或构象依赖性试验。总之，PrP体外转化和PrPSc扩增系统对朊病毒疾病分子机制的研究有重要意义，包括物种和毒株特异性研究和不含巯基与特异性RNA分子的研究。这些研究增加了对感染性PrP分子的生物物理特性和PrP转化中宿主因素的了解。这也可能促使在公共卫生和临床治疗上取得重要进展。朊病毒蛋白（PrP）有两种：一种是PrPc，一种是PrPsc，它们的比较如下表：
朊病毒蛋白项目
肽链氨基酸排列顺序
相同由此可以推知控制合成这两种蛋白质的基因的核苷酸排列顺序以及它们表现出不同性质的原因分别是（　　）A．不相同；溶解度不同B．不相同；氨基酸组成的种类不同C．相同；空间结构不同D．相同；组成氨基酸的数量不同
蛋白质的氨基酸序列是经过转录和翻译过程形成的，翻译的模板是mRNA，蛋白质的氨基酸序列相同则mRNA的碱基序列相同，mRNA是以DNA为模板转录而来的，mRNA的碱基序列相同，那么DNA的碱基序列也相同；分析表格可知，PrP与PrPsc的肽链氨基酸排列顺序，因此控制合成这两种蛋白质的基因的核苷酸排列顺序相同；PrP与PrPsc的溶解度和致病性不同是由于蛋白质的空间结构不同．A、分析题图可知，PrPc与PrPsc肽链氨基酸排列顺序相同；它们表现出不同性质的原因是蛋白质的空间结构不同，A错误；B、分析题图可知，PrPc与PrPsc肽链氨基酸排列顺序相同；它们表现出不同性质的原因是蛋白质的空间结构不同，不是氨基酸组成的种类不同，B错误；C、分析题图可知，PrPc与PrPsc肽链氨基酸排列顺序相同；它们表现出不同性质的原因是蛋白质的空间结构不同，C正确；D、分析题图可知，组成氨基酸的数量相同，D错误．故选：C．
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阅读题干和表格可知，本题是蛋白质结构多样性与功能多样性，先分析表格获取信息根据表格提供的 信息进行推理判断．
本题考点：
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本题的知识点是转录和翻译过程，蛋白质功能多样性的原因，主要考查学生通过题干获取信息并利用信息进行推理和判断的能力，以及运用所学的知识综合解题的能力．
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朊病毒蛋白(PrP)有两种，一种是PrPc，一种是PrPsc，它们的比较如下表。因此可以推知控制合成这两种蛋白质的核苷酸排列顺序以及它们表现出不同性质的原因分别是
A．不相同；溶解度不同B．不相同；氨基酸组成的种类不同C．相同；空间结构不同D．相同；组成氨基酸的数量不同
题型：单选题难度：中档来源：0121
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蛋白质的结构病毒的结构和繁殖过程
蛋白质结构的形成及多样性： 1、蛋白质的结构层次:2、蛋白质种类多样性的原因:(1)氨基酸的原因: ①氨基酸的种类不同。 ②氨基酸的数目成百上千。 ③氨基酸的排列顺序千变万化。(2)肽链的原因： 肽链的盘曲、折叠方式及其形成的空间结构千差万别。 &知识点拨：1、脱去的水分子中的氢来自氨基和羧基，氧来自羧基。 2、肽键的写法有以下几种，这三种都是正确的。 或-CO-NH-或-NH-CO- 3、多肽中具体有几个氨基或几个羧基，应关注R基中是否有氨基或羧基。 4、若形成的多肽链是环状：氨基酸数=肽键数=失去水分子数。 5、在蛋白质分子量的计算中若通过图示或其他形式告知蛋白质分子中含有二硫键时，要考虑脱去氢的质量，每形成一个二硫键，脱去2个H。 &&知识拓展： 氨基酸形成多肽过程中的相关计算1、蛋白质分子量、氨基酸数、肽链数、肽键数和脱去水分子数的关系 (1)肽键数=脱去水分子数=氨基酸数一肽链数； (2)蛋白质分子量=氨基酸数目x氨基酸平均相对分子质量一脱去水分子数×18。&
注：1、氨基酸平均相对分子质量为a。 2、蛋白质中游离氨基或羧基数的计算 (1)至少含有的游离氨基或羧基数=肽链数 (2)游离氨基或羧基数=肽链数+R基中含有的氨基或羧基数 3、蛋白质中含有N、O原子数的计算 (1)N原子数=肽键数+肽链数+R基上的N原子数=各氨基酸中N原子总数。 (2)O原子数=肽键数+2×肽链数+R基上的O原子数=各氨基酸中O原子总数一脱去水分子数。 4、巧记氨基酸结构通式让学生把自己身体想象成一个氨基酸分子：中央C原子、头-H原子、右手——氨基(-NH2)左手——羧基（-COOH）、脚-R基（-R） 5、巧记脱水缩合过程 首先由两个人手拉手，一个人出左手拉住另一个人的右手，脱去一分子水，形成二肽。然后再加上一个人，又脱去一分子水，形成三肽，以此类推，形成多肽。 病毒：1、病毒：（virus)是由一个核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构成的非细胞形态的靠寄生生活的生命体。2、结构：病毒是比细菌还小、没有细胞结构、只能在细胞中增殖的微生物。由蛋白质和核酸组成。多数要用电子显微镜才能观察到。3、其主要特点是：①形体极其微小，一般都能通过细菌滤器，因此病毒原叫“滤过性病毒”，必须在电子显微镜下才能观察。 　　②没有细胞构造，其主要成分仅为核酸和蛋白质两种，故又称“分子生物”； 　　③每一种病毒只含一种核酸，不是DNA就是RNA。 　　④既无产能酶系，也无蛋白质和核酸合成酶系，只能利用宿主活细胞内现成代谢系统合成自身的核酸和蛋白质成分。 　　⑤以核酸和蛋白质等“元件”的装配实现其大量繁殖。 　　⑥在离体条件下，能以无生命的生物大分子状态存在，并长期保持其侵染活力。 　　⑦对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感。 　　⑧有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。4、病毒的分类：（1）从遗传物质分类：DNA病毒、RNA病毒、蛋白质病毒（如：朊病毒） 　　（2）从病毒结构分类：真病毒（Euvirus，简称病毒）和亚病毒（Subvirus，包括类病毒、拟病毒、朊病毒） 　　（3）从寄主类型分类：噬菌体（细菌病毒）、植物病毒（如烟草花叶病毒）、动物病毒（如禽流感病毒、天花病毒、HⅣ等） 　　（4）从性质来分：温和病毒（HⅣ）、烈性病毒（狂犬病毒）。 5、病毒的形态：⑴球状病毒；⑵杆状病毒；⑶砖形病毒；⑷冠状病毒；⑸丝状病毒 ⑹链状病毒；⑺有包膜的球状病毒；⑻具有球状头部的病毒；⑼封于包含体内的昆虫病毒。知识拓展：1、病毒的复制过程叫做复制周期，其大致可分为连续的五个阶段：吸附、侵入、增殖、成熟（装配）、裂解（释放）。2、主要危害：致瘤作用：有病毒内部构造一些病毒能诱发良性肿瘤，如痘病毒科的兔纤维瘤病毒、人传染性软疣病毒和乳多泡病毒科的乳头瘤病毒；另有一些能诱发恶性肿瘤，按其核酸种类可分为DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒。3、生物病毒的好处：（1）噬菌体可以作为防治某些疾病的特效药，例如烧伤病人在患处涂抹绿浓杆菌噬菌体稀释液 　　（2）在细胞工程中，某些病毒可以作为细胞融合的助融剂，例如仙台病毒 　　（3）在基因工程中，病毒可以作为目的基因的载体，使之被拼接在目标细胞的染色体上 　　（4）在专一的细菌培养基中添加的病毒可以除杂 　　（5）病毒可以作为精确制导药物的载体 　（6）病毒可以作为特效杀虫剂 　　（7）病毒还在生物圈的物质循环和能量交流中起到关键作用． 　（8）病毒还可以用来治疗疾病，比如癌症
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