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芦笋皂苷的抗肿瘤作用进展
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关于芦笋总皂苷含量测定的比色法研究
&【编者按】医药是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的论说性文章。精品学习网为您提供医药论文范文参考，以及和格式排版要求，解决您在论文写作中的难题。
关于芦笋总皂苷含量测定的比色法研究
作者：赵建华， 宋擎， 汪素芳， 苏强， 张立伟
　　目的考察糖类、氨基酸及黄酮类物质对茴香醛-硫酸法测定芦笋总皂苷含量时的影响，并确定该法的最佳比色条件。方法选用菝葜皂苷元为对照品，采用茴香醛-硫酸法，在429
nm处测定糖类、氨基酸及黄酮类物质的吸光度，并利用正交实验设计优化比色条件。结果在429
nm处3类物质除黄酮类有较小的末端吸收外均无明显吸收，干扰较小。最优比色条件为样品挥干，加入1%茴香醛无水乙醇溶液0.2 ml，100℃水浴30
min，冷却后测定。结论该法操作简便，干扰小，比色条件经济，可靠，便于实际应用。
【关键词】 芦笋边角料 总皂苷 茴香醛-硫酸法 干扰因素考察 比色条件优化
芦笋Asparagus officinalis
Linn.，学名石刁柏，为百合科天门冬属多年生草本植物，是一种药食两用的植物，其根茎入药，性苦，微辛，微温，功能温肺下气[1，2]。成分分析表明，芦笋中含有游离氨基酸、维生素、微量元素硒等多种营养成分，以及甾体皂苷、多糖、黄酮类等药用成分[3]，具有极高的药用价值。现代药理学研究表明：芦笋提取物对多种癌细胞均有抑制作用，具有降血脂、提高人体免疫功能、抗衰老等功能，其中，甾体皂苷为重要的物质基础[4]。国内外文献报道，芦笋中含有多种甾体化合物，已分离得到19种甾体皂苷[5～7]，结构分析表明，芦笋皂苷多为螺甾皂苷，其苷元多为菝葜皂苷元[4]。
目前，植物总皂苷的含量测定主要为比色法，选用不同的显色体系，常见有乙酸酐-浓硫酸法、高氯酸法、浓硫酸法、香草醛-高氯酸法、香草醛-硫酸法、对二甲氨基苯甲醛法及茴香醛-硫酸法等7种。我们前期研究发现[8]，针对芦笋总皂苷的测定，综合考虑各因素的影响，茴香醛-硫酸法优于其它6种方法。本文基于茴香醛-硫酸试剂与螺甾皂苷的专属性反应，以菝葜皂苷元为对照品，考察了芦笋中几种常见物质：糖类(葡萄糖、蔗醣、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖)，氨基酸(半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、赖氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、异亮氨酸)及黄酮类(槲皮素、芦丁)对茴香醛-硫酸比色法[9]测定芦笋总皂苷含量的影响，并利用正交实验法优化了茴香醛-硫酸比色法的最佳比色条件，以期为进一步精确测定芦笋总皂苷含量奠定基础。
1 仪器与材料
1.1 仪器 HP 8453UV-Vis 吸收光谱仪(美国惠普公司);UNICO
7200型可见分光光度计[尤尼柯(上海)仪器有限公司];BS110s电子天平(北京塞多斯天平有限公司)。
材料茴香醛(CP，天津市光复精细化工研究所);菝葜皂苷元(中国药品生物制品检定所，批号508);芦笋总皂苷(本室自制);槲皮素(中国药品生物制品检定所，批号
200406);芦丁(中国药品生物制品检定所，批号 020620);所用单糖、双糖、氨基酸及其余化学试剂均为国产分析纯试剂。
2 方法与结果
2.1 茴香醛-硫酸法的干扰因素考察
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取菝葜皂苷元5 mg，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容，吸取1 ml溶液稀释至10 ml，即得。
2.1.2 样品溶液的制备依次精密称取芦笋总皂苷、各种糖类、氨基酸、黄酮各5 mg，分别置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容，即得。
2.1.3 显色溶液的制备吸取8 ml无水乙醇于10 ml容量瓶中，加入1 ml浓硫酸，摇匀，冷却至室温，加入50
&l茴香醛，无水乙醇定容，摇匀，即得。
2.1.4 测定方法分别精密吸取&2.1.2&项下各溶液1 ml，挥干溶剂，加入新鲜配制的0.5%茴香醛-浓硫酸乙醇液0.5 ml，100℃水浴15
min，取出冷却，加入无水乙醇5.0 ml，茴香醛-浓硫酸乙醇液做空白，于350～800 nm波长进行扫描，比较3类物质对测定方法的影响。
测定结果显示，在429
nm(&1nm)附近菝葜皂苷元和总皂苷均有明显吸收峰，糖类在此处均无明显吸收(图1)，说明糖类对茴香醛-浓硫酸法干扰很小;在同等条件下，15种氨基酸在429
nm(&1 nm)附近也均无明显吸收(图1)，且曲线均在基线附近，说明氨基酸对茴香醛-硫酸法基本没有影响。图2显示，两种黄酮在429 nm(&1
nm)附近均有吸收峰末端，但吸收不是很大，说明黄酮类物质对茴香醛-硫酸法有一定的影响。
2.2 茴香醛-硫酸法比色条件的优化
正交实验法优选茴香醛-硫酸法比色条件设计L9(34)正交表对显色剂浓度、反应时间、反应温度、显色剂体积4因素进行考察。水平因素见表1，测定结果及极差分析见表2，方差分析及最小二乘法分析结果见表3～4。表1
正交实验因素水平表(略)表2 正交实验测定结果及极差分析结果(略)表3 正交实验结果方差分析表(略)表4 各因素水平最小二乘法平均值(略)
从分析结果的R值得出，4因素对测定结果的影响顺序为反应温度&显色剂体积&反应时间&显色剂浓度，最优显色条件为A3B2C3D1，即5%茴香醛无水乙醇液，吸取0.2
ml，100℃水浴30 min。
查F值分布表可知，F0.05(2,2)=19.0，F0.01(2,2)=99.0，根据方差检验判断标准，当F值大于F0.05小于等于F0.01时，该因素作用显著，记为&*&。从表3得知，4个因素的F值均大于F0.05(2,2)小于F0.01(2,2)，因此判定4个因素对实验影响均较为显著，根据F值大小排序，可以看到4个因素的影响次序为反应温度&显色剂体积&反应时间&显色剂浓度，其结果与极差分析结果相吻合。
由表4中看到，取各因素最小二乘法平均值中的最大值，得到条件为显色剂浓度5%，反应时间30 min，反应温度100℃，显色剂用量0.2
ml，其结果与极差分析结果吻合。
在实验过程中发现数据中5%茴香醛乙醇溶液与1%两个浓度的差别很小，且5%对茴香醛用量较大，如果用1%浓度代替5%浓度，会大大节省显色剂用量，因此在进行最优工艺验证时，同时对1%浓度条件进行了平行实验，以观察两种浓度的差异。
2.2.2 最优比色条件验证精密吸取&2.1.1&项下菝葜皂苷元溶液1
ml共10份，分别置于10支具塞试管中，挥干溶剂，试管从1～10标号，其中1～5号试管加入5%茴香醛乙醇溶液0.2
ml，6～10号试管中加入1%茴香醛溶液0.2 ml，100℃水浴30 min，取出冷却，于429 nm下测定吸光度。结果见表5。表5
最优比色条件验证结果(略)
对上表两组数据进行双样本t检验，结果P=0.118&0.05，表明两组实验方差是一致的，两种浓度之间无显著差异。从测得的吸光度来看，两种浓度显色剂的吸光度值均超过了正交实验数据，符合正交实验结果。因此将显色剂浓度换为1%茴香醛乙醇是可行的。这也从另一角度说明1%的浓度已基本能够反应完全，而过量的茴香醛反而造成不必要的浪费。
综上所述，最后确定茴香醛-浓硫酸法显色条件为1%茴香醛无水乙醇溶液，吸取0.2 ml，100℃水浴30 min。
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芦笋中甾体皂苷结构和功能特性的研究进展
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芦笋中甾体皂苷结构和功能特性的研究进展
官方公共微信芦笋质量控制的现代分析方法研究
优秀研究生学位论文题录展示芦笋质量控制的现代分析方法研究专　业: 药物分析学关键词: 芦笋 质量控制 氨基酸 黄酮苷 全二维液相色谱 体外抗氧化活性分类号: R151形　态: 共 156 页　约 102,180 个字　约 4.888 M内容阅　读:
内容摘要芦笋是百合科天门冬属植物，是世界十大名菜之一，味道鲜美、营养丰富，并具有很好的保健功效。研究表明，芦笋具有多种药理活性，如抗肿瘤、降血脂、增强免疫力、抗衰老、抗疲劳和保护肝脏等。目前，对芦笋化学成分的研究较少，仅停留在总黄酮和总皂苷的初步分离纯化上，因此，尚无法对芦笋进行全面有效的质量控制。本论文首先对芦笋的营养成分进行了较为全面的质量控制，然后对芦笋中的化学成分进行分离鉴定，并对芦笋黄酮部位进行富集纯化并作定量分析，再通过二维柱切换液相色谱法分离制备了芦笋中五种黄酮苷，并采用全二维液相色谱法对芦笋黄酮部位进行了分析，考察了各成分与脂质体膜之间的相互作用，最后对所得五种黄酮苷和芦笋黄酮部位进行了体外抗氧化活性研究，初步揭示并验证了芦笋发挥药理活性的物质基础和黄酮抗氧化活性的构效关系。
一、芦笋中营养成分的质量控制
1、氨基酸在pH5.5时与茚三酮反应形成蓝紫色化合物，颜色的深浅与溶液中氨基酸的含量成正比，且在570nm处有最大吸收，利用此原理，测定该波长处的吸光度即可计算氨基酸浓度。本实验以L-谷氨酸为标准品对方法学进行了全面考察，线性回归方程为A=0.3(r=0.9998)，线性范围30.30-151.50μg\mL，样品经显色反应后在1.5h小时内稳定，精密度、重现性和回收率结果均符合要求。十批不同来源的鲜芦笋样品中总游离氨基酸含量为17.43-22.43‰。
2、考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，在稀酸中与蛋白质结合变成蓝色，最大吸收波长也从465nm变成595nm，蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，因此，可以根据此原理测定蛋白质含量。本实验以牛血清白蛋白为标准品对方法学进行了全面的考察，线性回归方程为A=0.4(r=0.9996)，线性范围19.80-99.00μg\mL，样品经显色反应后在1.5h小时内稳定，精密度、重现性和回收率结果均符合要求。十批不同来源的鲜芦笋样品中总蛋白质含量为1.08-1.69‰。
3、芦笋中总多糖的含量测定采用的是硫酸葸酮显色法，以葡萄糖为标准品，线性方程为A=0.7(r=0.9990)，线性范围20.00-100.00μg\mL，样品经显色反应后在1.5h小时内稳定，精密度、重现性和回收率结果均符合要求。十批不同来源的干燥芦笋样品中总多糖含量为1.16-1.64%。
4、选择AOC为衍生化试剂，以普通C18柱作为分离载体，建立了芦笋水解氨基酸的指纹图谱，确定了16个共有峰，鉴定了其中的11个氨基酸，并在指纹图谱条件的基础上测定了10批芦笋中11种氨基酸的含量，结果如下：组氨酸2.97-5.56%0，甘氨酸0.39-0.53%0，天冬氨酸1.64-3.63%0，谷氨酸0.89-1.55‰，苏氨酸0.32-0.46%0，丙氨酸0.32-0.57%0，胱氨酸0.47-1.01‰，酪氨酸0.23-0.28‰，缬氨酸0.36-0.65‰，亮氨酸0.37-0.60‰，苯丙氨酸0.35-0.44%0。
二、芦笋的化学成分研究
1、芦笋中两种嘌呤类化合物的分离制备
干燥芦笋药材的60%乙醇回流提取液浓缩后过大孔吸附树脂柱，收集20%乙醇洗脱流分，再经葡聚糖凝胶柱脱色，纯化后的样品采用制备液相色谱法分离，得到两种嘌呤类化合物，经1HNMR和13CNMR鉴定为9-(2-甲硫基-3-磺酸基-4-羟基)-呋喃-6-氨基-嘌呤和腺苷。
2、芦笋中五个黄酮类化合物的分离制备
干燥芦笋药材的60%乙醇回流提取液浓缩后过大孔吸附树脂柱，收集40%乙醇洗脱流分，再经葡聚糖凝胶柱脱色，纯化后的样品采用制备液相色谱法分离，得到五种黄酮苷，经HPLC-DAD-MS鉴定为槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖.芸香糖苷、烟花苷和水仙苷。
3、芦笋中一种有机酸的分离制备
干燥芦笋药材的60%乙醇回流提取液浓缩后过大孔吸附树脂柱，收集60%乙醇洗脱流分，再经葡聚糖凝胶柱纯化，即得纯品，经1HNMR和13CNMR鉴定为肉桂酸。
三、芦笋黄酮部位的制备与定量分析
1、干燥芦笋药材的60%乙醇回流提取液浓缩后过大孔吸附树脂柱(60×4cm)，先静止吸附1h，再分别用水1500mL、20%乙醇2000mL和40%乙醇2000mL依次洗脱。收集40%乙醇部分并于50℃减压浓缩至干，加30%甲醇溶解后，过Sephadex LH-20型葡聚糖凝胶柱(100×3cm)，分别用300mL水、200mL50%甲醇和1000mL甲醇依次洗脱，收集含黄酮的流分，合并后于50℃减压浓缩至干，即得芦笋黄酮部位。
2、采用紫外分光光度法，以芦丁为标准品，测定了芦笋黄酮部位中总黄酮含量，并对方法学作了详细考察，线性回归方程为A=0.4(r=0.9992)，线性范围62.00-310.00μg\mL，样品经显色反应后在1.5h小时内稳定，精密度、重现性和回收率结果均符合要求。所测三批样品中总黄酮的含量均高于50%。
3、采用高效液相色谱法测定了芦笋黄酮部位中槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷和水仙苷的含量，色谱条件如下：色谱柱为Diamonsil(R)(钻石)C18柱(200×4.6mm，5μm)(DikmaTechnologies)，流动相：乙腈-甲醇-0.1%醋酸水(8:16：76)，流速1.0 mL\min，柱温30℃，检测波长260nm，进样量20μL，方法学考察结果符合要求。测定三批样品中槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷和水仙苷的含量分别为11.26-12.62%，22.64-24.78%，4.37-5.09%，4.13-4.89%，3.22-3.63%。
四、芦笋中黄酮苷单体的二维色谱法制备及芦笋黄酮部位的全二维液相色谱分析
1、采用二维柱切换液相色谱分离制备了芦笋中五种黄酮苷单体(槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷和水仙苷)，该系统维间切换没有用到定量环，而是用六通切换阀取而代之，这样可以确保组分被全部切换进入第二维，避免了样品损失，且切换体积不受定量环限制。与普通的一维制备液相色谱法相比，该法可以大大提高分离效率，并节约有机溶剂用量。
2、采用HSCCC-PHPLC二维方法从芦笋黄酮粗品中分离制备了五个黄酮苷单体(槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷、烟花苷和水仙苷)。该方法中，HSCCC作为一种预处理手段，分离得到两个含目标成分的流分，继而通过制备液相色谱进一步分离得到高纯度的目标化合物。该法避免了繁琐的样品柱色谱预处理过程，具有操作简便、制备效率高等优点。
3、采用全二维液相色谱法分析了芦笋黄酮部位，第一维采用的是脂质体柱(250×4.6mm，5μm，自制)，流动相为10mmol\L，pH7.4的醋酸铵缓冲液，流速0.1mL\min：第二维采用Chromolith Performance RP-18e(100×4.6mm)整体柱，流动相采用A：乙腈，B:10%乙腈梯度洗脱，0-2min3%A，2-4min3%A-17%A，4-4.5min，17%A-3%A，4.5-5.0min，3%A，流速3.0 mL\min。通过考察芦笋中不同成分在脂质体柱上的色谱行为，可以判断各成分与脂质体膜之间的相互作用强弱，从而推断药物在生物体内的ADME。
五、芦笋总黄酮及其黄酮苷单体体外抗氧化活性研究
以VitC为阳性对照药物，系统研究了芦笋总黄酮及其黄酮苷单体的体外抗氧化活性。结果表明，芦笋中的黄酮苷单体有较强的抗氧化活性：能明显清除?OH和D2-，对DPPH自由基也有较强的清楚作用，具有较强的抑制大鼠红细胞氧化溶血的作用。芦笋总黄酮也有相应的体外抗氧化活性，强度与总黄酮含量相关。本实验验证并揭示了芦笋发挥多种药理活性的物质基础和黄酮类化合物抗氧化活性的构效关系。
综上所述，本论文以芦笋的质量控制为目的，建立了总游离氨基酸、总蛋白质和总多糖三大营养成分的定量分析方法，建立了芦笋水解氨基酸的指纹图谱并对其中11种氨基酸作了定量分析。为了进一步了解芦笋发挥药理活性的物质基础，本论文对芦笋的化学成分作了初步研究，首次从芦笋中分离出两种嘌呤类化合物、五种黄酮苷和一种有机酸。建立了芦笋黄酮部位的制备方法和定量分析方法，为今后进一步开发芦笋黄酮打下了基础。本论文还建立了芦笋中五种黄酮苷的二维柱切换液相色谱制备方法和HSCCC-PHPLC二维制备方法，与传统制备液相色谱法相比，这两种方法具有制备效率高、溶剂消耗少等优点。本论文采用全二维液相色谱法分离分析了芦笋黄酮部位，考察了芦笋中不同成分与脂质体膜之间的相互作用。最后，本论文对芦笋黄酮部位和芦笋中五种黄酮苷的体外抗氧化活性作了系统考察，验证并揭示了芦笋发挥药理活性的物质基础和黄酮类化合物抗氧化活性的构效关系..……
全文目录文摘英文文摘前言第一章 芦笋中营养成分的质量研究1.芦笋中总游离氨基酸的定量分析1.1仪器与试剂1.2对照品溶液的配制1.3供试品溶液的配制1.4测定方法1.5线性考察1.6精密度试验1.7重现性试验1.8样品溶液的稳定性1.9加样回收率试验1.10定量分析结果2.芦笋中总蛋白质的定量分析2.1仪器与试剂2.2对照品溶液的配制2.3供试品溶液的配制2.4考马斯亮蓝G-250溶液的配制2.5测定方法2.6线性考察2.7精密度试验2.8重现性试验2.9样品溶液的稳定性2.10加样回收率试验2.11定量分析结果3.芦笋中总多糖的定量分析3.1仪器与试剂3.2对照品溶液的配制3.3供试品溶液的配制3.4硫酸蒽酮试剂的配制3.5测定方法3.6线性考察3.7精密度试验3.8重现性试验3.9样品溶液的稳定性3.10加样回收率试验3.11定量分析结果4.芦笋水解氨基酸指纹图谱的建立4.1仪器与试剂4.2对照品溶液配制4.3供试品溶液的配制4.4氨基酸衍生化反应4.5色谱条件4.6精密度试验4.7重现性试验4.8稳定性试验4.9芦笋氨基酸指纹图谱的建立4.10芦笋氨基酸指纹图谱的相似度5.芦笋中11种氨基酸的定量分析5.1线性考察5.2精密度试验5.3重现性试验5.4稳定性试验5.5加样回收率试验5.6芦笋中11种氨基酸的含量6.讨论7.本章小结参考文献第二章 芦笋的化学成分研究1.芦笋中分离得到的几种化合物2.芦笋中两种嘌呤类化合物的分离制备与结构鉴定2.1仪器与试剂2.2药材提取2.3大孔吸附树脂前处理2.4葡聚糖凝胶柱层析2.5半制备型反相高效液相色谱2.6化合物A的结构鉴定2.7化合物B的结构鉴定3.芦笋中五个黄酮苷(C、D、E、F、G)的分离制备与结构鉴定3.1仪器与试剂3.2药材提取3.3大孔吸附树脂前处理3.4葡聚糖凝胶柱层析3.5半制备型反相高效液相色谱3.6五种黄酮苷结构的HPLC-DAD-MS鉴定4.芦笋中一种有机酸的分离制备与结构鉴定4.1仪器与试剂4.2药材提取4.3大孔吸附树脂前处理4.4葡聚糖凝胶柱层析4.5化合物H的结构鉴定5.讨论6.本章小结参考文献第三章 芦笋黄酮部位的制备与定量分析1.芦笋黄酮部位的制备1.1仪器与试剂1.2药材提取1.3大孔吸附树脂前处理1.4葡聚糖凝胶柱层析2.芦笋黄酮部位中总黄酮的含量测定2.1仪器与试剂2.2对照品溶液的配制2.3供试品溶液的配制2.4测定方法2.5线性考察2.6精密度试验2.7重现性试验2.8样品溶液的稳定性2.9加样回收率试验2.10含量测定结果3.芦笋黄酮部位中五种黄酮苷的含量测定3.1仪器与试剂3.2对照品溶液配制3.3供试品溶液配制3.4色谱条件与系统适用性试验3.5线性考察3.6精密度试验3.7稳定性试验3.8重现性试验3.9加样回收率试验3.10样品中五种黄酮苷的含量测定4.讨论5.本章小结参考文献第四章 芦笋中黄酮苷单体的二维色谱法制各及全二维液相色谱分析1.芦笋中黄酮苷单体的二维柱切换液相色谱法制备1.1仪器与试剂1.2样品溶液的制备1.3一维等度洗脱制备方法1.4一维梯度洗脱制备方法1.5二维制备液相色谱分离过程1.6三种制备方法的比较2.芦笋中黄酮苷单体的HSCCC-PHPLC二维制备2.1仪器与试剂2.2芦笋黄酮粗品的制备2.3两相溶剂及样品液的制备2.4 HSCCC分离芦笋黄酮粗品2.5制备液相色谱法分离纯化HSCCC流分“Ⅱ”2.6制备液相色谱法分离纯化HSCCC流分“Ⅳ”2.7实验结果3.芦笋黄酮部位的全二维液相色谱分析3.1材料与试剂3.2样品溶液配制3.3色谱柱的选择3.4样品在两根色谱柱上的一维色谱行为3.5全二维液相色谱对芦笋黄酮部位的分析4.讨论5.本章小结参考文献第五章 芦笋黄酮部位及其黄酮苷单体体外抗氧化活性研究1.仪器与试剂2.实验动物3.五种黄酮苷单体的抗氧化活性3.1槲皮素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷的抗氧化活性3.2芦丁的抗氧化活性3.3异鼠李素-3-O-葡萄糖-芸香糖苷的抗氧化活性3.4烟花苷的抗氧化活性3.5水仙苷的抗氧化活性4.芦笋黄酮部位的抗氧化活性5.讨论6.本章小结参考文献结语综述 二维液相色谱技术发展及应用现状
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TS201.3,53页,R15 R151.43 Q579.11,50页,R15 X524,40页,R151中图分类:
> <font color=@1 > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 营养卫生、食品卫生 > 营养学
& 2012 book.}