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如何做好一张HE染色切片
病理技术如何做好一张HE染色切片
来源：网络| 时间： 17:39:38
　　是目前国内外病理诊断上广泛采用的 常规染色方法。专家们曾指出：&一张好的HE切片是保证正确病理诊断的关键& 。切片质量的好坏，可直接影响疾病诊断的及时与准确性。作为一个合格的病理技术人员，能制作出一张高质量的HE染色切片，是必须掌握的技术之一。
　　1、取材
　　取材的好坏，直接影响切片的质量。在一个规范的实验室，大部份的切片质量问题都是因为取材不好造成的。医生在取材时，首先要有一把锋利的取材刀，在切割组织时要避免取材刀来回拖拉，切取的组织块厚薄要均匀，一般厚度以0.2 ～0.3cm为适，大块癌组织、脂肪组织、肺组织、纤维性肿瘤、平滑肌瘤等致密的或试剂不易渗入的组织应取薄一些；淋巴结应修掉两侧球冠，并尽量剔除周围的脂肪组织。在取材中还应十分注意组织内是否有缝线或骨组织，如碰到不可避免的钙化组织，应与技术室讲明，在切取纤维组织、肌肉组织、胃肠道时，应注意纤维及肌肉的走向，取材时尽可能按与纤维平行走向切取为佳。小标本取材时要注意包埋纸的质量，尽可能选择象桃花纸、包茶叶纸等透水性好的纸张，包时不要双层、多层或折叠层数太多，也不要把过多的组织放在一起，影响脱水液的浸透。特别要注意新鲜组织取材，组织容易粘在包埋盒壁上，导致固定、脱水不佳。如果有可能，应选择剖开固定24小时后再取材。
　　2、固定
　　固定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓&固定&，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构、位置和除水以外的物质的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构和生活时相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加了组织的韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的5倍以上。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。最常用的固定液为10％福尔马林（甲醛）。福尔马林渗透性强，固定均匀，组织收缩小，但经酒精脱水后收缩较大。甲醛不能使白蛋白和核蛋白沉淀。甲醛通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用。由于10％福尔马林受到福尔马林的质量、使用时的挥发和取材时带入水分的影响，浓度容易被降低，导致组织固定不足；而高浓度的福尔马林，降低了对组织的穿透性，形成周围固定好而中央固定不到的现象。所以可以适当的增加福尔马林的浓度，以12％左右为佳。
　　3、水洗
　　固定后应该水洗（10～20分钟），这一步通常被很多人所忽视，固定后不水洗，容易造成脱片和染色不鲜艳。也不利于蜡块内抗原的长期保存。
　　4、脱水
　　所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入，这一过程称为脱水。脱水是否彻底，直接关系到组织是否能充分透明。一般我们总认为脱水主要跟高浓度酒精有关，而忽视了与低浓度的酒精关系，其实75-80%浓度的酒精具有极强的穿透力，在短时间内可以置换出大量的水份，而高酒精容易使蛋白质凝固，在组织的表面形成一层硬壳，使酒精难以渗透到组织块中间去，导致组织脱水不佳；其实高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份，如果脱水时加温过高（超过35-50℃），使用丙酮等等，都容易导致组织收缩过度和组织发硬、发脆。组织脱水引起的组织发脆有三种原因：一种是初始脱水液浓度过高引起组织质地发生改变、硬化；第二种是组织本身质地细腻有关，如小动物肝脏；第三种是假脆（也是组织发脆最主要原因），是由于的脱水不足，组织在浸蜡时蜡无法渗透到组织中去，组织在高温下&干烤&导致发硬、发脆，切片会出现粉粉的或一丝丝的现象，子宫肌瘤等较硬的组织还会一棱棱的现象，甚至会整块整块往外崩；严重脱水不足的组织中间发软，甚至还会有水。
　　5、透明
　　为了使石蜡能够浸入到组织块内，必须经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质，这个过程称透明。目前最好的透明剂是二甲苯。很多人认为二甲苯极容易使组织发脆，这个观点有点片面，在常温下，如果不是时间过长，二甲苯并不会引起组织发脆，相反会使某些组织结构比较质韧的组织（比如子宫肌瘤等）由于透明充分而变的更好切，但是当二甲苯温度超过一定范围以后（45℃以上），才可能引起组织发脆。所以二甲苯透明应该控制在室温，（2道）各30-60分钟为宜。
　　6、浸蜡
　　组织透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。目的为了使石蜡渗透到组织中去。浸蜡温度过高（超过60℃），在蜡内加入二甲苯或由于透明时带入石蜡的二甲苯过多，都会导致组织发硬，还会使组织内的抗原受到破坏；所以浸蜡用的石蜡熔点应该在54-56℃左右（三道），时间：第一道：石蜡30分钟；第二道：石蜡60分钟；第三道：石蜡，90分钟以上。浸蜡温度控制在56～58℃左右。（第一道也可用硬脂酸石蜡1：3混合浸蜡，不仅可软化组织，特别适用于比较韧、硬的组织，而且由于硬脂酸是弱酸性的，染色后核浆比比较鲜明，缺点是容易脱片，疏松组织在展片时容易散开，所以要用后面几道石蜡尽可能将硬脂酸洗净。所以一般不要使用此法）。用开放式的脱水机最好每天打开第一道石蜡的盖子，让二甲苯挥发掉。浸蜡用的石蜡如有杂质应该过滤，以防吸入组织内，造成切片刀刀口受损，或切片破碎和划痕增多。
　　7.包埋
　　用包埋剂来支持组织的过程称包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键一是平整，二是方位。要求在包埋时，应采用镊子轻压组织块拱起部份，使之平贴于底部，通常采用组织的最大面包埋。囊壁、管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织，应尽量放在一起，并保证在一个平面上，蜡块上下应留有余蜡。包埋时还应注意有无缝线，纸絮，如有一定要去除。胃黏膜活检标本，不能按一般的规律取最大包埋面，应采取窄面竖起包埋。包埋的蜡更应过滤，留有杂质的石蜡，容易造成污染或刀口受损。蜡的熔点应在56～60℃之间选择，不提倡在冬天使用软蜡。因为用软蜡包埋的蜡块，到了夏天，会粘在一起，不利于资料的保存，而且即使在冬天，用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切。
　　8、磨刀
　　要想切好一张切片，首先要有一把锋利的切片刀。磨刀是从事切片技术人员的一项最基本技术，刀磨的好坏，直接关系到切片的质量。磨刀的手法各人不同，但都要求用力均匀，使刀口和磨刀石全面接触，两手的用力点应在刀口上，而不是在刀背上。切片刀应用一次磨一次，每次仅需10～15分钟，过长时间的磨刀，容易把已经磨出的锋刃磨掉，检查切片刀是否锋利，用手试摸刀口的方法并不十分科学，不仅不能证明切片刀是否真正锋利，而且容易损害刀口，最简单的办法是每次磨好后拿一个蜡块试切一下。每次磨好刀后，应将磨刀石用盖子盖好，以防灰尘掉在磨刀石上，用有灰的磨刀石磨刀，会使切片刀产生许多细小的缺口。现在很多单位都买了磨刀机，磨刀机用来开刀锋和磨缺口的确不错，但由于磨刀的角度和时间不易精确掌握，故效果并不理想。根据我们的经验，真正的锋刃很难用机器磨出来。一次性刀片在很大程度上解决了这个问题。如用一次性刀片，必须及时更换刀口。粗切的刀口和切片用的刀口最好分开，这样可以节约刀片，也可提高切片质量。
　　9、切片
　　切片前要把切片机上有关的螺旋拧紧，并调整好切片刀的角度。切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大约在15～30微米左右，质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些，粗切致组织全部暴露后，才进行细切。细切至组织块表面均匀一致，无白点后，再把切出的蜡片放入温水中。切片时要求用力均匀、柔和，摇速不易过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均，切片难以展开；过慢会使切片增厚。切片厚度一般为3～5微米。切片的要求是完整、薄、均匀。切下的片膜其大小形状应与组织块一致，切片的不完整，常会将重要病变遗漏，导致误诊、漏诊。在切片放蜡块时，应注意组织包埋的方向，组织的层次，纤维、肌肉等的走向应与切片刀平行，较难切的部分应放在上面，如皮肤的表皮，肿块的包膜，胃肠道的浆膜等，这样可以减少组织的断裂现象。操作切片机时应用力均匀，避免用力过重，减少机器的磨损。在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口，因为每切到一根笔丝，就会增加一个缺口。切片厚度一般为3～5微米，有人认为：只要切片机刻度标着几个微米，切出来的片子就是几个微米。其实不然，当切片刀不锋利，或切片时速度不匀，或切的较慢时，切的片子都会变厚，只有在切片刀十分锋利、切片匀速的情况下，才能真正保证其厚度。
　　下面是切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法：
　　(1)组织发脆：一般是脱水、透明、浸蜡时间太短、起始浓度过高，在切片时，刀要快，片子要切得薄，蜡块不要太冰，可放在冰水里5-10分钟再切片；也可边切边用嘴向蜡片吹气，可能会好些，也可以在蜡块上涂稀氨水；如果与组织本身质地有关（如小动物肝脏），蜡块可采用不冰就切。
　　(2)切片卷起，可能是刀不锋利，或刀锋在另一面，或刀角度过大，切片太厚等等。
　　(3)蜡片弯曲：可能是刀锋不均，切片刀未磨直，切片刀与蜡块不平行。
　　(4) 透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关
　　(5)厚薄不均：可能是刀、刀座及蜡块未夹紧，组织太硬，或切片机主轴太向前，或切片机已磨损。
　　(6)切片出现裂痕：可能是刀有缺口，石蜡内有杂质，组织内有钙化、骨片或有线结, 也可能会有棉纸纤维等。
　　(7)切片不连片，切不下片，切片很厚，或者切片后蜡块发白，内陷：组织脱水不佳。补救办法：可先将蜡块溶解，取出组织，放入加热水浴的丙酮内（80℃），30～60分钟，再进行透明浸蜡包埋切片，也许会好一点。
　　10、展片与捞片
　　展片水温应在42℃至55℃之间，这主要和包埋蜡的熔点和蜡内的添加剂有关,水温过高，会引起组织细胞散开，水温过低，切片皱摺无法摊平。包埋蜡中如有二甲苯，会造成蜡片迅速溶解。而用一次性刀片切的片子，一碰到热水，片子上的皱摺就无法再展开，这有二个方法可以解决：第一、可以在切片时边切边向蜡片吹气，这样的片子就会非常平整，放到热水里就会自然展开，比较方便快捷，但这样的片子会略微厚一点；第二、在切完片子后，先把切片放入冷水，再将切片移到热水，这样的片子会较薄，皱摺、气泡也少，是一个很好的方法，推荐使用。也有人选择先放入酒精，如浓度过高，容易引起切片破碎，出现裂隙；像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织一碰到酒精就会散开，故不作推荐。最后捞片时玻片要干净，要选择那些完整、无皱摺的切片，粘贴于玻片中1/3和下1/3的中间。
　　11、烤片和脱蜡
　　烤片，一般在65℃的温箱内烤片0.5～1小时左右，温度过高，会引起切片细胞收缩；时间太短(少于20分钟)，容易造成脱片。脱蜡也相当重要，如果脱蜡不干净，切片不易着色或着色不匀，所以，脱蜡用的二甲苯要经常更换，一般用3道二甲苯，每500ml液体，处理500张切片后更换一次为宜。当室温低于18℃时，必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡，或将二甲苯放入温箱内预热（37-60℃左右）脱蜡。然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯，至水。
　　12、染色
　　染色的原理分物理作用和化学作用二种：
　　物理作用：分毛细现象，吸附作用和吸收作用，还有分子间的作用力。
　　化学作用：分化学物质的特性基团（酸性、碱性和两性基团）与染料的结合方式（离子键；共价键和氢键）
　　而染料根据来源可分：
　　（1）、天然染料（胭脂红、地衣红、番红花红、靛青等）
　　（2）、合成染料（亚硝基染料、硝基染料、偶氮染料、重氮盐类、醌亚胺染料、苯甲烷类染料、口山 叮类染料、蒽醌染料、噻唑类染料、喹啉类染料）
　　（3）、无机化合物（硝酸银、氯化金、碘、高锰酸钾等）
　　根据染料的化学反应可分：
　　（1）、酸性染料：苦味酸，伊红、酸性品红、刚果红等。酸性染料不是指其水溶液一定显酸性，而是指有酸性助色团与碱作用成盐，其水溶液电离出的有色离子为阴离子。
　　（2）、碱性染料：苏木素，中性红，美蓝、甲基绿等。碱性染料不是指其水溶液一定显碱性，而是指有碱性助色团与酸作用成盐，其水溶液电离出的有色离子为阳离子。
　　（3）、中性染料：是酸性染料和碱性染料混合后而成。如瑞氏染色的碱性染料亚甲蓝和酸性染料伊红混合。
　　苏木素染色时间要根据染料的新旧、温度、切片的类型而定，一般为5－15分钟。经水略洗后，用盐酸酒精分化是关键，分化程度必须用显微镜控制。分化水洗后，可用温水或自来水蓝化，并充分水洗（流水冲洗5分钟以上），以防盐酸残留导致切片褪色。我们不提倡使用碱性溶液（释氨水、肥皂水等）促蓝，尽管蓝化效果很好，但从实践的结果来看，用碱性溶液促蓝的切片不能长期保存，容易褪色。最后入伊红复染（5－20秒）。HE染色的关键在于深浅适度，对比鲜明，一般有经验的，肉眼就能判断，但偶而也会出现失误，所以用显微镜控制是最保险的方法。其关键的步骤在于苏木素染好后的分化及蓝化过程，在蓝化结束后，应在显微镜下观察细胞核着色是否合适，核结构是否清晰，胞浆内是否有残留的苏木素等等。染色理想的切片在显微镜下应是：细胞核与细胞浆应蓝红相映，鲜艳美丽；核浆对比明显，核膜及核染色质颗粒清晰可见。
　　染液的更换也应该量化，苏木素1500张/500ml，依红3000张/500ml（根据配方不同，苏木素和伊红量会有所差异）。
　　13、脱水和封片
　　切片脱水应从低浓度的酒精到高浓度的酒精，80%酒精1道，95%酒精2道，纯酒精2道，二甲苯2道。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水，但也容易使伊红褪色，故脱水时间可短一点，每道1－3分钟，纯酒精每道5-10分钟。为增加酒精与二甲苯的相融性，可在二甲苯前面增加一道正丁醇；石碳酸－二甲苯液也有此效，但石碳酸是弱酸性液体，如不洗净，可引起切片的褪色，不利于切片久存，故不作推荐。切片经二甲苯透明后，用中性树胶封固。为增加切片的透明度，防止细胞收缩、龟裂或切片出现黑色结晶样小点，所以切片应该二甲苯透明后湿封，严禁用温箱烤干或电吹风吹干后封片，这样容易造成细胞收缩。封片时要防止口鼻呼出的气体接触到切片；在天气较潮湿的日子里，不宜一次将多张切片取出待封，以免切片&还潮&，形成透明不佳,出现云雾状水珠。脱水剂的更换也应有一定的时间规定。一般是每500ml液体，处理500张切片后更换一次为宜。封片树胶不能过稀，封片时树胶要均匀充满盖玻片且树胶不及外溢为佳。要将组织全部覆盖，也不能有气泡。但是，也应该从关心技术员的身体健康出发，以人为本，建议有条件的应该购买自动封片机。
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HE染色中的新技巧——变色硅胶应用
病理技术HE染色中的新技巧——变色硅胶应用
来源：朱成| 时间： 13:22:38
　　日常病理过程中，我们往往会遇到一些问题，比如镜下观察切片呈雾蒙蒙状甚至见有小水滴。
　　这往往是切片在经过染色时脱水不充分，或者在进入二甲苯透明的时候被水滴污染。我们知道水与二甲苯是互不相容的，我们经常会看到盛放二甲苯的缸底有整滴整滴的水滴，如果这些水滴沾上切片，势必会导致切片透明效果差，影响显微镜下的观察。解决这样的问题有很多种方法，最常用的就是在透明二甲苯前加一缸二甲苯-石碳酸的混合液，利用石碳酸的吸水性消除混在二甲苯中和切片上的水份，同时因为石碳酸的杀菌作用有利于切片的长期保存。这种方法对切片脱水不净有一定的作用，也可防止将前一缸的水份带入下一缸。
　　但不足是当混合液本身含有较多水份的时候，却不容易被发现；当混合液后的二甲苯被误入水份的时候，也不易被发现，且混在其中的水份也无法去除，简单的将试剂更换势必会造成一定的浪费。
　　针对上述问题，为大家介绍一种方法，既可消除混在二甲苯中的水份，又可清晰反映出混在二甲苯中的水份多少，提示是否需要更换。
　　先介绍一下变色硅胶，是一种外观为蓝色或浅蓝色玻璃状颗粒，具有吸湿后自身颜色由蓝色变红色的特性，是一种高活性吸附材料，属非晶态物质，其化学分子式为mSiO2&nH2O，经硅酸凝胶干燥脱水得到，不溶于水和任何溶剂，无毒无味，化学性质稳定。
　　将变色硅胶加入到透明的二甲苯中，既可吸收二甲苯中的水份，消除对切片透明的影响，并会随着吸收水份的多少而发生颜色的变化，我们可以根据其颜色变化程度了解试剂情况，决定是否需要更换。又因其化学性质的高稳定性，不与二甲苯、酒精等发生反应，且无溶解，对切片不会产生任何影响。
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石蜡切片HE染色（常规HE染色）
病理技术石蜡切片HE染色（常规HE染色）
来源：网络| 时间： 13:15:25
　　石蜡切片（paraffin section） 是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。
　　石蜡切片（常规HE染色）步骤：
　　（1）二甲苯Ⅰ：5～10min；
　　（2）二甲苯Ⅱ：5～10min；
　　（3）无水乙醇Ⅰ：1～3min；
　　（4）无水乙醇Ⅱ：1～3min；
　　（5）95%乙醇Ⅰ：1～3min；
　　（6）95%乙醇Ⅱ：1～3min；
　　（7）80%乙醇：1min；
　　（8）蒸馏水：1min；
　　（9）苏木精液染色：5～10min；
　　（10）流水洗去苏木精液：1min；
　　（11）1%盐酸-乙醇：1～3s；
　　（12）稍水洗：1～2s；
　　（13）返蓝（用温水或1%氨水等）：5～10s；
　　（14）流水冲洗：1～2min；
　　（15）蒸馏水洗：1～2min；
　　（16）0.5%伊红液染色：1～3min；
　　（17）蒸馏水稍洗：1～2s；
　　（18）80%乙醇：1～2s；
　　（19）95%乙醇Ⅰ：2～3min；
　　（20）95%乙醇Ⅱ：2～3min；
　　（21）无水乙醇Ⅰ：3～5min；
　　（22）无水乙醇Ⅱ：3～5min；
　　（23）石炭酸-二甲苯：3～5min；
　　（24）二甲苯Ⅰ：3～5min；
　　（25）二甲苯Ⅱ：3～5min；
　　（26）二甲苯Ⅲ：3～5min；
　　（27）中性树胶封固。
　　注：上述（12）和（13）项可省去，但（14）的冲水时间须延长至10～15min（细胞核显示更清晰）；（23）项可用无水乙醇代替，北方地区可省略。
　　说明：石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。
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[责任编辑：巫哲]
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