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免疫组化指标在乳腺癌诊治中的应用
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你可能喜欢关于乳腺癌Ki-67标记的问题(乳腺癌,免疫组化) - 免疫实验 - 生物秀
标题: 关于乳腺癌Ki-67标记的问题(乳腺癌,免疫组化)
摘要: [关于乳腺癌Ki-67标记的问题(乳腺癌,免疫组化)] 我刚刚开始尝试做免疫组化实验，想请教各位老师：谁作过Ki-67的免疫组化，具体的步骤有那些。 关键词:[乳腺癌 免疫组化]……
我刚刚开始尝试做免疫组化实验，想请教各位老师：谁作过Ki-67的免疫组化，具体的步骤有那些。
免疫组化操作规程一）、设备 1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； 2）水浴锅 （二）、
1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。 2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7）封裱剂： a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；
b、油和TBS(或PBS)配制。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。 （三）、操作流程
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； 2）无水乙醇中浸泡5分钟； 3）95%乙醇中浸泡5分钟；
4）70%乙醇中浸泡5分钟；
2、抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复 （1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 （2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用抗原有：Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，等。2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。 3、免疫组织化学染色
SP法 1）脱蜡、水化； 2）PBS洗2～3次各5分钟； 3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟； 4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）抗原修复； 6）PBS洗2～3次各5分钟； 7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。 8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。 9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。 10）PBS洗3次各5分钟； 11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时； 12）II抗中可加入0.05%的tween-20。 13）PBS洗3次各5分钟； 14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度； 15）PBS或自来水冲洗10分钟； 16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化； 17）自来水冲洗10～15分钟； 18）脱水、透明、封片、镜检。
SABC法 1)脱蜡、水化。 2)PBS洗两次各5分钟。 3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。 4)抗原修复。 5)PBS洗5分钟。 6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。 8)PBS洗三次每次2分钟。 9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。 10)PBC洗3次每次2分钟。 11)滴加SABC，20℃～37℃20分钟。 12)PBS洗4次每次5分钟。 13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。 14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15)脱水、透明、封片、镜检。回复
以免疫组化法对瘤细胞增生抗原进行定位定量最为简便、可靠，主要是通过Ki-67和PCNA（proliferationg cell nuclear antigen）的单克隆抗体来实现的。这些肿瘤增生抗原已证明与许多肿瘤的预后有关，即Ki-67或PCNA阳性细胞多者，其恶性度增高，预后不良，其中以恶性淋巴瘤、乳腺癌较为明显。而且在乳腺癌的研究中发现Ki-67阳性者，淋巴结转移率高，并与激素受体的表达呈负相关。回复Ki-67、PCNA是目前较为肯定的核增殖标志基因。Ki-67表达蛋白为MIB-1，在除G0期以外的细胞周期各时相均有表达，M期达最大表达峰。早期的Ki-67抗体只适用于冰冻标本，DOKA公司推出的新一代抗体可用于石蜡切片，为回顾性研究创造了条件。 试剂与方法　　一抗鼠抗人Ki-67(MIB-1)抗体，鼠抗人nm23抗体，鼠抗人PCNA抗体，DAB显色剂，SABC免疫组化试剂盒购自博士德公司。采用链霉亲合素-素化过氧化酶复合物(SABC)法。免疫组化步骤按试剂盒说明进行，均用微波炉法抗原修复。PBS代替一抗作空白对照。细胞着色棕黄色为阳性。每张切片随机计数 4个视野，每个视野计数200个细胞，共800个细胞，计算阳性细胞所占比率。标准：阳性细胞30%为强阳性.回复石蜡切片免疫组化染色— SABC 法 [ 试剂及配制 ] 1 ） 0.01mol 磷酸盐缓冲液（ PBS ）： NaH 2 PO 4 3g , Na 2 HPO 4 29g , NaCl 85g 加水至 1000ml 调 PH 值为 7.4 ； 2 ） 3 ， 3- 二氨基联苯胺（ DAB ）显色液： DAB50mg ， 0.05mol/L TB100ml ， 30%H 2 O 2 30-40 μ l ； 3 ） ABC 复合物：抗素 10 μ g/ml 加 2.5 μ g/ml 生物素，应用 0.05mol/L 的 Tris-HCL(PH7.6) ，应用前 30min 配制。 [ 实验步骤 ] 1 ）蜡切片 4 ℃ 下常规二甲苯脱蜡，系列酒精脱水； 2 ）用 0.5% 过氧化氢甲醇液封闭内源性酶 30min ； 3 ） 3.0mol/L 尿素消化 30min ； 4 ） 3%H 2 O 2 封闭 30min ； 5 ）微波（ 1000W ）修复 10min ，切片浸于抗原修复液中，沸腾后由高档调至低档； 6 ） 2% 正常羊血清封闭 30min ； 7 ）滴加 Ki-67 单克隆抗体（ 1:40 ）， 4 ℃ 冰箱过夜。 37 ℃ 孵育 60min ； 8 ）滴加羊抗鼠 IgG （ 1:100 ） 30min ， 37 ℃ ； 9 ）滴加 SABC 复合物（ 1:100 ）于 37 ℃ 孵育 60min ； 2 ） — 8 ）步均以 PBS 振洗 5min ，更换 3 次； 10 ）用 DAB 显色液显色，经复染后封片观察。 ? TUNEL 标记技术 [4] ? 为了去除石蜡，将切片置于含有新鲜二甲苯的染色缸中，室温下放置 5min ； ? 将切片移至另一含有新鲜二甲笨的染色缸中，室温下放置 5min ； ? 将切片浸于无水乙醇中，室温下放置 5min ； ? 将切片依次放入 100% 、 95% 、 85% 、 70% 、 50% 的乙醇中再水合； ? 将切片置于 0.85%NaCl 的染色缸中，室温下放置 5min ； ? 用 PBS 洗涤 5min ； ? 将切片浸于 4% 甲醛 /PBS 中，室温固定 15min ； ? 用 PBS 洗涤两次，每次 5min ； ? 晒干，划蜡； ? 每张切片加入 100 μ l 蛋白激酶 K ， 室温下放置 5min ； ? 用 PBS 洗涤 5min ； ? 将切片浸于 4% 甲醛 /PBS 中，室温固定 5min ； ? 用 PBS 洗涤 5min ； ? 取出切片用 PBS 洗涤两次，每次 5min 后，加 100 μ l 平衡缓冲液，加盖玻片，常温放置 10min ； ? 加入亲和素标记的异硫氨酸荧光素， 37 ℃ 避光保存 60min ； ? 2 × SSC 常温放置 15min ； ? PBS 洗涤三次，每次 5min ，发生凋亡的细胞 DNA 出现断裂，可被 dUTP 标记：在下呈荧光阳性。 ? 对凋亡细胞、 Ki-67 核阳性细胞进行定量计数：分别在至少 5 个有代表性的 100X 高倍视野下计数 500 个细胞中的凋亡细胞、 Ki-67 核阳性细胞，以平均每 100 个细胞中的凋亡细胞、 Ki-67 核阳性细胞为参数进行统计分析。
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