香樟木材提取物的成分及其防腐机理的研究--《福建农林大学》2014年博士论文
香樟木材提取物的成分及其防腐机理的研究
【摘要】：香樟木材具有很强的耐腐性能,究其原因主要是由于其内部含有的各种抑菌活性成分,但迄今为止香樟材提取物对木材腐朽菌(彩绒革盖菌和密粘褶菌)的抑制作用机制还不为人知。因此,本论文将各种溶剂提取香樟木质部得到的提取物作用于木材腐朽菌并测试其抑菌及耐腐性能,再采用XRD, FTIR, TG等进行表征,系统分析了香樟木质部提取物抑制木材腐朽菌生长的生理生化机制、分子生物学以及香樟材挥发性成分的释放规律,以揭示香樟材次生代谢产物与木材腐朽菌之间的关系,为香樟木质部提取物及人工合成同类物质在木材防腐方面的应用提供了理论依据。论文研究的主要结论及创新点如下：
1.采用响应面法优化超声波-微波协同提取香樟木质部提取物,得到最佳工艺参数为：液料比60mL/g,提取时间30min,粒径大小40～50目,在此条件下的得率为4.65%。采用生长速率法分析了香樟木质部的5种溶剂提取物对木材腐朽菌的毒力,结果表明：香樟木质部三氯甲烷提取物、甲醇提取物分别对彩绒革盖菌和密粘褶菌的抑制效果最强,在8g/L浓度下的抑菌率分别为57.5%和64.87%,EC50值分别为7.8g/L和0.3g/L。对香樟木质部甲醇提取物的GC/MS分析共鉴定出27种成分,主要包括：芳樟醇(2.9%)、樟脑(14.29%)、a-松油醇(9.88%)、反式-氧化芳樟醇(7.66%)等。在香樟木质部三氯甲烷提取物中共鉴定出20种化学成分,其中含量较高有：芳樟醇(5.9%),樟脑(17.6%),a-松油醇(11.8%),肉豆蔻醛(5.6%),(-)-g-杜松烯(7.4%)等。
2.通过木材防腐剂对腐朽菌毒性实验室试验方法进行耐白腐试验,结果表明：香樟木质部5种溶剂提取物在浓度为10%(w/v)时均达到Ⅰ级强耐腐水平,在浓度为1%时的耐腐效果都达到Ⅱ级。显微镜观察香樟木质部提取物处理白腐菌菌丝,发现其细胞形态皱缩扭曲变形,菌体表面出现破裂。SEM观察发现,三氯甲烷提取物处理试样白腐后在结构方面保持较完整,具有较好的耐白腐效果。XRD对比各试样结晶度大小顺序为：毛白杨素样乙酸乙酯提取物ACQ三氯甲烷提取物丙酮提取物甲醇提取物蒸馏水提取物樟脑。FTIR结果分析表明：与纤维素和半纤维素相关的谱峰其相对强度变化不明显或略有降低,而表征木质素的一系列特征峰峰高出现不同程度降低。通过耐褐腐试验发现,4%ACQ、4%硼酸、4%樟脑以及10%蒸馏水提取物、10%甲醇提取物、10%乙酸乙酯提取物、10%丙酮提取物处理材的失重率分别为1.78%,5.7%,13.08%,40.85%,9.39%,18.66%和21.45%。香樟木质部甲醇提取物处理褐腐菌菌丝会导致细胞壁变粗糙,细胞扩张变形,说明甲醇提取物影响了菌丝的结构和功能。甲醇提取物处理材其结构相对其他提取物处理材在褐腐后更完整,显示了其较好的防腐效果。XRD对比发现,4种香樟木质部提取物的防腐效果与相对结晶度大小呈正相关。FTIR研究发现表征纤维素和半纤维素的特征峰值越低,则被降解的量也越大,相对应的防腐剂防腐效果越差。热重分析表明,最大失重量越大则对应试样所用的香樟提取物防腐效果越好。各试样的一级热解反应活化能大小比较反映出防腐剂防腐效果越好,则纤维素含量保留得越多,活化能也越高。
3.检测分析了香樟木质部提取物对腐朽菌的生理生化机制,结果表明：香樟木质部甲醇与三氯甲烷提取物均对密粘褶菌和彩绒革盖菌菌丝的氧呼吸作用有抑制效果。乙酸乙酯提取物处理浓度越高,对褐腐菌分泌的纤维素酶的抑制越强。乙酸乙酯提取物会使密粘褶菌的菌丝电导率提高,且浓度越高其电导率越大。乙酸乙酯提取物浓度越高,其处理后的褐腐菌蛋白渗透量就越大。
4.采用双向电泳技术和质谱技术分别对香樟木质部甲醇及丙酮提取物处理白腐菌,甲醇以及乙酸乙酯提取物处理褐腐菌的抑菌机制进行蛋白质组学分析。结果表明：①对香樟木质部甲醇提取物处理白腐菌鉴定出的差异蛋白进行细胞定位,生物学过程以及功能分析发现：9个在细胞质,6个在细胞内,5个在线粒体等；22%为生物合成,15%为小分子代谢,10%为细胞的氨基酸代谢等；25%与离子结合有关,15%与氧化还原酶活性有关,15%与ATP酶活性以及跨膜运输活性有关。②对香樟木质部丙酮提取物处理白腐菌的差异蛋白的细胞定位,生物学过程以及功能分析发现：11个在细胞器,8个在细胞质,8个在蛋白质络合物等；18%参与了小分子代谢过程,14%参与了细胞氮化合物代谢过程,13%参与了生物合成的过程等；30%与离子结合有关,14%与翻译因子活性,核酸结合有关,12%与ATP酶活性有关。③由香樟木质部甲醇提取物处理褐腐菌差异表达蛋白的功能分析可知：酸性核糖体蛋白出现下调表达,说明褐腐菌在蛋白质合成方面受到了抑制,生命稳定性遭到破坏；磷酸丙酮酸水合酶是经过甲醇提取物处理后的褐腐菌中出现的特异性蛋白。④对香樟木质部乙酸乙酯提取物处理褐腐菌差异蛋白进行了鉴定,eIF-5A酶、NAD-苹果酸酶、GMP合成酶、富含甘氨酸RNA结合蛋白等的上调或下调表明褐腐菌在能量代谢、核糖体合成等方面发生了变化。
5.采用固相微萃取结合气质联用(SPME-GC/MS)技术检测了香樟木质部挥发性成分,比较分析了两种色谱柱对分离效果的影响。结果表明：采用弱极性DB-5MS色谱柱共分离出51个组分,解析出43种挥发性成分,其峰面积占总峰面积的97.04%,分离效果和所得的峰形比采用DB-WAXetr色谱柱更好；分析鉴定出含量较高的成分包括：左旋-α-蒎烯(4.57%)、双环[3.1.0]-4-甲基-1-异丙基-2-己烯(4.16%)、D-柠檬烯(7.49%)、桉叶油醇(13.85%)、樟脑(38.71%)等。运用顶空气相色谱(HS-GC)测试分析了香樟木质部樟脑的挥发机制,推导出在40～70℃加热范围,0～1.4h检测时间内,顶空气相色谱检测到的樟脑含量y(μg)与温度T(℃)和时间t(h)的耦合关系为：Y=-75.369+2.3786T+(41.125-1.1972T)t。
【关键词】：
【学位授予单位】：福建农林大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2014【分类号】：S792.23【目录】：
摘要8-11Abstract11-15第一章 绪论15-40 1.1 论文研究的意义15-17 1.2 树木提取物用作木材防腐剂的研究进展17-21
1.2.1 树木提取物的抑菌机理17-18
1.2.2 树木提取物的生物活性及对生物体的影响18
1.2.3 树木提取物对木材保护作用的研究现状18-20
1.2.4 树木提取物与化学试剂复配增效研究现状20-21 1.3 植物提取物抑菌的分子生物学研究21-23
1.3.1 基因组学的研究21-22
1.3.2 蛋白质组学的研究22-23 1.4 植物精油的主要提取技术、应用及研究进展23-28 1.5 提取物抑菌方面的文献检索28-29 1.6 立题依据29 1.7 本项目的研究内容与技术路线29-31
1.7.1 主要的研究内容29-30
1.7.2 研究技术路线30-31 1.8 本章参考文献31-40第二章 香樟木质部提取物的提取、成分分析及其对木材腐朽菌的抑制40-62 2.1 材料与方法40-43
2.1.1 材料、试剂与仪器40-41
2.1.2 试验方法41-43 2.2 结果与分析43-58
2.2.1 超声波-微波协同提取香樟木质部提取物的响应面优化43-50
2.2.2 香樟木质部提取物对木材腐朽菌生物活性的影响50-52
2.2.3 香樟木质部提取物对木材腐朽菌菌丝的毒力效果52-53
2.2.4 香樟木质部提取物化学成分鉴定与分析53-58 2.3 小结58-59 2.4 本章参考文献59-62第三章 香樟木质部提取物在木材防腐中的应用效果分析62-99 3.1 材料与方法62-68
3.1.1 材料62-63
3.1.2 试验方法63-67
3.1.3 仪器观察与分析67-68 3.2 结果与分析68-93
3.2.1 香樟木质部提取物处理试样耐彩绒革盖菌性能68-73
3.2.2 几种防腐剂处理毛白杨白腐后的XRD和FTIR分析73-77
3.2.3 香樟木质部提取物处理试样耐密粘褶菌性能77-82
3.2.4 基于XRD和FTIR的香樟木质部提取物处理试样褐腐的光谱学分析82-85
3.2.5 不同防腐剂处理马尾松试样防腐效果的热分析85-93 3.3 小结93-94 3.4 本章参考文献94-99第四章 香樟木质部提取物对木材腐朽菌的生理生化机制99-109 4.1 试验材料与仪器99-100
4.1.1 香樟木质部提取物的制备99
4.1.2 供试菌种以及培养基99
4.1.3 供试药剂99-100
4.1.4 试验仪器100 4.2 试验方法100-103
4.2.1 木材腐朽菌菌丝氧呼吸的检测100-101
4.2.2 纤维素酶活的测定101-102
4.2.3 褐腐菌细胞内蛋白质渗出量的测定102-103
4.2.4 褐腐菌电解质渗透量的测定103 4.3 结果与讨论103-107
4.3.1 香樟木质部提取物对密粘褶菌和彩绒革盖菌菌丝有氧呼吸的影响103-105
4.3.2 香樟木质部乙酸乙酯提取物对褐腐菌纤维素酶活的作用105-106
4.3.3 香樟木质部乙酸乙酯提取物对褐腐菌细胞内电解质的渗透变化情况106
4.3.4 香樟木质部乙酸乙酯提取物对褐腐菌胞内蛋白渗出量的影响106-107 4.4 小结107 4.5 本章参考文献107-109第五章 香樟木质部提取物对木材腐朽菌抑制的分子机制109-146 5.1 材料与方法109-115
5.1.1 试验材料110-112
5.1.2 试验方法112-115 5.2 结果与分析115-142
5.2.1 彩绒革盖菌蛋白质SDS-PAGE电泳分析115-131
5.2.2 密粘褶菌蛋白质SDS-PAGE电泳分析131-142 5.3 小结142-143 5.4 本章参考文献143-146第六章 香樟木质部挥发性成分的SPME-GC/MS以及HS-GC分析146-166 6.1 材料与方法146-148
6.1.1 试验材料146
6.1.2 主要仪器与装置146-147
6.1.3 试验方法147-148 6.2 结果与分析148-161
6.2.1 香樟木材主要解剖特征148-150
6.2.2 香樟木质部挥发性成分的SPME-GC/MS分析150-156
6.2.3 香樟木质部中樟脑的HS-GC分析156-161 6.3 小结161-162 6.4 本章参考文献162-166第七章 总结及展望166-171 7.1 论文的主要结论166-169 7.2 创新点169 7.3 对未来研究工作的展望与设想169-171附录171-176攻读博士研究生期间发表的相关论文176-177致谢177
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砍伐两棵野生樟树换来徒刑一年
　　本报讯（通讯员张茹颖）樟树是常见树种，但可能很多人不知道，野生樟树是国家二级保护植物，未经审批不得私自采伐。近日，仙居法院就审理了一起非法采伐野生樟树出售的案件，判处被告人项某有期徒刑一年，并处罚金人民币1.2万元。　　今年50岁的项某是仙居县朱溪镇人，2013年7月开始做伐木生意。同年10月份左右，路桥木材市场的一位老板找到项某，说需要几株樟树做木雕。　　项某打听到，邻村周某的责任山中有两株野生樟树。2013年12月初，他在没有与周某商谈好且未办理审批采伐手续的情况下，采伐了这两株樟树，并以0.45元每斤的价格出卖，非法获利2000元左右。&　　半个月后，一村民到山中挖笋，发现村集体所有的两株樟树被人砍了，向林业部门举报。被砍伐的两株樟树，其中一株的树桩已经被挖，无法鉴定，另一株经鉴定为国家二级保护植物“香樟”，立木材积为0.84立方米。　　2014年7月，项某向公安机关投案自首。项某还交代，2014年年初至7月份，他向朱溪镇6户人家购买树木，并在未办理审批采伐手续的情况下砍伐树木非法获利的犯罪事实。后经鉴定，其滥伐林木立木材积共计24.06立方米。　　项某说，他知道砍伐樟树是违法的，有同行告诉过他，野生樟树是受保护植物，采伐许可证不能审批。“我当时抱着侥幸心理，以为比较偏僻，不会被人注意到。”　　法院审理认为，被告人项某违反国家规定，非法采伐国家重点保护的植物香樟；违反森林法的规定，滥伐林木，数量较大，其行为构成非法采伐国家重点保护植物罪、滥伐林木罪。鉴于项某的犯罪情节和悔罪表现，遂依法作出了上述判决。}