罗氏沼虾螺原体病原微生物的分离和生物学特性研究--《南京师范大学》2012年硕士论文
罗氏沼虾螺原体病原微生物的分离和生物学特性研究
【摘要】：罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是我国重要的水产经济虾类。但随着养殖规模的不断扩大、水域环境日趋恶化,其病害愈来愈严重,特别是细菌性疾病,发病率高,危害较大。2010年8月,江苏省高邮市罗氏沼虾某养殖池塘出现突发性病害,病虾体弱无力,游离岸边,出水不久即死亡,造成重大损失。经本实验室初步分析和研究,确定该致病原是螺原体(菌株MR-1008),暂定命名为罗氏沼虾螺原体。
螺原体是上个世纪70年代发现的一种微生物,广泛寄生于昆虫和植物体内,有些具有严重的致病性,目前正式命名的螺原体有38种。螺原体的特征主要有五点：滤过性、螺旋性、运动性、无细胞壁及可在人工培养基中生长。为进一步证明高邮市患病罗氏沼虾致病原为螺原体,我们运用目前国际公认的微生物种类谱系分析金标准—16S rRNA基因分析方法对其进行了鉴定,发现其与非凡螺原体(Spiroplasma mirun)的16S rRNA基因有98%以上的相似性,之后,我们又通过病理学、病原微生物学和科赫氏法则的验证,明确其为螺原体类病原微生物。这是继河蟹、克氏原螯虾和南美白对虾后又一次在水生甲壳动物中发现螺原体病原,也是首次在罗氏沼虾中发现的新型病原。因此我们有必要对其致病机理及生物学特性进行深入研究。
中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheir)是首个在水生甲壳动物体内发现的螺原体类病原微生物(GenBank登陆号：AY920929),它可以引起河蟹“颤抖病”,15天内死亡率高达100%,而用罗氏沼虾螺原体回感河蟹也可导致其发病并出现颤抖症状,且死亡率也高达100%,但周期较长。同时,用中华绒螯蟹螺原体回感罗氏沼虾发现,30天内死亡率仅为54.2%,而用罗氏沼虾螺原体回感罗氏沼虾,30天内死亡率达83.3%。这些结果表明,从不同宿主分离得到的螺原体有不同的感染强度或者宿主对螺原体感染有不同的反应,两种螺原体的致病性存在一定差异,对螺原体而言,中华绒螯蟹比罗氏沼虾更敏感。此外,用罗氏沼虾螺原体多抗和中华绒螯蟹螺原体单抗7C8进行ELISA检测及Western blotting分析,结果未能明显区别两种螺原体。
通过对罗氏沼虾螺原体生长特性的研究发现,罗氏沼虾螺原体生长的最适温度为30℃,在最适温度下达到对数期的时间为24小时,最适pH值为7.2～7.6,最适盐度为0‰～1‰。药敏实验结果表明,氧氟沙星、克林霉素、克拉霉素、呋喃妥因、米诺环素、诺氟沙星、左氟沙星、四环素、麦迪霉素对罗氏沼虾螺原体有高度抑制作用。
以上研究综合说明：高邮市患病罗氏沼虾致病原为螺原体类微生物,但不同寄主来源的水生螺原体菌株对于不同的宿主具有不同侵染能力和毒力,推测可能是水生螺原体在不同寄主之间存在变异和寄主选择压力造成的。
【关键词】：
【学位授予单位】：南京师范大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：S945.1【目录】：
摘要3-5Abstract5-9第一章 文献综述9-23 1 罗氏沼虾的养殖现状及常见病害9-15
1.1 罗氏沼虾的养殖现状9
1.2 罗氏沼虾常见病害9-15 2 螺原体的研究进展15-19
2.1 螺原体的分类地位15-16
2.2 螺原体的基本生物学特性16-19 3 中华绒螯蟹螺原体的研究进展19-23第二章 罗氏沼虾螺原体病的发现及研究23-33 1 材料和方法23-28
1.1 实验用试剂的配制23-24
1.2 样本采集24
1.3 电镜观察(TEM)24-25
1.4 螺原体分离与纯培养25-26
1.5 PCR检测螺原体26
1.6 回感实验26-27
1.7 16S rRNA基因鉴定和种系发生分析27-28 2 结果28-31
2.1 患病罗氏沼虾的超微结构观察28
2.2 病原的分离和纯培养28
2.3 PCR检测结果28-29
2.4 回感实验29-30
2.5 16S rRNA基因测序和种系发生分析30-31 3 讨论31-33第三章 两种螺原体区别的初步研究33-45 1 材料与方法33-37
1.1 两种螺原体的交叉回感实验33-34
1.2 ELISA检测两种螺原体的差异34-36
1.3 Western blotting分析36-37 2 结果37-43
2.1 两种螺原体的交叉回感实验37-41
2.2 ELISA检测两种螺原体的差异41-42
2.3 Western Blotting分析42-43 3 讨论43-45第四章 罗氏沼虾螺原体的生长特性研究及药敏试验45-54 1 材料与方法45-47
1.1 罗氏沼虾螺原体的生长特性的研究45-46
1.1.1 罗氏沼虾螺原体的记数45-46
1.1.2 罗氏沼虾螺原体的生长特性研究46
1.1.2.1 罗氏沼虾螺原体生长的最适温度46
1.1.2.2 罗氏沼虾螺原体的生长曲线46
1.1.2.3 罗氏沼虾螺原体生长的最适pH46
1.1.2.4 罗氏沼虾螺原体生长的最适盐度46
1.2 药敏实验46-47
1.2.1 待试抗生素46-47
1.2.2 R2固体培养基法47
1.2.3 R2液体培养基法.47 2 结果47-52
2.1 血球记数板计数法与CCU记数法比较47-48
2.2 罗氏沼虾螺原体生长的最适温度48
2.3 罗氏沼虾螺原体生长曲线48-49
2.4 罗氏沼虾螺原体生长的最适pH49-50
2.5 罗氏沼虾螺原体生长的最适盐度50
2.6 药敏实验50-52 3 讨论52-54全文小结54-55参考文献55-66附录：读研期间科研成果66-67致谢67-68
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国际检验医学杂志2014年2月第35卷第3期 IntJLabMed，February2014，Vo1．35，No．3
? 检验仪器与试剂评价 ?
罗氏E-601电化学发光检测仪多个项 目残留试剂的再利用
黄 桢 ，王修银 ，欧阳维富 ，赖沛炼 ，周伟青
1_广州市中医医院检验科 ，广东广州 ．广 东省人 民医院检验科 ，广东广州 510080
摘 要：目的 降低罗氏E一601化学发光配套试剂的成本，探讨 17种残留回收试剂再利用的处理。方法 用随机 2O份患者
血清做研究对象，用混合 3瓶残留试剂为 1瓶和原装试剂分别检测 17个项 目，对检测结果进行比较分析，差异有统计学意义的项
目定标后再检测 比较，同时对检测均值进行分析 。结果
通过检测发现 甲胎蛋 白 AFP 、癌胚抗原
CEA 、糖类抗 原 199
CA]99 、糖类抗原 125 CA125 、糖类抗原 153 cA153 、糖类抗原 724 CA724 、甲状旁腺素 PTH 、游离前列腺特异性抗原
FPSA 、总前列腺特异性抗原 TPSA 、脑利钠肽前体 proBNP 、肌红蛋 白 MYO 、高敏肌钙蛋 白T TNT―Hs 直接使用残留试
剂与原装试剂差异无统计学意义 P 0．05 ，而泌乳素 PRL 、雌二醇 E2 、游离三碘 甲状腺原氨酸 FT3 、游离甲状腺素 FT4 、
促 甲状腺激素 TSH 比较差异有统计学意义 P O．05 ，但经过定标后无差剐，检测结果可接受。结论 保存好残留试剂，项 目
只有 PRIE2、FT3、FT4、TSH再利用需要定标，其他项 目不用定标可与原装试剂一样使用，可保证结果准确 。
关键词：化学发光； 残留试剂； 定标
DoI：10．3969／j．issn．．5 文献标识码 ：A
文章编号 ：14 03―0336―02
Therecyclingofresidualreagentformultipletestsof
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> 使用罗氏Cedex Bio生物过程分析仪对生物技术生产过程进行监控
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使用罗氏Cedex Bio生物过程分析仪对生物技术生产过程进行监控
发布时间： 13:47 点击 838
使用罗氏Cedex Bio生物过程分析仪对生物技术生产过程进行监控
D. Druhmann、S.Reinhard、F. Schwarz、C. Schaaf、K. Greisl、TL N?tzel
在开发和控制工业化生产重组蛋白的生物过程中，一项基本要素是要提供快速、准确且可靠的过程数据。对动物和细菌细胞培养物中的基质（营养物质）和代谢物进行准确的监控，是避免在发酵过程中营养不足，或有毒代谢终产物积聚的关键。不受控制的代谢物可对细胞生长及存活以及蛋白的质量和产量产生不良影响。因此，精确跟踪发酵过程能确保可重现性，且是优化过程开发和验证的关键。
测试的典型参数包括葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、氨、钠和钾。目前，检测基质和代谢物的多参数分析仪系统采用酶膜的生物传感器和离子选择性电极。这些仪器的主要缺点是酶膜随着时间的推移准确度会下降，材料成本高昂，检测结果呈非线性，而且总体灵敏度和准确度较低。
罗氏Cedex Bio生物过程分析仪检测
Cedex Bio生物过程分析仪，和最近推出的Cedex Bio HT生物过程分析仪可应用于提升在发酵过程中的过程监控。Cedex Bio HT生物过程分析仪专为过程开发的高通量检测而设计，每小时最高测试数达320。Cedex Bio HT生物过程分析仪结果与Cedex Bio生物过程分析仪得到的结果完全一致。这项技术采用了罗氏成熟的仪器平台，相比目前使用的其他仪器，在其扩展检测范围内，显著提高了其灵敏度和可重现性（见表）。
Table. Comparison of measurement ranges
Cedex Bio生物过程分析仪配备了自动稀释功能，从而扩展了检测范围，显著降低了操作员人为造成的偏差。在Cedex Bio生物过程分析仪上，样本在上机之前无需人工稀释。各项光度测定（如LDH [乳酸脱氢酶]、IgG [免疫球蛋白]）和离子选择性电极（钠，钾）结合于同一台仪器，可对单个样本进行灵活的检测组合。
Figure 1. Accuracy and linearity comparisons for glucose, accuracy and linearity comparisons for lactate, and accuracy and linearity comparisons for glutamine
Cedex Bio生物过程分析仪卓越的数据质量
利用相同的参考标准（参见图1中的血糖、乳酸和谷氨酰胺），将Cedex Bio生物过程分析仪与采用酶膜技术的成熟仪器进行了对比。日间平行对照实验结果表明，Cedex Bio生物过程分析仪具备更佳的准确性和线性。
此外，Cedex Bio生物过程分析仪的高灵敏度使得营养有限的发酵过程成为可能。而且，可检测到发酵过程中代谢物的细微变化。
根据该领域内的相关性研究得到的结果
酶膜分析仪需要进行繁琐的维护、校准和频繁的质控。对于批量饲养哺乳动物细胞的发酵过程而言，Cedex Bio生物过程分析仪相关性研究的数据质量更高（参见图2中的血糖和乳酸），而且表明了Cedex Bio生物过程分析仪能方便地取代酶膜分析仪而不会产生任何负面影响。
Cedex Bio生物过程分析仪能够分析样本的产品质量参数，如LDH（代表释放量[即胞浆蛋白酶]）和IgG（滴度），这是一个不可忽视的优势。
Figure 2A. Results of correlative studies—Glucose
Cedex Bio生物过程分析仪在同一个平台上集成了三台设备的功能，可在数分钟内对同一个样本进行多参数测试。自动化稀释功能可减少需依靠操作人员的步骤和减少偏差。方便易用且稳定的光度计测定、离子选择测定和浊度测定既可靠又具备可重现性，且不同地点的多台仪器之间可做直接比较。由此得到的灵敏、精密且准确的分析数据能确保对发酵过程进行高水准的控制。
Figure 2B. Results of correlative studies—Lactate
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