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硕士学位论文
论文题目： 蓊卷虫董酮娄他金翅的纯他，坌高，鉴定
盈甚拭氢化活性殛究
作者姓名； 奎盘虚
学科专业； 盒亟盘堂
提交日期：2009年01月
浙#l：工商大学硕士学位论文
菊米中黄酮类化合物的纯化、分离、鉴定
及其抗氧化活性研究
菊米多为菊科植物甘野菊的花蕾制作而成，在我国作为一种饮品
使用有着悠久的历史，具有清热解毒、清火明目、平肝降压、预防感
冒等作用，长期饮用，能生津养颜、延年益寿，对视力衰退及高血压
患者有明显疗效。
黄酮类化合物是野菊花的主要有效成分之一(菊米初提物总黄酮
含量可达13％)。目前，菊米中总黄酮还未得到充分开发，本文以菊
米为原料，以黄酮吸附率、解吸率为评价指标，用大孔吸附树脂对菊
米总黄秀阿进行纯化，分别采用静态、动态等试验考察大孔树脂对菊米
总黄酮的分离纯化效果及影响因素。结果显示，200702树脂分离效
果较好，在最佳吸附工艺条件下二次纯化后黄酮质量分数超过85％。
有关菊米化学成分的研究报道较少，为进一步揭示菊米的化学成
分，开发其活性成分，本实验对菊米的化学成分及其生物活性进行了
研究。首先采用液质联用技术分析菊米乙酸乙酯相中的黄酮类化合
物，分析其可能的化学结构，并为进一步分离单体采用何种分离溶剂
提供依据。其次，运用溶剂萃取、硅胶柱色谱法等色谱技术从菊米的
乙酸乙酯萃取物中分离得到3个黄酮类化合物，运用紫外光谱、质谱
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和核磁共振等波谱学检测技术，鉴定出它们的化学结构，其化学结构
分别为(I)山奈酚、(II)香叶木素、(III)橙皮苷，以上化合物
均为首次从该植物中分离得到。
采用DPPH·法评价了初提物总黄酮、纯化后总黄酮及化合物I—
III的抗氧化活性。结果表明：纯化后的总黄酮有一定的抗氧化能力，
在相同的高浓度条件下，纯化后总黄酮抗氧化能力大于Vc。除化合
物III夕b，其他两种化合物对DPPH·自由基均具有很强的抗氧化活性，
在相同的低浓度条件下，这两种化合物抗氧化能力就大于Vc。抗氧
化能力的大小顺序是：化合物II>化合物I>Vc>化合物III。
关键词：菊米；总黄酮；纯化；化学成分；抗氧化
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STUDIESONTHEPURIFICATl0N、ISOLATION、
IDENTIFICATIONANDNTIOXIDANTACTIVITY0F
FLAVONOIDSFROMJUMI
Jumi，almostmadefromthebudofChrsanthememindieum，has
beenusedasakindofdrinksforalongtimeinourcountry．Jumihas
antibacterial，anti—inflammatoryactivitiesandplaysp otectiverol sin
liverdiseases，anditisespeciallyefficienttreatmentofhypertensionand
visionfeebleness．
Flavonoidisonekindofcomponentswithawiderangeof
bioactivitiesinCompositae(ThecontentofflavonoidsinJumiisl3％)．
Fornow,thereasn’tbeenfulldevelopmentinJumi．Inthistudy,by
usingJumiasthematerialsandwithadsorptionrates，desorptionratesa
indexes，thestaticandynamicadsorptiontestsweremployedto
investigateeffectsandaffectivefactorsfpurificationofflavonoidsin
Jumiw thmacroporousresin．Theobtainedflavonoidsproducthasotal
flavonoidspurityrateofmorethan85％byusingresin200702fortwice
purification．
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Therehavelesstudyandreportaboutthechemicalconstituents
fromJumi．Inordertoinvestigatethech micalconstituentsandtheactive
componentsofJumideeply，inth study,thechemicalconstituentsand
thebiologicalactivityofJumiwereinvestigated．Threepurecompounds
wereisolatedbysolventx ractionandchromatographymethodsfrom
ethylacetateextracts．Thetructuresofthreecompoundswereelucidated
onthebasisofspectralevidencesuchasuv,ESI．MS，1H—NMR，
13C-NMR．TheyareKaempferol(I)、Diosmetin(II)、Hesperidin
(III)．Thosecompoundswereisolatedfromthisplantforthefirsttime．
Theantioxidantactivityofrawflavonoids、purifiedflavonoi s、
compoundsI—111wasinvestigatedbyDPPH·method．Theresults
showedthatthepurifiedflavonoidshavesomeantioxidativeeff ciencyin
thesamehighconcentrationevenm rethanVc；exceptcompoundIII，
theseothertwocompoundshavetrongerscavengingactivityto
DPPH·freeradicalsthanVcjustinthesamelowconcentration．The
antioxidativeeff ciencyoftheisolatedcompoundswasintheorderof
Diosmetin(II)>Kaempferol(I)>Vc>Hesperidin(III)．
KEYWORDS：jumi；flavonoids；purification；chemicalconstituen s；
antioxidantactivity
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独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工
作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地
方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含
本人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的
材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作
了明确的说明并表示谢意。
签名： 隰冲厂月旭
关于论文使用授权的说明
本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文
的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的
复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部
分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制
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容相一致。
保密的学位论文在解密后也遵守此规定。
醐：沙7年一M
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1．1菊米的研究概况
菊米以菊科植物野甘菊(Chrsanthememindium)含苞未放的花蕾为原料经杀
青烘干制成【l】，是遂昌县的传统饮品，仅产于浙江山区，具有清热解毒、清火明
目、平肝降压、益肾补肾、降脂、消暑、醒酒、预防感冒等作用121。长期饮用，
能生津养颜、延年益寿，对视力衰退及高血压患者有明显疗效【3】。
菊米富含水份、蛋白质、脂肪、膳食纤维、维生素、碳水化合物、氨基酸、
矿物元素等成分，黄酮类化合物是菊米中重要的药效成分。目前，为发挥资源优
势，菊米的种植和饮用己具有一定的规模，遂昌县从1996年开始对遂昌菊米进行
了栽培技术试验，并推广应用。全2002年，遂昌菊米种植面积达到867hm2，总
产253．5t，实现产值2028万元，产品远销省内外，出口我国香港地区、比利时和
口本等国。存遂昌建立了无公害农产品生产基地300hm2，绿色食品生产基地67
虽然如此，相对于国内外对野菊花化学成分的研究【5‘8】来讲，目前对对菊米
中黄酮类化合物的研究很少，仅有本实验室人员初步研究了总黄酮的提取、部分
成分的分离分析、鉴定与相应的活性研究‘9，10】。除此之外，国内外关于菊米的研
究主要集中在其栽培技术【ll,12]年[j降血压、降血脂、抑菌、抗心律失常和舒张血管
等作用的研究【13．161等作用。毛胜凤，张新风，余树全‘14I研究测定了野菊花4 6
?≮埯 l?觥、∞屺i(soflavanoncssoflavanoncs)6
黄烷．3．孵爽唧磊耳剃类t。hatc。nc。，炉
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黄酮类化合物具有以下物理【20l和化学性质：黄酮类化合物大多为结晶固体
【2¨，少数为无定形粉末。有取代基(-OH，．OCH3)或形成交叉共轭体系的多呈
黄色，共轭程度越高颜色就越深，羟基或甲氧基引入7或4’位时对颜色影响较
大，而引入其他位置则影响较小。通常，黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄色至黄
色；查耳酮为黄色至橙色；二氢黄酮、二氢黄酮醇类因C2和C3之间的双键被
氢化，交叉共轭体系中断，几乎没有颜色；异黄酮因苯环取代在3位，共轭程
度减少，仅显微黄色；花色素的颜色除了与共轭程度有关外，还与外界环境的pH
有关，pH8．5时
变成醌式结构显蓝色。
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黄酮类化合物的结构及存在状态使溶解度有显著差异。一般游离苷元难溶或
不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。其中黄
酮、黄酮醇、查耳酮是平面型分子，因分子堆砌较紧密，分子间引力较大，故更
难溶于水，而二氢黄酮及二氢黄酮醇等，因系非平面型，故排列不紧密，分子间
引力降低，有利于水分子进入，因而对水的溶解度稍大。多数苷类因以离子形式
存在，具有盐的通性，故亲水性较强，偏向于较大的水溶性。黄酮类分子中具有
的羟基可提高在水中的溶解度。由于它们多数都具有酚羟基，因此纯的苷或苷元
都较易溶于碱性有机溶剂、二甲基甲酞胺等。羟基经甲基化后，则增加在有机溶
剂中的溶解度。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶或不
溶于苯、氯仿等有机溶剂，糖链越长，则水中溶解度越大。
根据分子中的酚羟基和毗喃环的性质，黄酮类物质具有一些特征的显色反应：
如盐酸．镁粉、或钠汞齐等还原反应，结构中带有3．OH、5-OH或邻位羟基者，均
能与金属盐类试剂如铝盐、镁盐、铁盐等形成颜色较深的络合物。各种黄酮类物
质植物成分的颜色反应【22】见表1．2所示，母示有荧光。
表1．2各类黄酮类化合物的显色反应
Table1-2Thecolorreactionofdifferentflavonoids
1．2．2黄酮类化合物的分析方法
目前分析黄酮类化合物的方法主要有：分光光度法、紫外光谱法、高效液相
色谱法、核磁共振法和质谱法等。
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1．2．2．1利用分光光度法
黄酮类化合物的测定多采用硝酸铝比色法。其基本原理为黄酮类化合物与
Al州03)3进行络合显色，以芦丁为标准溶液，在UV510nnl处测定黄酮类化合物
的含量。但硝酸铝比色法专一性较差，测定受处理过程颜色变化的影响【231。罗
宪堂【24J等利用该法测定了山香圆叶中的黄酮类成分的含量。
为了提高硝酸铝比色法的准确度，人们对该法进行了多项改进。尉芹【251等
发现硝酸铝比色法在测定杜仲总黄酮时的主要干扰因素是绿原酸，他们采用纸层
析法将样品中的黄酮与绿原酸分离后，再用硝酸铝比色法测定黄酮含量，从而提
高了测定的准确度。彭科怀【261等利用黄酮类化合物的铝盐络合物本身具有的黄
色进行比色，检测花粉中总黄酮含量。王宗花【271等发现在阳离子表面活性剂
(CIMAB)存在下，M06+与黄酮类化合物形成胶束配合物体系，使测定的灵敏度有
了较大的提高，他们以芦丁为对照品，在410nm波长处测定黄酮类化合物的总含
1．2．2．2紫外光谱
紫外光谱又称紫外一可见光谱，是有机分子中各种电子吸收了紫外光辐射的
能量发生跃迁而产生的。由于紫外光谱与电子运动有关，所以又称为电子光谱。
虽然紫外光谱是由分子内电子吸收了紫外光而得到的，但是并非所有的紫外光都
能被电子吸收。根据量子理论，电子能级是不连续的，电子从某个低能级向某个
高能级跃迁所需要的能量，只对应于某个特定波长的紫外光的能量。因此，当用
紫外光照射有机分子时，若控制光源，按波长由短到长的顺序依次照射样品，则
只有能引起电子跃迁的那些波长的紫外光才能被吸收，其余波长的紫外光会顺利
地通过样品。将吸收强度随波长的变化记录下来，就得到紫外光谱。从化合物的
紫外光谱可以了解有机分子中的共轭体系及其取代情况。
黄酮类化合物，因分子中存在桂皮酰基(cinnamoyl)及苯甲酰基(benzoyl)组成
的交叉共轭体系，在甲醇中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成。出现在300"--"
400nm之间的吸收带称为带I，出现在240"---280nm之间的吸收带称为带II。不同
类型的黄酮化合物的带I或带II的峰位、峰形和吸收强度不同，因此从紫外光谱
可以推测黄酮类化合物的结构类型。
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1．2．2．3高效液相色谱法
高效液相色谱(HPLC)法具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高的特
点，适应于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析，是对黄
酮类化合物进行分离分析常用的方法。
高效液相色谱法可用来测定黄酮总含量。在HPLC法中，有不水解黄酮类化
合物，以芦丁为对照品，以芦丁和槲皮素来定性黄酮色谱峰例或辅以二极管阵
列检测器定性色谱峰来测定总黄酮的含型291；也有经水解，测定黄酮水解后的
主要苷元来测算总黄酮含量[30,311或综合考虑游离苷元与总苷元的含量来推算总
黄酮的含量1321等方法。
高效液相色谱法对黄酮类化合物进行分离分析时，通常用反相C18色谱柱‘331，
且优先选择甲醇／水及乙腈／水体系为流动相，但由于黄酮分子中存在酚羟基，在
水中会部分解离。未解离的羟基与固定相作用导致拖尾现象，但若在流动相中加
入少量的酸即可抑制解离，克服拖尾现象。有时，为了提高分离度常需要进行梯
度洗脱。侯镜德【341等以芦丁为标准物，使用高效液相色谱法测定了毛竹叶中的
总黄酮含量。Fer-asImadKanaze[351等采用反相HPLC法分离了橙皮苷、桔皮苷、
柚皮苷三种黄酮类化合物。
1．2．2．4核磁共振光谱法
将具有非零自旋量子数的核放入磁场后，用适宜频率的电磁波照射，处在不
同环境中的自旋核就会在不同磁场强度下发生共振，通过记录仪记录下这些信
号，就得到核磁共振谱图。核磁共振谱图得到的信息有三：一、信号的位置对应
化学环境与化学位移；二、信号的积分对应自旋核的数目；三、信号的分裂对应
相邻自旋核的自旋偶合作用。核磁共振现在已经成为黄酮类化合物结构分析的一
种重要方法。1H．NMR主要根据C环质子的信号确定黄酮类化合物的结构类型，A、
B环质子及取代质子的化学位移、偶合常数、峰面积等参数，解析取代基的种类、
位置、数目及成苷情况等。A环及B环质子的化学位移主要有如下规律：B环上质
子较A环上质子的共振峰位于较低场；2'-H及6’．H一般较B环上其他质子的化学
位移大；A环5．H的化学位移较其他A环质子大；酚羟基成苷后，将使邻位碳上氢
质子的共振信号向低场方向位移。
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1．2．2．5质谱法
在测定黄酮类化合物的配基和苷的结构方面，电子轰击质谱法是一种有效的
方法。特别是在可利用的化合物样品量很少(即低于1mg)的时候。多数黄酮类化
合物甙元因分子离子峰(衍)较强，往往成为基峰，故一般无须作成衍生物进行测
定，但是当采取气相．质谱(GC．MS)联用手段进行分析时，为了提高样品的挥发
度，则须作成甲醚衍生物等。黄酮类化合物的甙类如不作成衍生物，则其分子离
子峰一般难以看到。甚至其全甲基化及全乙酞化衍生物，也只能给出一个低强度
的分子离子峰。除了分子离子峰外，黄酮类化合物苷元也常常生成【M．1】+，(M．H)
主峰。如为甲基化衍生物，则可以得到[M．151+，(M．CH3)离子。黄酮类化合物的
化学结构有一定的规律性，许多中药中分离出的黄酮类化合物大多是己知化合物
或其衍生物。因此，根据紫外光谱、核磁共振谱和质谱以及它们的理化常数，一
般能顺利地进行鉴定和结构测定，如果有必要的话，还要通过化学降解或合成方
法来阐明结构。
1．2．3黄酮类化合物的纯化方法
有关黄酮类化合物分离、纯化的研究报道很多，如重结晶法、树脂法、超临
界流体萃取法、铅盐沉淀法等，以树脂法为多。
1．2．3．1重结晶法
重结晶法利用黄酮类化合物不溶于酸，易溶于热水、乙醇和丙酮的性质，将
黄酮类化合物粗提取液先进行酸析，再用乙醇或者丙酮溶解提取，浓缩或氨化成
盐析出，再用活性炭脱色，反复重结晶即可得到纯品．
1．2．3．2树脂法
吸附树脂是一类有机高分子聚合物吸附剂，具有物理化学稳定性高、吸附选
择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和，使用周期长、节
省等优点。该法是以大孔吸附树脂为吸附剂和分子筛的柱色谱分离形式．其原理
是吸附性和分子筛性。吸附性主要来源于范德华力和氢键作用力：分子筛性来源
于大孔树脂的多孔性结构产生的渗透和过滤作用．被分离的成分根据其分子的大
小彳、=同和吸附能力的差异而分离【36‘．
近年来大孔吸附树脂在中药成分(如黄酮、生物碱等)精制纯化等领域中应用
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越来越广泛【37-391。刘健伟【381等对D101型(非极性)、Hz．806型(中等极性)和AB．8
型(弱极性)3种大孔吸附树脂进行了筛选，并对甘草中总黄酮分离纯化工艺进行
了研究。王雅君【39】等则用D101大孔树脂进行了制备菟丝子总黄酮的研究。这些
研究表明，大孑L吸附树脂对于黄酮类化合物具有良好的分离纯化效果，与传统的
分离方法相比，具有操作简便、树脂再生容易、耗费有机溶剂少、提取率高等优
1．2．3．3超临界流体萃取法
该法(SupercriticalFlu dsExtraction，SFE)是20世纪80年代发展起来的一项
提取分离技术，利用超临界流体(SupercriticaFlu ds，SCE)为萃取剂，从液体或固
体中萃取出待测组分，其中超临界二氧化碳最为常用(SCF．C02)1401。SFE具有提
取效率高、无溶剂残留、天然植物中活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等
优点，同时还可以通过控制临界温度和压力的变化，达到选择性提取和分离化合
物的目的。超临界状态易于实现，安全无毒，且萃取分离一次完成，无溶剂残留；
是惰性气体，操作安全，价廉易得；萃取可以在室温附近的温和条件下进行，对
易挥发组分或生理活性物质破坏很小，适于天然活性成份的萃取；溶剂和溶质分
离方便，只需改变温度和压力就可以实现溶质和溶剂的分离，操作简便。Mishima
等‘411用SFE-SFC从黄芩根中萃取黄芩甙和黄芩甙元。姚伟席，刘志敏等㈦都分
别用此法从银杏叶中萃取出了黄酮化合物。因此，在当今人们渴望回归大自然的
潮流中，该提取方法倍受青睐，用超临界二氧化碳提取银杏叶黄酮类成分的方法，
己受到人们的关注，在欧洲已有专利报道【43舶】。
1．2．3．4铅盐沉淀法
在中药的乙醇或甲醇提取液中加入饱和的中性乙酸铅水溶液，可使具有邻二
酚羟基或羧基的黄酮类化合物沉淀析出；如果中药的乙醇或甲醇提取液中所含的
黄酮类化合物不具有上述结构，则加中性乙酸铅发生的沉淀为杂质，过滤除去，
再向滤液中加碱式乙酸铅，可使其它黄酮类化合物沉淀析出。滤取黄酮类化合物
的铅盐沉淀，悬浮于乙醉中，通入H2S进行复分解，滤除硫化铅沉淀，滤液中可
得黄酮类化合物。由于初生态的硫化铅沉淀具有较高的吸附性，故多不用H2S脱
铅，而用硫酸盐或磷酸盐，或用阳离子交换树脂脱铅。
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1．2．4黄酮类化合物的分离方法
要确定黄酮类化合物的结构，首先必须经过分离得到黄酮类化合物的单体。
分离黄酮类化合物的方法除了经典的溶剂萃取法，常用的方法还有硅胶柱层析、
聚酰胺柱层析、葡聚糖凝胶(SephadexLH．20)柱层析、高速逆流色谱等。
1．2．4．1硅胶柱层析
常规柱层析中，使用的硅胶是一种坚硬无定型立体网状结构的硅酸聚合物颗
粒，硅胶的分子式是Si02"H20，它的内部具有很多小孔，这种孔的存在使得硅胶
具有很大的表面积。在硅胶颗粒的内部，分子与分子之间的相互作用是对称的，
其力量相互抵消，而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到
固体内部分子的作用力大，表面层所受的作用力小，因此在硅胶固体的表面就存
在着这种剩余的力。在一定的条件下，硅胶与被分离物质之间产生作用，这种作
用主要是物理作用。物理作用来自于硅胶表面与溶质分子之间的氢键作用，范德
华力，如诱导力、色散力，其特点是吸附速度快，存相同情况下，吸附过程和脱
附过程是同时进行的，被吸附物质在一定条件下可以被解吸出来。不同的化合物
由于其分子结构不同，因此与硅胶表面作用力的大小也刁<同。同时，同一种冲洗
溶剂对不同化合物也因分子结构而异使得它们的溶解度也不同。当实施色谱操作
时，随着色谱柱冲洗溶剂的巧、=断冲洗，致使升i同的化合物组分在色谱柱中的流动
速度不一样，最后使得一个复杂的混合物由于通过色谱柱的速率彳i同而达到分
离。硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的柱色谱。同时硅胶又是一
种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子。此法应用范
围最广，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇及高度甲基化(或乙醚化)
的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合
物，如多羟基黄酮醇及其苷类等。从国内外学术期刊上所发表的文章不难发现，
在经典柱色谱中硅胶吸附柱色谱仍是目前应用最为广泛的柱色谱技术，在黄酮类
化合物的常规分离中，至少80％以上的色谱制备性分离工作都是在硅胶柱上进行
的f47．731。
1．2．4．2聚酰胺层析
聚酰胺是一类化学纤维，商品名：锦纶、尼龙。1955年首次发现，聚酰胺
色谱能分离酚类物质。聚酰胺分子中存在很多的酰胺基，其吸附机理主要来自于
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聚酰胺内的酰胺键，它们与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，因而对
这些物质产生吸附作用。因此，酚类形成的氢键是靠其羟基与锦纶分子中酰胺键
的羰基作用。一般在水中形成的氢键的能力最大，在有机溶剂中较弱，在碱性溶
剂中最弱。聚酰胺色谱的溶剂系统主要分为两类：一类是水溶剂系统，用极性的
流动相，作用相当于反相色谱，可以分离一些很难与聚酰胺形成氢键的物质，如
萜类、甾类、生物碱类等；另一类是非极性溶剂系统，其色谱行为相当于正相色
谱。各种化合物由于与聚酰胺形成氢键的能力不同，聚酰胺对它们的吸附力的大
小也不同。在含水溶剂系统中，一般认为有下列规律：
(1)吸附能力的大小与形成氢键的基团的多少有关，基团越多，则吸附力
(2)氢键的位置与吸附力有很大关系。对位酚羟基的吸附力最大，其次是
间位酚羟基，邻位酚羟基的吸附力最小。
(3)羟基直接相连的共轭双键越多，则吸附力越大，反之吸附力越小。
(4)分子内氢键的形成将减少化合物之间的吸附力。
聚酰胺色谱的应用比较广泛。它是分离黄酮及某些酚类物质最有效的方法之
一【741。聚酰胺柱色谱可用于分离各种类型的黄酮化合物，包括苷及苷元、查尔
酮与二氢黄酮等。由于大分子鞣质在聚酰胺上的吸附是不可逆的，因此其对鞣质
的吸附性非常强，可以利用聚酰胺将植物粗提物中的鞣质除去。
1．2．4．3大孔吸附树脂
大孔吸附树脂也叫大网格吸附剂，是20世纪60年代发展起来的一类有机高聚
物吸附剂，多为苯乙烯型或2．甲基丙烯酸酯型。同时兼有吸附性和筛选性，是
以吸附作用和筛选作用相结合的分离材料，其吸附作用是由于范德华引力或产生
氢键的结果，而筛选作用则是由树脂本身多孔性结构所决定。在树脂合成时可引
入酰胺基、酚羟基等极性基团，使树脂具有适当的极性，可用于极性化合物的吸
附。同时，由于与普通凝胶树脂的合成方法不同，大孔树脂的孔径与比表面积都
比较大。大孔树脂内部具有三维空间立体孔结构，显微形状为球形颗粒，一般位、
为白色球形颗粒状。颗粒内部有很多网孔穴而具有很大的比表面积，具有良好的
筛选吸附性能，比表面秘愈大，吸附能力愈强。
大孑L吸附树脂对天然产物化学成分如皂苷、生物碱、黄酮、香豆素及其他一
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些苷类成分都有一定的吸附作用，对色素的吸附作用较强，可有效的去除大部分
天然色素。
1．2．4．4葡聚糖凝胶柱色谱
交联葡聚糖凝胶常常是将葡聚糖与交联剂3．氯．1，2．环氧乙烷交联而得。其主
要商品名为Sephadex。在凝胶色谱分离中，溶质与凝胶之间并不产生作用，它是
根据凝胶内部孔径的大小，对溶质分子按照分子的大小尺寸进行分离。小的分子
能进入凝胶的小孔穴，中等大小的分子只能进入到凝胶中中等大小的孔中，而大
分子不能进入凝胶的孔内，因此小分子在柱内的路径长，最后流出，大分子在柱
内的路程短，最先流出。
对于黄酮类化合物的分离，主要用两种型号的凝胶：Sephadex．G型及
Sephadex．LH20型。Sephadex．G型葡聚糖凝胶适合在水中使用，Sephadex．G25
羟丙基化后就是Sephadex．LH20，与Sephadex．G比较，Sephadex．LH20分子中
．OH总数虽无改变，但碳原子所占比例却相对增加了，从而使葡聚糖的亲脂性增
大。这种凝胶既有亲水性，又有亲脂性，不仅可在水中应用，也可在极性有机溶
剂或它们与水组成的混合溶剂中使用。其既具有分子筛作用，在由极性与非极性
溶剂组成的溶剂中还有反相柱层析效果。黄酮类化合物的分离多用
Sephadex．LH20t75刁7】。葡聚糖凝胶分离黄酮类化合物的机制：分离游离黄酮时主
要靠吸附作用，吸附强弱取决于含多少羟基；但分离黄酮苷时，则分子筛的性质
起主导作用，洗脱时黄酮苷大体上是按分子量由大到小的顺序流出柱体【7引。
1．2．4．5高速逆流色谱
高速逆流色谱(high—speedcounter-currenthromatography，HSCCC)是利用溶
质在两种互不相溶的溶剂系统中分配系数的不同，从而进行分离的色谱法。
LijuanChen等1791采用HSCCC．MS联用，以正己烷．醋酸乙酯．甲醇．水为溶剂，从
木蝴蝶中分离得至IJT3个黄酮化合物，并鉴定纯度达到92％以上。Du掣801利用正
己烷／乙酸乙酯／正丁醇／甲醇／乙酸／水(1：2：1：l：5：1)溶剂体系从大豆中分离到
纯度大于90％的四种异黄酮单体；Ma等川利用HSCCC，以乙酸乙酯．甲醇．乙酸．
水(4：1：0．25：5)为溶剂系统，从黄芪粗提物中出分离出两种异黄酮，纯度均大
于95％。此外，有人用正己烷／正丁醇／甲醇／水(1：4：2：6)溶剂体系从淫羊藿中
分离到纯度大于86％的淫羊藿苷【82】；用乙酸乙酯／正丁醇／水(2：1：3)溶剂体系从野
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葛中一步分离到纯度大于90％的包括葛根素在内的7个异黄酮类化合物[83】；用正
己烷／乙酸乙酯／甲醇／水(1：6：1．5：7．5)溶剂体系从显齿蛇葡萄中分离到两种黄酮
苷刚；用正己烷／乙醇／水(10：5．5：4．5与10：7：3)溶剂体系从丹参中分离出6种
丹参酮嘲。Zhou等t861用HSCCC从短瓣金莲花(TrolliuSledebouriReichb．)分离得
到2个黄酮苷类、1个未知化合物(纯度均在97．0％以上)和1个部分纯化的组分(纯度
为85．1％)，随后用半制备型HPLC纯化)，其溶剂体系为乙酸乙酯／正丁醇／水(2：1：
3，“v、。
1．2．5黄酮类化合物的活性研究方法
黄酮类化合物具有广泛的生物学功能。包括抑制脂质过氧化、降血脂、抑制
血小板凝聚、抑制毛细管透性增加和变脆的作用，在生物体内有预防心血管疾病、
防癌抗癌、调节免疫、抗衰老、抗菌杀菌、吸收紫外辐射、止咳、祛痰、泻下、
解痉、提高记忆力、抗过敏、活血化瘀、利胆及肝脏保护作用等诸多药理作用及
功效【87J。
1．2．5．1抗氧化、清除氧自由基的作用
黄酮类化合物B环上的3，4．邻二羟基是具有清除自由基生物活性的关键
结构，其它位上的羟基可不同程度的增加其抗氧化能力，这是因为该类化合物清
除自由基的作用是通过自身供氢氧化实现的，邻位羟基的存在可使一个羟基供氢
氧化形成羰基，从而使邻位的另一羟基更易于形成分子内氢键，使氧化后的物质
更稳定，从而中断自由基导致的链反应。
自由基(freeradical)存体内的过多累积，被认为是引起癌症、衰老、心血管
等退变必病的主要原因。研究发现【88,891，体内各种理化致癌因子必须在体内经过
代谢活化形成自由基形式，并与其它自由基一起富集于脂质细胞膜周围，引起脂
质过氧化，破坏细胞的DNA而致癌。同时，自由基作用于脂质产生的过氧化物
及其产物丙二醛等既能致癌，也能致突变。HaSook掣90】认为，自由基对人体的
危害主要是对组成细胞脂蛋白和原生质膜的多彳i饱和脂肪酸(PUFA)的氧化，导
致膜流动性丧失、受体错位、细胞溶解、含硫酶及一些蛋白质的失活交联或变性
等，进而破坏细胞DNA而产生癌变。类黄酮属酚类物质，可鳌合金属离子，从
而抑制体内微量金属离子参与催化的脂质过氧化过程，同时，类黄酮作为抗氧化
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剂和自由基的淬灭剂，能有效地阻止脂质过氧化引起的细胞破坏，起到抗癌防癌
作用【9l】。Beate等嗍认为，类黄酮也具有清除超氧离子和羟基自由基的作用，因
类黄酮酚羟基上的氢原子可与过氧自由基结合．生成黄酮自由基，该自由基进而
与其它自由基反应，从而终止自由基链式反应；并且发现，类黄酮抗氧化作用大
小与其分子中B环的邻位一二羟基结构及其A环上3，5位羟基群密切相关。
Mercedes等【931研究发现，在植物源食物中分布广泛的槲皮素具有广泛的生物活
必可以抑制动物体内癌变细胞的增殖和生长发育以及化学诱变的肿瘤的形成等。
测定自由基清除能力的方法有DPPH自由基清除法f94。961、超氧阴离子自由基
(02‘·)清除法【971、羟自由基(·OH)清除法【9引、烷过氧基(ROO·)【991、次氯酸盐
法【1001、对Fe3+还原力的测赳1011、化学发光法【1蚴等。在黄酮提取物的抗氧化性
研究方面，国外曾有人利用DPPH法研究羟基黄酮【103】TinosporaCrispa【1041以及单
宁和类黄酮的抗氧化能力110引。
章荣华，傅剑云【106l等在体外使用诱导人血清低密度脂蛋白胆固醇的氧化反
应，分别用荧光法、凝胶电泳法和紫外检测法来评价竹叶黄酮的抗氧化作用，在
H202诱导的脂质过氧化体系中，竹叶黄酮(水溶性维生素类似物)和Vc相似，
虽在低剂量时表现出显著的抗氧化性能，但在高浓度时，却有促氧化的作用，说
明竹叶黄酮与丁基化羟基甲苯，抗坏血酸，乙二胺四乙酸一样，对有机体具有显
著的保护作用。章荣华等‘1061，冯磊等‘1071，马世玉等【108】经过对大小鼠多个体内
动物实验证实，竹叶黄酮具有提升体内抗氧化水平的作用。
郑公铭等【1091对荔枝皮进行食品抗氧化研究，结果表明，成熟荔枝皮和未成
熟(生理落果)荔枝皮提取物均有很强的抗氧化活性，经层析、化学显色推断，抗
氧化成分主要是黄酮类物质。
姚明兰【110J从少孢根酶发酵豆粕中提取出异黄酮FSMI物质，FSMI的抗氧化
效果较SMI(未发酵豆粕中的异黄酮)要好，这主要是因为大豆异黄酮在豆粕发酵
过程中由于少孢根素的作用，使绝大部分异黄酮糖苷离解为苷元，而游离的苷元
具有更强的抗氧化性和其它生物活性。
1．2．5．2对心血管系统的作用
黄酮类化合物对于心血管系统的作用是多方面的，银杏叶总黄酮有较明显的
降低血浆胆固醇及甘油三酯水平的作用?¨，并且能够预防家兔的动脉粥样硬化。
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AviramM和FutmnanB【112]研究发现，健康受试者饮用红葡萄酒后，他们血浆中携
带抗氧化黄酮类的H3L明显增加；而对大鼠的实验表明葡萄酒中的黄酮类化合物
能够有效预防动脉粥样硬化。不少治冠心病有效的中草药或活血化淤类中药中均
含有黄酮类化合物。贾剩113】采用放射免疫测定法研究沙棘总黄酮对大鼠血浆
PGl2和TXA2水平的影响，结果表明沙棘总黄酮具有单纯增强PGl2分泌的作用。
三棱总黄酮具有较强的抗血小板聚集及抗血栓作用【1141而血竭总黄酮能够明显地
抑制静脉血栓的形成【115】。银杏黄酮具有较好的抗凝作用但溶栓作用不明显【1161，
植物黄酮还有舒张血管平滑肌、保护血管内皮细胞功能和抑制血管平滑肌细胞
(VSMCs)增生等作用。李庆林‘117】等人观察了黄蜀葵花总黄酮对用心电图(ECG)
记录注射垂体后叶素的大鼠心电图T波升高的幅度的影响；对冠状动脉结扎造成
的急性心肌梗塞大鼠血清中CPK、LDH和血清游离脂肪酸水甲的改变以及对小鼠
心肌线粒体叶MDA、SOD币flGSHPx的改变。结果心电图T波升高幅度受到抑制，
大鼠血清中游离脂肪酸水平降低，CKP和LDH升高受到抑制，小鼠心肌线粒体中
SOD和GSHPx活性提高，MDA生成减少，表明黄蜀葵花总黄酮对心肌损伤有一
定的保护作用。此外，有研究11181提示木黄酮有望成为防治心脏纤维化的物质。
1．2．5．3抗炎作用及提高机体免疫力
根据报道，沙棘总黄酮能增强T细胞(淋巴细胞免疫的效应细胞之一)百分率
和胸腺指数，并在低浓度时促进淋巴细胞的转化，高浓度时抑制其转化，从而提
高机体免疫功能。Gen可增强鼠巨噬细胞NO的产生，NO是活化巨噬细胞杀伤
肿细胞时产生的毒性效应分子之一。Gen可增强肿瘤局部NO的产生而发挥其抗
肿瘤作用。此外，生物类黄酮中的异黄酮类和香豆素类等显示出抗雌激素作用。
1986年，Adlercreut首次报道妇女尿中异黄酮植物雌激素含量和妇女患乳腺癌机
率成反比?91，近年来，这方面的研究主要集中在大豆异黄酮类及其皂苷对乳腺
癌的作用上，并有人推测，异黄酮等的抗雌激素作用可能是其抗癌的机制。多种
资料显示性激素与致癌有关，其途径是通过细胞分裂。而植物雌激素类通过竞争
结合雌激素受体，增加性激素结合蛋白的合成，进而抑制肿瘤细胞的增殖【1201。
1．3本课题的研究意义
菊米作为一种饮品在浙江省的使用具有悠久的历史，其败毒散疗、去风清火、
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明目的药效作用得到了人们越来越多的关注。黄酮类化合物是野菊花的主要
有效成分之一(菊米初提物总黄酮含量可达13％)。目前，菊米生产和销售
正不断壮大，但菊米中总黄酮未得到完全的开发和研究。本课题研究了菊米总黄
酮纯化的方法和工艺，在前人的基础上对菊米化学成分和药理作用进行了进一步
研究，提高了菊米有效成分开发的价值，有利于人们对菊米化学成分开发前景和
药理作用的认识和了解，能够促进菊米资源的合理利用和产业化的发展。
1．4本课题的项目来源、研究目标及思路
本课题是浙江省科技计划项目的一部分。
本课题的研究目标：建立一种高效纯化菊米提取液总黄酮的方法；对菊米乙
酸乙酯相中黄酮类化合物组分进行分离和鉴定；对菊米的抗氧化活性进行研究。
研究思路：
1．菊米中总黄酮纯化方法的探讨。采用大孔吸附树脂吸附与洗脱进行纯化，
并通过对流速、浓度、pH、刁i同树脂之间的组合及洗脱剂的彳化合物I>化合物m。纯化后的总黄酮在低浓度条件下
清除率彳、=高，但当浓度达到200烬·mL。1时纯化后的黄酮样品对自由基的清除率已
经达至1]94．72％，比同等浓度的Vc的清楚能力还要高。
6．3本章小结
本章实验采用分光光度法测定了菊米所分离单体对DPPH自由基的清除率并
与对照物Vc的清除率进行了比较。结果表明，采用DPPH·法评价了初提物、纯化
后总黄酮、化合物I．III的抗氧化活性，结果表明：纯化后的总黄酮在相同的高
浓度条件下对LtVc有较强的抗氧化能力。除化合物IlI乡'b，其他化合物对DPPH自
由基均具有很强的抗氧化活性，在较低的浓度条件下清除能力强于Vc。在相同
浓度条件下化合物I．III抗氧化的大小顺序是：化合物II>化合物I>Vc>化合
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1、通过分析8种树脂(包括常用的AB．8、D101等)对菊米总黄酮的吸附、解吸
特性，综合考虑吸附量、吸附率、解吸率和各种影响因素，最终确定采用200702
型树脂进行二次纯化，其具有吸附量大，解吸容易，纯化效果好等优点，是一种
性能良好的菊米黄酮吸附剂。该树脂的最佳吸附条件为：上样质量浓度为0．35
mg·mL一，上样液pH5～6，吸附流速5．0mL·min"1。最佳解吸条件为：采用70％的
乙醇溶液做为洗脱剂，洗脱流速3．OmL·min～，采用200702串联200702进行二次纯
2、将经粉碎后菊米浸提得到菊米总浸膏，然后用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正
丁醇分别萃取得到彳化合物I>Vc>化合物III。
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浙江工商大学硕士学位论文
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浙江工商人学硕上学位论文
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浙江工商人学硕-上学位论文
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浙江工商人学硕士学位论文
攻读学位期间发表论文
熊春华，李大方，姚彩萍，励建荣．大孔吸附树脂吸附染料木素的研究【J】．中国食品学报，
2007(6)：71-76．
．．70．．
浙江工商大学硕士学位论文
本论文是在导师熊春华教授的悉心指导下完成的。在论文选题、实验研究到
论文写作的整个过程中，熊春华教授不仅给予了我宏观上的指导，还给予了我无
数微观上的帮助。在和导师相处的短短两年里，熊老师的言传身教使我在科研能
力上有了很大的提高，熊老师的耐心指导使我的学习能力也得到了很大的提高，
在此谨向熊老师表示衷心的感谢和深深的敬意。除此之外，还要感谢熊老师在生
活上对我的照顾和教诲。熊老师渊博的知识、活跃的学术思想、敏锐的洞察力、
严谨的科研态度和忘我的工作精神以及对事业孜孜不倦的追求和拼搏进取、不畏
困难、积极向上的人生态度，将是我一生的学习榜样。同时，还要感谢师母姚老
师对我的指导和关怀。
特别感谢逆流色谱研究室各位同仁在我进行植物的提取、分离、纯化、分析
鉴定和工艺研究等实验方面给予的很多无私的指导和帮助!没有他的帮助和支
持，我不可能如此顺利的完成整个实验。
衷心的感谢王奎武老师在我进行化合物分析和化合物鉴定过程中给予的指
由衷地感谢励建荣教授、杜琪珍教授、张虹教授、钟立人教授、杨荣华教授、
邓少平教授、孟岳成教授、戴志远教授、梁新乐副教授、王琪老师、周凌霄老师、
毕丽君老师、傅玉颖老师在研究生学习过程中给予我的教导和帮助。
此外，要感谢蒋志国博士、王绪强、郑巨约等同学对我的帮助和支持。还要
感谢同实验室的田华、徐银荣、张晓民、刘晓政、吕建、蒙媛、冯宇杰及曾经帮
助过我的王校冬、陈立忠、王茹、姜晓文、钟海军、林森、温军辉、程文伟、周
蓉、包晓丽等同学，感谢他们对我的帮助和鼓励，没有他们我的研究生生活不会
如此愉快和顺利的度过。
最后，还要特别感谢我的父母、大学同窗以及同窗室友对我学习生活的关心
和帮助，他们始终不渝的关心和支持一直伴随着我成长。}