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实验动物管理与法规　课件.ppt137页
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实验动物管理与法规 ――科学发展的保证
实验动物的重要性
实验动物的现状
实验动物立法的重要性
现有实验动物法规
什么是实验动物？
实验动物: 是指经人工饲养、繁育，对其携带的微生物及寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，应用于科学研究、教学、生产和检定以及其他科学实验的动物。
实验动物的特点 遗传学控制 人工培育、遗传限定、特性稳定、基因纯合 微生物学控制 无菌级动物、无特定病原体级动物、清洁级动物、普通级动物 营养学控制 营养成分均衡稳定、适口性好、无污染 环境生态学控制 恒温、恒压、恒湿、无尘、无菌、全新风、周期光照、参数稳定、全封闭屏障环境
实验动物的来源 野生动物
大鼠 小鼠 豚鼠 地鼠 猴 实验动物的用途 科学研究 教学实习
生物制药 安全评价
产品鉴定 环境评估
实验动物的重要性
实验动物是活的模型，是生命科学发展的助推器
实验动物是诺贝尔医学奖的幕后功臣 实验动物是科学发展的基石
实验动物是人类的替身
实验动物的重要性
实验动物是诺贝尔生理学和医学奖的幕后功臣 诺贝尔生理学和医学奖创立百年以来，三分之二的获奖者所取得的研究成果是依靠动物实验，共有75个奖项得益于动物实验。 在这75个奖项中，使用4种或以上实验动物的奖项有7项，使用3种的有11项，使用2种的有16项，使用1种的有41项 实验动物的重要性 获奖项目所使用的实验动物，小鼠占15项，犬、鸡、牛各占14项，兔占11项，大鼠、豚鼠各占10项，蛙占8项，猫占7项，猪占3项，果蝇、线虫占2项，黑猩猩占1项
1904年度诺贝尔生理学和医学奖 俄国生理学家I.P.巴甫洛夫运用狗作了大量的动物实验，在心脏生理、消化生理和高级神经活动三个方
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[公告]有奖活动～征集实验动物技术操作标准操作规程(SOP)
原创名称：实验动物寄生虫监测标准操作规程(SOP)关键词：实验动物寄生虫监测目的：规范实验动物寄生虫监测的具体过程，确保监测结果可靠。主体内容：实验动物的寄生虫种类繁多。从寄生虫分类学角度，可分为原虫、蠕虫及节肢动物，蠕虫又可分为吸虫、绦虫和线虫。从宿主角度，可分为小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、猫、犬及灵长类的寄生虫。从寄生部位，又可将寄生虫分为体内寄生虫与体外寄生虫。1. 体外寄生虫检查方法（1）观察法：用肉眼观察或借助于放大镜对动物进行仔细观察，体外寄生虫感染严重时，可引起动物脱毛、毛糙甚至由于瘙痒引起溃疡、结痂，检查时尤其注意动物易感染部位，如耳根、颈后、眼周、背部、臀部及腹股沟等。用梳子梳理动物毛发，可发现虱、蚤等节肢类寄生虫。（2）透明胶带粘取法：适用于大、小鼠，将2cm宽的透明胶带剪成与载玻片近等长的胶条，粘取动物毛发，查螨。（3）被毛检查法：取宿主易感染部位被毛少许，加一滴生理盐水后加盖玻片，镜下观察有无虫体。（4）皮屑刮取法：用刀片刮取宿主感染部位，尤其是出现溃疡或结痂处，用力刮取深层屑片，置于载玻片上，加两滴10％ NaOH溶液使之液化（或两滴甘油使之透明），加盖玻片镜检。此法适用于疥螨和痒螨的检查。2. 体内寄生虫（1）肠道寄生虫：采取粪便，用肉眼观察有无可见线虫、吸虫或绦虫的节片，然后将粪便直接涂片检查虫卵、包囊及原虫。也可采用以下方法检查：①饱和盐水漂浮法：在有粪便标本的漂浮管内加少许饱和盐水，调匀，再加饱和盐水至漂浮管3/4处，放置3～5 min，挑去粗渣后，加饱和盐水至液面高出管口，静置20 min，用盖玻片轻轻压于液面，垂直提起，放在载玻片上镜检。②离心沉淀法：将标本加入离心管内，以1500 rpm 离心15 min，弃去上清液，将剩余少许液体与沉淀混匀，用吸管吸出滴在载玻片上，加盖玻片镜检。③解剖动物：解剖动物，从肠道收集标本。（2）组织内寄生虫：在解剖动物时，对疑为寄生虫感染的部位做组织压片、切片检查。血液寄生虫
实验动物的血液寄生虫极为罕见，从野外捕获或有野外媒介昆虫侵入的饲养环境中的动物不排除血液寄生虫的感染。检查时，取末梢血、静脉血或骨髓制成涂片，染色后镜检。此外，用于微生物学检查的多种免疫学方法均可检查寄生虫。转载自中华人民共和国国家标准《实验动物 配合饲料卫生标准》（GB1）名称：实验动物营养监测标准操作规程(SOP)关键词：实验动物营养监测目的：规范实验动物营养监测的具体过程，确保监测结果可靠。主体内容：饲料的营养监测是实验动物饲料质量管理必不可少的一个重要环节和手段。要定期对产品和原料进行抽样，通过对外观、营养成分和有毒有害物质含量的分析、检测，对饲料的品质进行评定。1．感观检测。根据国家标准《实验动物配合饲料通用质量标准》（GB1）的规定，我国实验动物全价营养饲料的感官指标应是：混合均匀，新鲜、无杂质、无异味、无霉变、无发酵、无虫蛀及鼠咬。依据标准，通过视觉、味觉、嗅觉和触觉等直接观察饲料的感官性状是否达标。2．营养成分测定。各种实验动物配合饲料营养成分指标应分别符合国家标准《实验动物 大小鼠配合饲料》、《实验动物 兔配合饲料》、《实验动物 豚鼠配合饲料》、《实验动物 地鼠配合饲料》、《实验动物 犬配合饲料》、《实验动物 猴配合饲料》（GB924.8-2001）中的规定。需要消毒灭菌的配合饲料，应考虑到不同消毒灭菌方法可能造成某些营养成分的损失，适当地提高相应营养成分的含量，保证配合饲料在消毒后和饲喂前符合国家标准GB-2001营养成分含量的规定。按照标准，应经常对饲料常规营养成分进行监测，包括水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、以及钙、磷水平的检测；定期检测饲料中氨基酸、维生素、矿物质和微量元素等指标是否符合国家标准规定。3．饲料卫生指标的测定
配合饲料卫生指标应符合GB1的规定（见表1，表2），且不得掺入抗生素、驱虫剂、防腐剂、色素、促生长剂以及激素等药物及添加剂。依照标准，应定期对饲料进行微生物及化学污染物的检测。表1 微生物指标项
类&&小鼠 大鼠&&兔&&豚鼠&&地鼠&&犬&&猴菌落总数，cfu/g
≤&&5×104&&1×105&&1×105&&1×105&&5×104&&5×104大肠菌群，MPN/100g
≤&&30&&90&&90&&90&&30&&30霉菌和酵母数，cfu/g
≤&&100&&100&&100&&100&&100&&100致病菌（沙门菌）&&均不得检出引自中华人民共和国国家标准《实验动物 配合饲料卫生标准》（GB1）表2化学污染物指标项
标镉，mg/kg
≤&&0.2砷，mg/kg
≤&&0.7汞，mg/kg
≤&&0.02铅，mg/kg
≤&&1.0六六六，mg/kg
≤&&0.3滴滴涕，mg/kg
≤&&0.2黄曲霉毒素B1，μg /k g
≤&&20.0原创名称：实验动物环境监测标准操作规程(SOP)关键词：实验动物环境监测目的：规范实验动物环境监测的具体过程，确保监测结果可靠。主体内容：实验动物的环境监测主要是对饲养环境的噪声、照明、空气中细菌、粉尘、温度、湿度、气流速度、换气次数、压强梯度和过滤器的过滤效率等进行测定。一、环境温、湿度测定1. 测定要求。实验动物设施环境温度测定应在动物设施竣工空调系统运转48h后或设施正常运行之中进行测定。测定时，应根据设施设计的空调和洁净等级确定动物饲育区及实验工作区，并在区内布置测点。测量仪器可用精度为0.1以上的标准水银干湿温度计、热敏电阻式数字型温湿度测定仪。2. 测定方法。当设施环境温度波动范围＞±2℃，室内相对湿度波动范围＞10％时，温湿度测定宜连续进行8h，每次测定间隔为15～30min。二、环境气流速度测定1. 测定要求。在实验设施运转接近设计负荷，连续运行48h以上后进行测定。测量仪器可选用精度为0.01以上的热球式电风速计、智能化数字显示式风速计等。实验动物饲养设施和动物实验设施，应根据设计要求和使用目的确定动物饲育区和实验工作区，要在区内布置测点。一般空调房间应选择放置实验动物用具的具有代表性的位置及室内中心位置布点。恒温恒湿设施应选择在离围护结构0.5m，离地高度1.0m及室内中心位置布点。2. 测定方法。乱流洁净室按洁净面积≤50m2至少布置测定5个测点，每增加20～50m2增加3～5个位点。取各测定点平均值，并根据各测点各次测定值判定室内气流速度变动范围及稳定状态。三、环境换气次数测定1. 测定要求。在实验设施运转接近设计负荷，连续运行48h以上进行测定。测量仪器选用精度0.01以上的热球式电风速计或智能化数字显示式风速计。2. 测定方法。通过测定送风口风量（正压式）或出风口风量（负压式）及室内容积来计算换气次数。（1）风口为方形或长方形者，应将风口断面分成100mm×150mm以下的若干个等分面积，分别测定各个等分面积中心点的风速，求出平均值，作为平均风速。（2）送风口为圆形时，直径在200mm以下者，在径向上选取2个测定点进行测定；直径在200～300mm者，用同心圆做2个等面积环带，在径向上选取4个测定点进行测定；直径在300～600mm者，用同心圆做3个等面积环带，在径向上选取6个测定点进行测定；直径＞600mm者，用同心圆做5个等面积环带，在径向上选10个测定点进行测定，求出风速的平均值。（3）在装有圆形进风口的情况下，可应用与之管径相等、1000mm长的辅助风道或应用风斗型辅助风道按（2）所述方法进行测定。如果送风口为方形或长方形，则应用相应形状截面的辅助风道，按（1）所述方法进行测定。3. 结果计算。以下式求得换气量：Q＝3600S 上式再乘以校正系数即可求得标准状态下的换气量。校正系数进风口为1.0，出风口为0.8，以20℃为标准状态进行公式换算：Q0＝3600[（273+20）/（273+t）]S 换气次数则由下式求得：n＝Q/V以上公式中：Q为所求换气量（m3/h）；S为有效横截面积（m2）； 为平均风速（m/s）；Q0为标准状态时的换气量（m3/h）；t 为送风温度（℃）；n为换气次数（次/h）；V为室内容积（m3）。四、环境梯度压差测定1. 测定要求。静态测试应在洁净实验动物设施空调送风系统连续运行48h以上、已处于正常运行状态、工艺设备已安装、设施内无生产工作人员的情况下进行检测；动态测试在洁净实验动物设施已处于正常使用状态下进行测试。测量仪器用精度可达1/10Pa的微压计。2. 测定方法。测试在实验动物设施内进行，根据设施设计与布局，按人流、物流、气流走向依次布点测定。每个测点的数据应在设施与仪器稳定运行的条件下读取。五、环境空气洁净度测定1. 测定要求。静态检测在实验动物设施内环境净化空调系统正常连续运转48h以上、工艺设备已安装、室内无动物及工作人员的情况下进行检测；动态检测在实验动物设施处于正常生产或实验工作状态下进行检测。检测仪器为激光尘埃粒子计数器。2. 测定方法。静态检测时，应对洁净区及其净化空调系统进行彻底清洁；测量仪器充分预热，采样管长度应为仪器的允许长度，当无规定时，不宜大于1.5m；采样管口的流速，宜与洁净室断面平均风速相接近；测试人员应在采样口的下风侧。动态检测时，在洁净动物设施内，选择有代表性测点的气流上风向进行检测，检测方法操作细则与静态检测相同。对测点的布置，检测洁净实验工作区时，如无特殊实验要求，取样高度为距地面1.0m高的工作平面上；检测洁净实验动物室时，取样高度为笼架高度的中央水平高度约0.9～1.0m的平面上。测点间距为0.5～2.0m，层流洁净室测点总数不少于20点；乱流洁净室面积不大于50m2的布置5个测点，每增加20～50m2应增加3～5个测点，每个测点连续测定3次，求取平均值，为该点的实测结果。对于大于或等于0.5μm的尘埃粒子数确定：层流洁净室取各测定点的最大值。乱流洁净室取各测点的平均值作为实测结果。六、环境空气落下菌数测定1. 测定要求。应在实验动物设施空调净化系统正常运行48h，经消毒灭菌后进行。2. 测点选择。每5～10m2设置1个测定点，将备好的培养皿（血液琼脂培养基）放于地面上。3. 测定时间。平皿打开盖后放置30min，盖上盖后，放到37℃保温箱内培养48h后计算菌落数（个/皿）。七、环境噪声测定1. 测定要求。静态检测在实验动物设施内环境通风、净化、空调系统正常连续运转48h后，工艺设备已安装，室内无动物及生产实验工作人员的条件下进行检测。动态检验在实验动物设施处于正常生产或实验工作状态条件下进行检测。测量仪器为声级计。2. 测定方法。测点布置：面积＜10m2的房间，于房间中心离地1.2m高度设一个点；面积＞10m2的房间，在室内离开墙壁反射面1.0m及中心位置，距地面1.2m高度布点检测。实验动物设施内噪音测定以声级计A档为准进行测定。八、环境内照度测定1. 测定要求。实验动物及动物实验设施内工作照度，在工作光源全部接通，并正常使用状态下进行测定。测定仪器为便携式照度计。2. 测定方法。在实验动物设施内选定几个具有代表性的点进行测定。距地面0.9m，离开反光墙面1.0m处测定。打开动物笼盖或在笼网上测定光照强度。九、环境氨浓度测定1．测定要求。测定在实验动物设施正常运行状态，并且饲育动物密度符合有关规定标准的状态下进行，垫料更换符合时限要求。检测仪器为大型气泡吸收管，空气采样机，分光光度计。2. 测定方法。实验动物设施环境中NH3浓度检测应用纳氏试剂比色法进行。其原理是：氨与纳氏试剂作用产生黄色，以比色定量。此法检测灵敏度为2μg/10ml。本法可以定量分析空气中微量的氨，其灵敏度可以达到10ml吸收液中含有2μg的氨应有0.027±0.002吸光度。测定范围在10ml样品溶液中含2～20μg氨。（1）检测试剂吸收液：0.05mol/L H2SO4溶液。纳氏试剂：称取17g HgCl2 溶于300ml蒸馏水中，再称取35g KI溶解在100ml蒸馏水中，将HgCl2 溶液缓慢地加入到KI溶液中，直到形成红色沉淀不再溶解为止。然后加入 600ml 20％ NaOH溶液及剩余的HgCl2 溶液。将此液静置1～2d，使红色混浊物下沉。将上清液移到棕色瓶中，保存备用。标准溶液：称取3.879g （NH4）2SO4（80℃干燥1h），用少量吸收液溶解。移入1000ml容量瓶中，并用吸收液稀释到刻度，此溶液1ml含0.1mg NH3，为贮备液。量取20ml贮备液移入1000ml容量瓶中，用吸收液稀释至刻度，配成1ml含0.02mg NH3的标准溶液。（2）样品采集：用装有5ml吸收液的大型气泡吸收管安装在空气采样器上，以0.5L/min的速度抽取5L被检气体。采样点选择在有代表性的位置，如动物笼具内或动物室中间等。（3）分析步骤：采样结束后，从采样管中取1ml样品溶液，置于试管中，加4ml吸收液，同时按表5-4配制标准色列，绘制标准曲线。&&表5-4
氨标准色列管的配制&& 管
10&&标准液（ml）
2.00.05mol/L H2SO4（ml）5
3.0&&纳氏试剂（ml）
0.5&&氨含量
0.004 0.008 0.012 0.016
0.024 0.028 0.032 0.036 0.04&&吸光度&&&&向样品管中加入0.5 ml纳氏试剂，混匀，放置5min后用分光光度计500nm处比色，读取吸光度值，从标准曲线表中查出相对应的氨含量。3. 计算。见下式：&&X=5C/V0&&式中：X――空气中氨浓度（mg/m3）；&&C――样品溶液中氨含量（mg）；&&V0 ――换算成标准状态下的采样体积（L）。&&根据所采集的平行样品数，求出平均值即为所求氨浓度。&&4．注意事项当氨的浓度过高时，则形成棕红色沉淀，需另取样品，增加稀释倍数，重新分析；甲醛和硫化氢对测定有干扰；所有试剂均需用无氨水配制。本人本月SOP第3帖 适合药厂从业人员化验室主任、实验员、开发人员参观学习，不当之处请质证名称： 异常毒性试验标准操作规程(SOP)关键词：异常毒性
SOP 目的：建立异常毒性试验实验方法，以检验注射剂、输液及粉针制剂的异常毒性原理：略主体内容：1.设备和供应：1.1 注射器 1.2 手术器械 1.3 高压灭菌锅1.4 秒表1.5 西林瓶2.试剂：2.1 消毒酒精（75%）2.2 注射用生理盐水3.操作程序：3.1 准备工作：3.1.1用具的洗涤和灭菌：3.1.1.1西林瓶用水冲洗，再用清洁液浸泡片刻，取出用水及蒸馏水依次冲洗干净后，凉干备用。3.1.1.2 胶塞、注射器及注射针，用水和蒸馏水冲洗干净后在蒸馏水中煮沸10分钟，取出，备用。3.1.1.3 以上用具使用前，121℃湿热灭菌30分钟。3.1.2 实验动物的准备：3.1.2.1 实验用小白鼠应同一来源同品种，雌者无孕，健康无伤，毛色光滑，眼睛红亮、活泼，须在同一饲养条件下饲养三天以上，在称重前，自然饱腹，体重17~20克，做过试验的小白鼠，不得重复使用。3.1.2.2 将称好体重的小白鼠分别平均使用，每批供试品用5只小白鼠，复试每批用10只。3.1.3 供试品溶液：除另有规定外用氯化钠注射液按各品种项下规定的浓度制成供试品溶液。3.2 实验操作：3.2.1 将各种试验用具及供试品溶液按一定位置安排在工作台上，鼠盒要贴好写好供试品批号、日期的标签。3.2.2 将注射器与注射针配套后，用少量供试品溶液洗涤三次，弃去洗液，量取供试品溶液后，排除注射器内的空气至准确所需量。3.2.3 捉小白鼠并在其身后捏住尾巴将其提起放入固定器上，使小白鼠固定。3.2.4 左手扭转鼠尾或左或右的一侧，使其尾静脉向上，右手用镊子取75%酒精棉球搽试小白鼠尾巴，使其扩张及消毒。3.2.5 在尾长近尾尖1/4处用左手三指捏住尾巴，右手持注射器，即在捏住处用针尖与尾巴成一适宜的角度（小于30度）刺入静脉平行地推入少许供试品溶液（约0.01ML）。3.2.6 立即将注射器内栓平行地推入，应在4―5秒内匀速注入供试品溶液0.5ML（规定缓慢注射的品种可延长至30秒），并记录时间，如皮下发白且药液阻力很大，表示针头未插入静脉内，如3次未注入应另取小白鼠重试。3.2.7 注射完毕后拔出针头，用左手拇指按住注射部位，取一消毒棉包住注射部位轻轻揉压，使溶液不再流出。3.2.8 观察即时反应，正常饲养。3.3 结果判定：48小时内不得有死亡，如有死亡时，应另取18―19G小白鼠10只复试，全部小白鼠48小时不得有死亡为符合规定。4.附录：4.1 编写依据:《中国药典》2005年版二部 附录就差细胞活性了，，正在编写，，都是认证啊……每月每ID得分不超过三分，请战友们注意。转载加原创名称：大鼠足底光热刺激潜伏期测定标准操作规程(SOP)关键词：疼痛; 热刺激潜伏期;PWTL目的及原理：本实验通过测定大鼠对强光照射足底因疼痛而缩足所需的时间来说明动物对痛刺激的敏感程度。主体内容：实验准备：热痛刺激仪（以BME-410A型为例），测试架（上铺玻璃平板），环境安静，室温保持在22-26℃，测量时间段一致（如早8点至晚6点之间）操作步骤1.实验前5 天每日将大鼠置于实验观察箱中30 m in, 使之适应;2.调节灯源与玻璃板之间的距离, 使落在玻璃板的照射光圈直径为53.将大鼠置于测试架玻璃板上的透明有机玻璃箱中，待其安静下来，应用热刺激仪校准光照取大鼠足底固定部位,
换刺激强光，记录从强光照射开始至出现缩足逃避反射时间( s) ,此即为PW TL; 4.重复测量 5 次, 同一侧足底间隔10m in, 不同侧间隔5 m in, 取PW TL 平均值. 如果大于40 s 大鼠仍无反应则停止照射, 以免导致足底组织热损伤.主要参考文献：略转载加原创名称：大鼠足底光热刺激潜伏期测定标准操作规程(SOP)关键词：疼痛; 热刺激潜伏期;PWTL目的及原理：本实验通过测定大鼠对强光照射足底因疼痛而缩足所需的时间来说明动物对痛刺激的敏感程度。主体内容：实验准备：热痛刺激仪（以BME-410A型为例），测试架（上铺玻璃平板），环境安静，室温保持在22-26℃，测量时间段一致（如早8点至晚6点之间）操作步骤1.实验前5 天每日将大鼠置于实验观察箱中30 m in, 使之适应;2.调节灯源与玻璃板之间的距离, 使落在玻璃板的照射光圈直径为53.将大鼠置于测试架玻璃板上的透明有机玻璃箱中，待其安静下来，应用热刺激仪校准光照取大鼠足底固定部位,
换刺激强光，记录从强光照射开始至出现缩足逃避反射时间( s) ,此即为PW TL; 4.重复测量 5 次, 同一侧足底间隔10m in, 不同侧间隔5 m in, 取PW TL 平均值. 如果大于40 s 大鼠仍无反应则停止照射, 以免导致足底组织热损伤.主要参考文献：略名称:实验动物的给药途径关键词：经口给药法
注射给药法目的：动物给药主体内容： 一．经口给药法(一)灌胃法此法给药剂量准确，是借灌胃器将药物直接灌到动物胃内的•种常用给药法。1．鼠类：鼠类的灌胃器由特殊的灌胃针构成。左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的右U角中，插入口中，沿咽后壁慢慢插入食道，使其前端到达膈肌位置，灌胃插入时应无阻力，如有阻力或动物挣扎则应退针或将针拔出，以免损伤、穿破食道或误入气管。2．兔、犬等：灌胃一般要借助于开口器、灌胃管进行。先将动物固定，再将开口器固定于上下门齿之间。然后将灌胃管(常用导尿管代替)从开口器的小孔插入动物口中，沿咽后壁而进入食道。插入后应检查灌胃管是否确实插入食道。可将灌胃管外开口放入盛水的烧杯中，若无气泡产生，表明灌胃管被正确插入胃中，未误入气管。此时将注射器与灌胃管相连，注入药液。(二)口服法口服给药是把药物混入饲料或溶干饮水中让动物自由摄取。此法优点是简单方便，缺点是剂量不能保证准确，且动物个体间服药量差异较大。大动物在给予片剂、丸剂、胶囊剂时，可将药物用镊子或手指送到舌根部，迅速关闭口腔，将头部稍稍抬高，使其自然吞咽。二、注射给药法(一)皮下注射皮卜注射一般选取皮下组织疏松的部位，大鼠、小鼠和豚鼠可在颈后肩胛问、腹部两侧作皮下注射；家兔可在背部或耳根部作皮卜注射；猫、犬则在大腿外侧作皮下注射。皮下注射用左手拇指和食指轻轻提起动物皮肤，右手持注射器，使针头水平刺入皮下。推送药液时注射部位隆起。拨针时，以手指捏住针刺部位，可防止药液外漏。(二)肌肉注射肌肉注射一般选肌肉发达，无大血管通过的部位。大鼠、小鼠、豚鼠可注射大腿外侧肌肉；家兔可在腰椎旁的肌肉、臀部或股部肌肉注射；犬等大型动物选臀部注射。注射时针头宜斜刺迅速人肌肉，回抽针栓如无回血，即可注射。(三)腹腔注射给大鼠、小鼠进行腹腔注射时，以左手固定动物，使腹部向上，为避免伤及内脏，应尽量使动物头处于低位，使内脏移向上腹，右手持注射器从下腹两侧向头方刺入皮下，针头稍向前，再将注射器沿45角斜向穿过腹肌进入腹腔，此时有落空感，回抽无回血或尿液，即可注入药液。免、犬等动物腹腔注射时，可由助手固定动物，使其腹部朝上，实验者即可进行操作。注射位置为：家兔下腹部近腹白线左右两侧1cm处，犬脐后腹白线两侧边1―2cm处进行腹腔注射。(四)静脉注射1、大鼠和小鼠：常采用尾静脉注射。注射时，先将动物固定在暴露尾部的固定器内，尾部用45―50℃的温水浸润几分钟或用75％酒精棉球反复擦拭使血管扩张，并使表皮角质软化。以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，用中指从下面托起鼠，右手持注射器，使针头尽量采取与尾部平行的角度进针，从尾末端处刺入，注入药液，如无阻力，表示针头已进入静脉，注射后把尾部向注射侧弯曲，或拔针后随即以干棉球按住注射部位以止血。2、豚鼠：可采用前肢皮下头静脉、后肢小隐静脉注射或耳缘静脉注射。3、家兔：一般采用耳缘静脉注射。注射时先将家兔用固定盒固定，拔去注射部位的毛，用酒精棉球涂擦耳缘静脉，并用手指弹动或轻轻揉擦兔耳，使静脉充血，然后用左手食指和中指压住耳根端，拇指和小指夹住耳边缘部，以无名指放在耳下作垫，右手持注射器从静脉末端刺入血管，注入药液。注射后，用纱布或脱脂棉压迫止血。名称:实验动物的给药剂量及药量计算关键词：无目的：动物给药主体内容：一、给药剂量不同种类的实验动物一次给药能耐受的最大剂量不同，灌胃太多时易导致胃扩张，静脉给药剂量过多时易导致心力衰竭和肺水肿。现将不同种类实验动物一次给药最大耐受量列出，以供参考。为观察某种药物对动物的作用时，给药剂量的准确与否是个很重要的题。剂量太小，作用不明显，剂量太大，又可能导致动物中毒死亡。表二
不同种类实验动物一次给药能耐受的最大剂量(ml)动物名称&&灌胃&&皮下注射&&肌肉注射&&腹腔注射&&静脉注射小鼠&&0.9&&1.5&&0.2&&1&&0.8大鼠&&5.0&&5.0&&0.5&&2&&4.0兔&&200&&10&&2．0&&5&&10猫&&150&&10&&2．0&&5&&10猴&&300&&50&&3．0&&10&&20犬&&500&&100&&4．0&&―&&100推荐使用厂述方法确定剂量：1、先用少量小鼠粗略的摸索山毒剂量或致死剂量，然后用中毒剂量或致死剂量的若干分之作为应用剂量，一般可取1／10-1／5。2、确定剂量后，如第一次实验的作用不明显，动物也没有中毒的表现(体重下降、精神不振、活动减少或其它症状)，可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，作用也明显，则应减少剂量再次实验。在一般情况下，在适宜剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增强。所以有条件：时，最好同时用儿个剂量做实验，以便迅速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出现剂量与作用强度毫无规律时，则更应慎重分析。3、用人动物进行实验时，开始的剂量可采用给鼠类剂量的十五分之一至二分之一，以后可根据动物的反应调整剂量。4、确定动物的给药剂量时，要考虑给药动物的年龄大小和体质强弱。―般说，确定的给药剂量是指成年动物的，如果幼小动物，剂量应减小。服量为100，灌胃量应为100-200，皮下注射量为30―50，肌肉注射量为25―30，静脉注射量为25。二、实验动物给药量的计算方法动物实验所用的药物剂量一般按毫克／公斤体重或克／公斤体重计算，应用时须从已知药液的浓度换算㈩相当于每公斤体重应注射的药液量(毫升数)，以便给药。三、人与动物的给药量换算方法人与动物对同药物的耐受性相差很大。一般说来，动物的耐受性比人大，也就是单位体重动物的用药量比人要人，近几年来新药药效研究中多以下列公式计算：D2=D1×K2／K1×W1/W2D为药物剂量，K为常数，W为动物体重(kg)(1指人；2指动物。人及不同种类动物的K值不同，人1．6、猴11．2、兔10．1、大鼠9．1、小鼠9．1、鼠9．8、猫9．8。如一例体重为70kg的人，某药剂量为20ug．kg-1．D-1，―只5kg重的猴为53．6 ug．kg-1．D-1，一只10kg重的大为40．4ug．kg-1．D-1，而一只20g重的小鼠为260．6 ug．kg-1．D-1(见表三)人用剂量与不同种类动物间剂量的关系。表三
人用剂量与不同种类动物间剂量的关系种类&&人&&猴&&犬&&小鼠体重&&50&&60&&70&&80&&4&&5&&6&&10&&12&&15&&0.02ug.kg-1.d-1&&11.2&&10.5&&10&&9.6&&28.9&&26.8&&25.2&&20.2&&79.0&&77.7&&730.3&&22.4&&21.0&&20&&19.2&&57.8&&53.6&&50.4&&40.4&&38.0&&35.4&&260.6&&33.6&&31.5&&30&&28.8&&86.7&&80.4&&75.6&&60.6&&57.0&&53.1&&390.9&&44.8&&42.0&&40&&38.4&&115.6&&107.2&&100.8&&80.8&&76.0&&70.8&&527.2&&56.0&&52.5&&50&&48.0&&144.5&&734.0&&126.0&&107.0&&95.0&&88.5&&651.5&&112.0&&105.0&&100&&96.0&&289.0&&268.0&&252.0&&202.0&&790.0&&777.0&&1303注；*表示人与动物的不同体重，以kg表示，第三行以下数据单位为ug.kg-1.d-1。名称:实验动物的采血和采尿关键词：采血
采尿目的：无主体内容：一、采血(一)剪尾采血1、剪尾采血：需血量较少时常用此法。先将动物固定，将鼠尾浸在45℃左右温水中几分钟或用酒精棉球涂擦鼠尾，使尾部血管充盈，剪去尾尖1-2mm(小鼠)或3―5mm(大鼠)，使血液顺血管壁自由流入试管或用血红蛋白吸管吸取。采血结束时，伤口消毒并压迫止血。小鼠每次可取血0．1ml左右，大鼠可取血0．3―0．5ml。2、内眦取血：操作者―手固定小鼠或大鼠，食指和拇指轻轻压迫颈部两侧，使眶后动静脉充血，另一只手持毛细采血管，以45度从内眼刺入，并向下旋转，感觉刺入血管后，再向外边退边吸，使血液顺承血管自由流入小管中，当得到所需血量后，放松加于颈部的压力，并拔出采血器，以防穿刺孔出血，若技术熟练，此方法在短期内可重复采血，小鼠一次可取血0．2―0．3ml左右，大鼠可取血约0．5ml。如只进行一次取血，可采用摘眼球法。(二)豚鼠1、耳缘切口采血：先将豚鼠耳消毒，用刀片割破耳缘，则血可自动流出而进入容器。此法能采血约0．5ml。2、背中足静脉采血：将豚鼠后肢关节伸直，提到实验者面前。实验者将动物脚背面用酒精消毒，找出背中是静脉后，用左手拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右手持注射针刺入静脉，抽出注射针后即有血液渗出。3、心脏采血：采血前，将动物麻醉并仰卧固定置实验台上。心前区皮肤脱毛，常规消毒。于左侧第3、4肋间心尖搏动最强处将针头垂直刺人心脏，由于心谖的搏动，血液可自导致动物很快死亡。经6―7天后可重复穿刺采血。(三)家兔1、耳缘静脉采血：采量较少时可用此法，是家兔最常用的采血方法，具体方法同耳缘静脉给药。此法一次可采血5―10ml，可多次重复使用。2、心脏采血：与豚鼠心脏采血法类似。心脏穿刺部位在第3肋骨间隙，胸骨左缘3mm处，每次可取血20―25ml。二、采尿(一)代谢笼法此法较常用，适用于大鼠和小鼠的尿液采集代谢笼是能将尿液和粪便分开而达到收集动物尿夜目的―-―种特殊装置。(二)导尿法此法常用于雄性兔、犬、动物轻度麻醉后，固定于手术台上，由尿道插入导管(顶端应涂抹液体石蜡)，可以采到未污染的尿液。(三)压迫膀胱法此法适用于兔、犬等动物，将动物轻度麻醉后，实验者用手在动物下腹部加压，动作要轻柔而有力，当外加压力足以使膀胱括约肌松弛时，尿液会自动由尿道排出。请注意发帖质量本帖为技术操作标准操作规程(SOP)对不起，上次发错地方了，重发一次我们单位的名称：标 准 管 理 规 程关键词：实验动物管理制度
目的:为保证药品生产、检定和科研的质量，加强对实验动物的科学管理，特制定本制度。适用范围:药理室涉及使用的实验动物责任人:药理室人员负责本制度的实施主体内容:1 总则1.1 本制度所指的实验动物是指人工饲育、遗传背景明确或来源清楚的，用于药品生产、检定和科研的动物。1.2 实行国家实验动物质量监督和质量合格认证制度。2 实验动物的购入、接受2.1 实验动物负责人应根据生产、检验需要及现有实验动物情况提前半个月制定实验动物购入计划，内容包括所需实验动物品名、品种或品系、性别、数量、体重等。4.2.2 实验动物负责人必须在获得并验收了供应单位实验动物许可证后，才能与供应单位签定供需合同。2.3 实验动物的运输器具要安全可靠，符合国家微生物控制的登记要求。不得将不同品系动物混装。运输过程应保证实验动物的健康和安全。2.4 接受动物前应检查动物数量和质量，不符合要求的动物应予拒收，普通级动物质量检查要求如下：外观：皮毛清洁、光滑、有光泽；肌肉丰满、体态健壮、活泼；行动无异常；头脸不肿；背不穹起；四肢、尾和皮肤无缺损、无疥癣；泻殖孔清洁、正常。2.5 每次购入动物，要有详细的记录。新购入动物放入已经消毒的检疫室隔离观察一周以上，确定无传染病后，方可移入饲养室。2.6 实验动物从接受之日起，即建立健康档案，每天详细记录动物健康及使用情况。3 实验动物的饲养3.1 实验动物饲养室必须通风，温度控制在18～29℃，相对湿度控制在40～70%，每天记录温湿度。3.2 饲养室内保持整洁、安静、噪音控制在60分贝以内，禁止存放与饲养实验动物无关的物品。3.3 每天投放饲料前，应检查饲料外观质量，不得使用霉变、虫蛀、鼠咬等变质的饲料。每次填写饲料使用记录。饲料不足半个月用量时，应及时请购。物流中心必须向有饲料生产许可证的厂家购买合格的饲料。3.4 垫料使用前应消毒，并要求清洁、干燥、无毒、无虫、无感染源、无污染、不可吃、能吸水。每周更换垫料二次，并填写垫料使用记录，不足半个月用量时，应及时购买补充。3.5 严格执行各项实验动物饲养操作规程、实验动物笼具清洁、消毒规程、实验动物房清洁、消毒规程。每周清洁消毒笼具二次，每周清洁消毒饮水瓶、吸管、饲养室、观察室、实验动物室一次，并做记录。3.6 及时记录实验动物数量，不足半个月用量时应及时请购。3.7 严格控制外来人员及物品随意出入饲养室。3.8 发现异常死亡或可疑传染病动物要及时报告部门负责人，作出诊断，及时处理。3.9 发现传染病时，动物全部销毁；饲养室、实验室、用具、垫料、笼具、衣服、鞋帽等必须进行彻底消毒；动物房消毒封闭一定时间后才能开启使用。4 动物实验4.1 严格执行各项实验动物标准操作规程。实验必须使用合格动物，否则实验数据和测试结果无效。4.2 实验人员操作应尽量轻柔，以免影响实验动物并惊吓其它动物。4.3 实验结束及时清洁实验用具和实验场地。4.4 动物尸体及极其废弃物，应及时采取无害化处理。5 实验动物工作人员5.1 各类人员应得到省（市）级主管部门的资格认可，并应遵循实验动物管理的各项规定。5.2 工作时须穿着工作服。5.3 各类人员应每年进行一次体检和预防免疫，发现患有人畜共患传染病者，应及时治疗并调离本岗位。6
严禁本厂非工作人员进入动物房；因工作需要进入动物房的应履行登记手续；凡参观学习等人员必须经公司主管质量的付总经理批准并应履行登记手续。 7
实验室和实验动物一旦发生安全问题，应立即报告质检科负责人，不得擅自处理，应按厂有关的安全管理制度执行。原创名称：2-AAF/PH(2-乙酰氨基芴灌喂+2/3肝切除）模型制作关键词：2-乙酰氨基芴，肝切除目的：制作制作肝卵圆细胞（肝脏干细胞）增殖的模型背景知识：无原理：肝脏是个再生能力非常强的器官，一般由肝细胞来完成肝再生，当肝损伤严重时，则启动为卵圆细胞增殖并分化为肝细胞和胆管细胞来完成肝脏再生。内源性肝脏干细胞是指存在于肝脏内具有增殖分化为肝细胞和胆管细胞的能力的一类细胞,一般认为卵圆细胞是内源性肝脏干细胞的主要成分。肝卵圆细胞增殖的动物模型有几种，主要是必须破坏肝细胞或抑制肝细胞再生，同时通过部分肝切除或化学药物来刺激肝脏再生，而启动卵圆细胞增殖。比较经典的就是2-AAF/PH模型主体内容：
肝卵圆细胞增殖模型的制作参见Solt-Farber方法。每日按10mg/kg剂量灌喂2-乙酰氨基芴(2-acetyailamifluorene, 2-AAF),连续4天，第5日在乙醚麻醉下行2/3肝切除(下附肝切除方法)，手术当日不灌喂2-AAF，术后按10mg/kg剂量继续灌喂一周。2-AFF用分子量400的聚乙二醇溶解成浓度为2mg/ml的溶液。附：肝切除方法（1）麻醉
采用乙醚吸入全麻。（2）使大鼠仰卧，四肢固定，皮肤消毒后，在剑突下取正中切口，切开皮肤，皮下组织，肌层到腹腔。切口长3厘米左右。（3）在切口上方事先放一消毒后的结扎线，用双手轻轻挤压切口两侧使肝脏露出体外。将肝脏四叶（右侧叶、中叶、左叶和尾叶）中的左侧叶及中叶翻向上方结扎线处，切除量为全肝的70%，用结扎线将上述2叶的根部（血管束部）结扎。在结扎线上方将上述3叶切除和止血。（4）将余肝返回腹腔，缝合肌层，皮下组织及皮肤。主要参考文献：Petersen BE, Zajac VF, Michalopoulos GK. Hepatic oval cell activation in response to injury following chemically induced periportal or pericentral damage in rats. Hepatology. ):1030-8.原创名称：重症急性胰腺炎动物模型制备关键词：重症急性胰腺炎目的：制作重症急性胰腺炎动物模型背景知识：这是我师兄的课题中的部分，技术很成熟原理：SAP的发病机理复杂，主要有胰酶异常激活、白细胞过度激活、胰腺微循环紊乱等学说，在造成胰腺损伤的同时，激活胰腺内的炎症细胞使其释放炎症介质，这些炎症介质逸入血液循环激活机体其他炎症细胞，释放大量的炎症介质，引起瀑布反应(cascade)，促成全身炎症反应综合征状态（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）和多器官功能衰竭。主体内容：1. 动物术前准备和麻醉所有大鼠在模型制备前均在实验室用普通鼠料饲养两周，以适应环境。术前均禁食12h，自由进水。各组大鼠均用戊巴比妥钠30mg/kg，腹腔内注射麻醉，成功后用一小塑料通气管放置口咽，以防气道窒息，腹部去毛，平卧固定，碘伏消毒颈部、腹部和腹股沟区。2.制作动物模型取上腹部正中切口1.5cm，进腹后，对照组：仅翻动十二指肠并触摸胰腺数次。SAP组和各药物治疗组：制作模型参照Aho等介绍的方法并加以改进，沿幽门寻找十二指肠，将其提至切口外，暴露胰胆管进入十二指肠处即十二指肠乳状，在肠壁对系膜缘，将针尖端磨钝的5号针穿刺入十二指肠肠腔内，经其乳状开口进入胰胆管约0.5cm，同时近肝门处用无损伤小动脉夹夹闭胰胆管，防止行胰管注射液体向肝脏反流，由微量泵控制，恒压恒速下，注入新鲜配制的5%牛磺胆酸钠1.5ml/kg，注射速度为12ml/h，完毕后，抽出针头，小动脉夹夹闭近乳状胰胆管5min，确定胰腺出现肉眼可见的水肿、出血变化后，去除动脉夹，用无损伤线修补十二指肠穿刺口的浆肌层。待确认腹腔动脉导管位置妥当后，缝合切口并包扎。3 .导管的放置静脉置管：在麻醉后制模前，经右侧颈内静脉切开插入一根PE50聚乙烯导管作为静脉输液。动脉置管：在制模后关腹前，经右侧股动脉将一根PE10聚乙烯导管逆行插入腹主动脉，使导管末端至腹腔干动脉开口处，用Evans 0.2ml注入导管内，立即观察胰腺血管是否染色，以确认导管位置深度，实验完毕行解剖再次证实导管位置。所有导管通过皮下从肩胛下穿出固定导管，并用一根约30cm长绳固定大鼠，允许其自由活动。主要参考文献：无.转载:中国医科大学学报,):388-389.名称:大鼠肺动脉压检测方法关键词：大鼠,肺动脉压,检测目的：建立直接检测大鼠肺动脉压的方法背景知识： 肺动脉高压是临床常见疾病,近年来,肺动脉高压的研究已成为许多学者瞩目的领域.但与检测系统动脉压不同肺动脉压的检测难度较大(特别是在小动物).本法应用自制末端呈弧形的PV-1肺动脉插管,建立了直接检测大鼠Ppa的方法.原理：略主体内容：1.制备大鼠肺动脉导管:取长度约15cmPV-1管,在其末端1cm处用火焰加热,待导管遇热开始软化时,使其末端在重力作用下逐渐弯曲,形成半径为3mm左右的圆滑弧型.插管制备成后,在距离末端3~4cm处做标记,作为插管时判断导管位置之用.2.颈动脉及肺动脉插管:戊巴比妥钠45mg/kg麻醉大鼠,仰位固定于手术板上,正中切开颈部皮肤,钝性分离皮下组织及肌层,剥离颈动脉及右颈外静脉,将与压力换能器连接并充满肝素盐水的PE-50管插入颈动脉,压力换能器通过载波放大器与多导生理记录仪相连,所记录压力代表系统循环血压.将上述制备的肺动脉插管内充满肝素盐水,插入右侧颈外静脉.插入过程中,保持PV-1导管的弧向下方,并根据插管的标记判断到达心脏部位时,将插管左旋并向前进,此时密切观察生理记录仪显示屏.当压力基线上升并出现肺动脉波形时,立即将PV-1导管固定,并开始描记Ppa.如果插管失败,可将导管回拉1cm左右,再次向前推进,直到出现肺动脉压波形.插管过程中,大鼠由于麻醉可出现分泌物阻塞气道现象,此时可进行气管插管,吸出分泌物,呼吸道通畅后,再行肺动脉插管,插管时,应注意观察主动脉压波形,若反复刺激会出现心率失常,应停止操作,当其恢复后,再继续进行.主要参考文献：[1]WangHL,ZhangXH,XingJ.Tetrandrineinhibitschronic/inflamma2tory0pulmonaryhypertensioninrats[J].ActaPharmacologicaSinica,):401-404.[2]WangHL,ZhangXH,HongY,etal.Ttrandrinepreventsmonocro2taline-inducedpulmonaryhypertensionintherats[J].DrugDeveloRes,):158-160.[3]WangHL.Theserotoninreceptorasapotentialtherapeutictargetforpulmonaryvascularremodeling[J].DrugDevelopRes,):4-10.[4]WangHL,ZhangXH.Effectsoftetrandrineonsmoothmusclecontrac2tioninducedbymediatorsinpulmonaryhypertension[J].ActaPharma2cologicaSinica,):.[5]WangHL,DongX,ZhangXH,etal.52HT1Breceptoraugmented52HTvasoconstrictionresponseofpulmonaryarteryinMCTinducedpulmonaryhypertensionrats[J].ActaPharmacologicaSinica,):269-273.[6]WangHL.Theserotoninreceptorisanoveltherapeutictargetforpul2monaryvascularremodeling[J].DrugDevelopRes,):261.[7]王建勇,王怀良,章新华,等.白花前胡对野百合碱所致大鼠肺动脉高压的影响[J].中国药学杂志,):90-93.[8]陈修,陈维洲,曾贵云.心血管药理学[M].北京:人民卫生出版社,2002.8.转载加部分原创，转载自　江勇　Journal of Hepatopancreatobiliary Surgery　2004；Vol. 16 No. 1名称：二袖套法大鼠肝移植标准操作规程(SOP)关键词：大鼠;肝移植目的：建立大鼠肝移植模型主体内容：1.术前准备材料供体最好为200～250 g雄性大鼠，受体最好为250～300 g雄性大鼠。肝下下腔静脉及门静脉袖套管采用输液管制成,袖套管提前作划痕以利于固定。胆管套管采用硬膜外管显微器械一套灌注液，保存液，肝素生理盐水2.手术取肝供体术前不禁食,用10％水合氯醛3ml/ kg 腹腔注射全身麻醉。腹部垂直切口进腹，剑突向头端牵开;胸部垫以腰垫。右侧腰静脉远端细针穿刺注入含肝素25U 生理盐水2 ml。剪开镰状韧带，结扎左膈下静脉，顺时针方向游离肝周韧带。结扎右肾动脉、右肾静脉及右肾上腺上静脉,
游离肝下下腔静脉。在左右肝管分叉下方1 cm 处楔形切开胆总管前壁,向近肝段插入胆管套管, 丝线结扎固定。游离肝固有动脉暂不结扎。结扎幽门静脉。游离腹主动脉，静脉穿刺针穿刺,缓慢注入4 ℃乳酸林格液(内含肝素25 U/ml) 15 ml ,待肝脏颜色变浅时, 立即结扎并切断肝固有动脉于左肾静脉上缘切断下腔静脉,开放流出道,切断门静脉,剪开膈肌,剪断肝上下腔静脉并附带膈肌环,将肝脏放入4 ℃乳酸林格液中保存。修肝以下操作均在4 ℃冰浴中进行。用微血管镊穿过自制袖套管腔,夹住门静脉断端后拖出外翻于套管壁,在袖套划痕上结扎,同法处理肝下下腔静脉套管,注意勿使袖套管扭曲。经门静脉袖套管注入4 ℃乳酸林格液5 ml 冲出肝内残留血液。将肝脏复位,沿肝上下腔静脉环形剪断膈肌,注意保留膈肌环的完整性,剪开膈肌环内隔膜少许以扩大肝上下腔静脉出口。在肝上下腔静脉右角8#0 血管缝线缝扎一针,作牵引用,左角部缝合带针血管缝线留作吻合肝上下腔静脉用。将肝脏置4 ℃乳酸林格液中保存。植肝术前12 h 禁食但不禁水,手术前30 min 肌注阿托品0. 03 mg ,氯胺酮100 mg/ kg 肌注全身麻醉。腹部正中切口上至剑突,左右侧腹壁各作2 根牵引线将腹壁牵开。湿纱布覆盖肠管。在右肾静脉上缘平面游离肝下下腔静脉,穿牵引线,结扎切断右肾上腺上静脉,游离肝周韧带,结扎左膈静脉,充分游离肝上下腔静脉,带牵引线。结扎切断左肝至食管血管,游离胆总管,在分叉处切断,将远端胆总管翻向下方,游离切断肝固有动脉,在幽门静脉水平上方游离门静脉,大鼠面罩吸氧,依次贴肝用微血管夹阻断门静脉及肝下下腔静脉,在门静脉分叉处穿刺,注入常温生理盐水2～3ml ,驱除肝脏内血液,用小Satinsky 钳阻断肝上下腔静脉,近肝切断肝上下腔静脉、门静脉及肝下下腔静脉,移去原肝。将供肝自4 ℃冰浴中取出,原位放入肝脏腔隙内,将供肝左侧8#0 血管缝线与受体肝上下腔静脉左侧角缝合,结扎,连续缝合腔静脉后壁,至右侧角时与供肝右侧牵引线打结,再作腔静脉前壁连续缝合至左侧角,生理盐水冲洗血管腔排出气泡,与线尾打结,完成肝上下腔静脉吻合。经门静脉袖套管注入常温生理盐水2 ml ,排出供肝内冷灌注液,微血管夹夹闭供肝肝下下腔静脉。将阻断受体门静脉的微血管夹下移至幽门静脉水平,排出门静脉内血液及血块,冲洗血管腔,迅速插入供体门静脉袖套管,用5#0 丝线结扎,移去门静脉微血管夹及肝上下腔静脉Satinsky 钳,供肝恢复血流,结束无肝期,供肝胆管内有胆汁流出。将受体肝下下腔静脉微血管夹下移至右肾静脉上缘,去除下腔静脉内的血液及血凝块,肝素生理盐水冲洗后立即插入供肝肝下下腔静脉袖套管,5#0 丝线结扎固定。将胆总管支架管插入受体胆总管管腔内,5#0丝线结扎,大网膜覆盖,腹腔内注入含青霉素20 万单位的温生理盐水2 ml ,关腹。术后给予复温,完全清醒后2ｈ自由进糖水,术后第1 天自由进食。名称：内皮素-1诱导的局部脑缺血大鼠模型标准操作规程(SOP)关键词：ET-1
局部脑缺血 SD大鼠目的：本操作规程是关于利用内皮素-1诱导局部脑缺血大鼠模型对药物治疗脑缺血效果进行评价的具体操作规程。背景知识：无原理：利用ET-1强烈的收缩血管效应，并在MCA附近位置注射，制作局部脑缺血模型。主体内容：首先，大鼠通过腹腔内注射2%的戊巴比妥钠（40mg/kg）被麻醉，同时保持呼吸畅通。如果需要可补充注射。然后把大鼠以俯卧位放在立体定位架上。于颅顶中线切开皮肤，暴露颅骨。运用微孔钻在前囟前0.9mm，左5.2mm的位置钻一孔，用微量加样器垂直刺入，当达到8.7mm深时， 3μl ET-1用0.6μl/min的速度注入。等待5mins后，缓慢抽出针头，缝合伤口。在手术过程中，一加热毯被用来保持大鼠直肠温度在37.0℃±0.5℃。手术后1h内所有的大鼠被严密监护,然后放回笼子。名称：内皮素-1诱导的局部脑缺血大鼠模型标准操作规程(SOP)关键词：ET-1
局部脑缺血 SD大鼠目的：本操作规程是关于利用内皮素-1诱导局部脑缺血大鼠模型对药物治疗脑缺血效果进行评价的具体操作规程。背景知识：无原理：利用ET-1强烈的收缩血管效应，并在MCA附近位置注射，制作局部脑缺血模型。主体内容：首先，大鼠通过腹腔内注射2%的戊巴比妥钠（40mg/kg）被麻醉，同时保持呼吸畅通。如果需要可补充注射。然后把大鼠以俯卧位放在立体定位架上。于颅顶中线切开皮肤，暴露颅骨。运用微孔钻在前囟前0.9mm，左5.2mm的位置钻一孔，用微量加样器垂直刺入，当达到8.7mm深时， 3μl ET-1用0.6μl/min的速度注入。等待5mins后，缓慢抽出针头，缝合伤口。在手术过程中，一加热毯被用来保持大鼠直肠温度在37.0℃±0.5℃。手术后1h内所有的大鼠被严密监护,然后放回笼子。名称：转基因小鼠模型的建立(SOP)关键词：转基因小鼠目的：在动物体研究转化基因背景知识：无原理：
转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。当制备转基因动物时，外源基因可能只整合到动物的部分组织细胞的基因组，也可能整合进动物所有组织细胞的基因组中。部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物，称为嵌合体动物。此类动物中，只有外源基因整合的“部分组织细胞”恰为生殖细胞时，转基因才具有遗传性状，否则，外源基因将不能传给子代。转基因的方法多样，有胚胎干细胞法、逆转录病毒载体法，显微注射法等，此章介绍显微注射法制备转基因小鼠。此法获得转基因动物的数量较多。（一）显微注射法的基本原理和方法转基因小鼠制备的基本原理是将改建后的目的基因(或基因组片段)用显微注射法注入供体小鼠的受精卵(或着床前胚胎细胞)，然后将此受精卵(或着床前胚胎细胞)再植入受体动物的输卵管(或子宫)中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，通过分析转基因和实验小鼠表型的关系，研究揭示外源基因的功能，而且可进行工程动物的大量生产。Gorden等报道了显微注射法用于转基因小鼠的制备。本法是最早，且应用成功率较高的一种转基因方法。其基本步骤如下：1．同步获得供体雌鼠（注射激素的雌鼠与正常雄鼠交配而得）和假孕受体母鼠（正常雌鼠与结扎雄鼠交配产生)。2．供体鼠注射绒毛膜促性腺激素后，采集清晰的原核受精卵。
3. 用显微注射法将纯化的外源基因注射进受精卵的原核内。4. 受精卵鉴定 ，将存活受精卵或存活胚胎移植到同步交配的假孕母鼠的输卵管(或子宫)内，饲养后鉴定是否受孕以及个体发育状况。 5. 子代鼠外源基因整合和表达的检测。6. 转基因小鼠品系的建立。
[优点]（1）外源基因在宿主染色体上的整合率相对较高；（2）此法导入外源基因无需载体；（3）转基因小鼠得率在60%-80%；（4）导入的外源基因可长达50kb。[不足之处]（1）外源基因随机整合；（2）个别原核不清晰，需进行特殊处理；（3）需大型精密仪器，费用昂贵；（4）操作周期相对较长。
（二）实验器材的准备1．输精管切除术用器材：弯式有齿镊、直式有齿镊、显微镊、手术剪、自动小夹涂药器、自动小夹、带弯针4/0丝线及持针器、直径为10cm塑料 Petri氏培养皿（内盛70%乙醇）。2．手术前麻醉
2，2，2 三溴乙醇（阿佛丁）是相当有效的麻醉剂。因该试剂对光敏感，所以应该于4度避光保存，新试剂用前应进行测试。经腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠后，为了使麻醉剂尽快发生作用，将小鼠放回原笼熟悉的环境中，小鼠将会更容易松驰下来。 挤压小鼠脚垫，如果小鼠能感觉到此刺激，小鼠将从挤压部位开始缩腿运动（pedal reflex），用此方法可以检察是否麻醉完全。实验中小鼠无缩腿运动、小鼠达到手术所需的麻醉深度以及程度方可开始手术。
三溴乙醇的反复使用可能引起小鼠腹膜刺激征或者炎症反应。其他麻醉剂中，克他命/甲苯噻嗪在兽医界广泛应用，另外，克他命/美托咪定也越来越受到青睐，特别是在美国。我国一些实验室用戊巴比妥钠的效果好,特别是尾静脉注射控制很方便.30g左右小鼠用0.85%的戊巴比妥钠0.3ml左右。3．受精卵的采集用器材：70%乙醇、手术剪、10mL解剖剪、手术镊、M2溶液（Sigma）、小玻璃皿等。4．离体输卵管中受精卵收集用器材：二氧化碳孵育箱、眼科镊子、5号镊子、无菌30-mm组织培养皿、解剖显微镜、透明质酸酶、移液管、工作液、M16溶液（Sigma）、3ml注射器等。5．DNA显微注射用器材（1） 受精卵的收集与移动用器材：巴氏移液管、酒精灯、特制吸管、玻璃刀等。（2） 凹玻片准备：一块标准的凹型载玻片（硅化）、矿物油（Sigma）、工作液等。（3） 注射设备的设置：微型水力驱动设备、Hamilton Gas-Tite™注射器（250 l）、Intramedic™管道系统（外径1.27mm，内径0.86mm）、两只玻璃管道连接头、三通管连接器、一只带接头的60ml塑料注射器、一只器械套管、矿物油等。（4）受精卵的显微注射用器材：凹玻片（显微注射用）、倒置立体相差显微镜或倒置Nomarski立体光学显微镜、显微操纵器、千分尺（连接添满矿物油，且耐气构造的250l汉密尔顿注射器）、气压装置(50ml充满气体的注射器) 、持卵管、预载DNA的注射针等。6．输卵管转移的准备（1） 手术试剂器材：麻醉剂（阿佛丁或可他命/甲苯噻嗪）、70%乙醇、一副钝性齿镊、两副5号精细镊子、一副10cm手术剪、带自动小夹的金属大剪、一个小弹簧夹、外科缝线、解剖显微镜、纤维光学照明器、载针头的1ml注射器、kimwipe绵纸或外科纱布、9cm 塑料皿、工作液、移液管和手动移卵管等。所有的手术器械在使用前应该彻底清洗，70%乙醇消毒或高热灭菌处理。（2）受体母鼠的准备
输卵管转移的受体鼠应该为4-6周龄大小，体重在20-25克左右，严禁用低体重以及超重母鼠，若体重较低，其体能不足以维持妊娠，可能导致受精卵的重新吸收；若体重较重，麻醉剂被吸收入脂肪组织，降低麻醉效果，可能使手术困难，而且脂肪组织的存在意味着静脉的存在，所以手术时切掉脂肪组织可能导致不必要的出血，难以确认手术时的操作对象。出血也可能堵塞移卵管。选择输卵管转移前一天晚上与切除输精管小鼠交配的假孕母鼠，注射当天早上母鼠可见精栓。尽管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重，随着体重的增加，它们将表现出不同程度的感觉消失，但它们是优良的哺育母鼠。另外，它们的价格也便宜。另一个成功的鼠系是B6D2F1，它们生命力强并有一定杂合优势。（3）麻醉剂：阿佛丁被证明是输卵管转移手术的有效麻醉剂。（三）实验操作程序和方法1．鼠系克隆（1） 动情期的探测：在转基因动物模型的建立中母鼠动情期的监测有很高的技巧性。小鼠的动情期主要划分为四个时期：① 动情后期：阴道口无扩张，周围组织为灰白色，阴道口周围无膨大② 间情期：阴道开口小，周围组织为灰色或蓝色。③ 动情前期：阴道口逐渐扩张，阴道周围组织由粉红色变为红色。④ 动情期：阴道周围组织颜色由红色转为粉红色，阴道口背侧唇可见条纹，阴道口腹侧唇可见肿大，阴道有分泌液外渗。
随机选择动物，任何时间都可能有20%-25%的动物处于动情期。大多鼠科动物的动情期平均持续4-5天，所以对群居性动物的个体进行动情周期的同步化处理后可能在任一时期产生大量发情动物。动情期动物的选择需两个指标：阴道周围组织色泽和组织膨胀的程度。动情期动物阴道组织深粉红色，但并不同于炎症时的色泽。另外，阴道口周围背腹部组织肿胀而有光泽，起初其腹部可见条纹。个别阴道口组织色泽较深，但无膨胀，或阴道口稍微扩大且略带灰色者为非动情期动物，切勿误选它们用于交配。（2）交配的确认：阴栓形成。动物合笼后，确定雄性个体是否与母鼠成功交配非常有必要。由于雄性精液可在阴道内凝固成柔软栓性物，成功交配后不久有阴道栓形成。以手的中指、小指和拇指捏住雌性尾根处，使小鼠头部向下，仔细观察阴道口部位，交配过的雌性小鼠可见有白色橡皮擦状的阴道栓，易肉眼所见，难以确定时可用小探针检查阴道深部是否有栓子存在。检查阴栓应在每天早上的早些时间，因为随着时间的推移，阴栓将被排出体外。2．输精管切除术：输精管切除小鼠用于与晶胚转移母鼠交配使母鼠假孕。小鼠6-8周龄进行输精管切除术，CD-1 B6D2F1(C57BL6 *DBA/2)或Swiss Webster系是通常的实验对象。阿佛丁腹腔注射麻醉剂量为240mg/kg。 （1）&&称重后麻醉小鼠，背位固定小鼠，大剪刀贴近皮肤剪毛，70%的乙醇涂
搽消毒手术切口部位，以防止毛发污染切口。（2）&&于生殖器前方大约1.3cm处横行剪开下腹部皮肤，作约1cm的切口， 用浸70%乙醇的纱布搽拭切口部位以清理毛发。（3）&&切开腹膜，进行膀胱定位。每侧都可见有一条管道走行，用镊子轻轻夹持左侧管道，提起部分使手术视野清晰可见，确定其为输精管。（4）&&将镊子插进输精管下方，使它们处于自然状态，其末端垂直。同时在该位置两端用缝线结扎输精管，距离大约4-5毫米。在两结扎点间剪断输精管，置其于纱布上确定此侧手术完毕。 （5）&&将输精管两个断端轻轻放回腹腔，如上处理右侧输精管。两侧手术完毕后，2-3根单独缝线缝合腹壁切口。待用缝线须浸泡在70%乙醇中，保持缝线湿润，防止结扎时粘附组织。用两个或三个自动小夹夹闭皮肤。（6）&&为保暖包裹小鼠于纱布中或将其放置于热垫内使其苏醒，处于麻醉状态下的小鼠应该严格监护直到其完全苏醒。手术后小鼠饲养2周后确定手术是否成功。（7） 实验性饲养：将1-2只母鼠与输精管切除小鼠合笼饲养，次晨进行阴道栓检查。有阴道栓的母鼠，用磷酸缓冲液处理后24小时，其输卵管潮红。卵细胞应该处于单细胞期或未受孕状态，若处于双细胞期，则输精管切除未完全，雄性小鼠应进行再筛选。3．受精卵的收集（1）受精卵的采集：受精卵获得的方法分自然排卵和激素诱发排卵以及体外受精三种方法。本章对诱发排卵法给予介绍。
诱发排卵法：雌性小鼠生后6―8周达到性成熟，性周期均为4―5 日，其排卵时间可用饲养室的明亮和黑暗进行调节，所以必须对饲养室的明暗规律进行准确严格地管理。
性周期是卵泡刺激素和黄体生成素相互作用的结果，我们可以从外部给予这些激素诱发排卵。向成熟雌小鼠腹腔内注射5国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)之后，约在48―54h后再将2.5-5.0 IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔内，约12h后即可诱发排卵。排卵数量可达自然排卵的2倍，效果很好。雌小鼠给予hCG后应立刻与雄性合笼。成熟雄小鼠应按每笼饲养1只，雄性小鼠大小在12周龄到1年。合笼时，须将激素化雌性小鼠放进雄小鼠的笼中。雄小鼠释放促雌性发情的外激素，在交配过程中建议不换笼，交配过的雄小鼠，间隔一周后才进行下次交配。显微注射的受精卵最好于交配后次晨注射前几小时收集，此时易进行注射操作。交配后过夜小鼠的阴道栓易见，可用交配指示剂指示。对超排卵的交配母鼠体内进行阴道栓计数一般正常。低比率的有栓母鼠说明促性腺激素失去效力或雄性小鼠交配过度或雄性小鼠老龄化。收获受精卵必须打开小鼠腹腔，输卵管必须仔细切开。输卵管冲洗术或输卵管壶部切开术都可作为收集受精卵的方法。（2）腹腔内输卵管的切开1） 通过断颈或二氧化碳吸入快速处死小鼠。 2） 将动物背位固定在无菌干燥的吸水纸上，剪毛并用70%的乙醇彻底涂搽手术部位。以避免毛发污染手术视野。
3） 持眼科镊捏紧下腹部正中线皮肤，用外科剪作小的横切口，剪刀钝性分离充分暴露手术视野，或钝性撕开皮肤暴露腹膜。用眼科剪打开腹膜，充分暴露腹腔与子宫角部手术视野。子宫为Y形，为起自盆腔膀胱后的肌性器官，向上分支为两侧子宫角，向上横行深入腹腔。 4） 用镊子距输卵管卵巢6-7mm处夹持子宫角翻转后轻轻拖出腹腔，在镊子捏点下部子宫角下方附近刺破肠系膜，清除肠系膜组织远离子宫角与输卵管，并防止用力过大压破子宫角与输卵管连接处。5） 用镊子拖出脂肪垫，卵巢，输卵管以及子宫部件。小心剪掉卵巢与输卵管之间的薄层膜，然后剪下输卵管和部分子宫角，将其盛放在盛工作液的小玻璃皿中，对另一侧输卵管重复上面操作，完毕后如上处理下一只动物。（3）离体输卵管内受精卵的收集：解剖镜下观察近输卵管漏斗部上部明显潮红此为壶腹部。用眼科镊子撕开膨大的壶腹部即看到包绕受精卵的丘细胞团。1）转移输卵管于含工作液的小玻璃皿中。2）眼科镊子夹持壶腹部，并用另一只眼科镊子撕开膨大的输卵管，游离的受精卵慢慢流出，也可以用镊子轻轻挤压输卵管将受精卵推出裂口。（4）透明质酸酶处理与受精卵的漂洗
工作液中受精卵可能成团状，微注射用的受精卵必须是单个细胞，而且无细胞碎片。漂洗细胞时，首先用工作液除去细胞碎片。不成团细胞可用无菌移液管收集到盛工作液的玻璃小皿中，注意把握移液管的张力。溶解在工作液中的透明质酸酶对细胞团以及复合体进行消化时必须严密观察，一旦细胞团溶解立即将单细胞转移到新鲜工作液中，防止消化过度。用工作液漂洗2-3次，清除碎片后，用无菌移液管将受精卵置于特殊培养基（M16），放于37C, 5% CO2孵箱中待注射，此培养基上层覆盖高压消毒矿物油，可防止污染同时防止培养基水分蒸发影响pH。受精卵在体外发育较体内快，在孵育过程中注意观察一些受精卵清晰可见原核形成，在此期间可先选出原核清晰的卵(形态稍不规则)用于注射，其它卵继续培养。注射后，再筛选，再注射，直至得到满意的注射卵数。4．显微注射（1）导入DNA的制备：显微注射首先涉及导入DNA的制备，显微注射的转入基因通常为去除载体序列的线状DNA，转基因所用载体是真核表达载体，即含有在哺乳动物细胞内表达的真核启动子。所谓组织特异性的实现多是通过组织特异性启动子来实现组织特异性表达的。制备转基因小鼠，必须对待导入DNA进行分离纯化。实验必须用经过琼脂糖电泳鉴定并确定其纯度的DNA，对导入基因的大小没有特别的限制，长链DNA也可成功。 实验中注意防止一些杂质堵塞注射针，如琼脂糖颗粒、纤维物质等，需尽量超速离心除去。DNA的注射质量是实验成功的关键。研究表明DNA注射的起始浓度大约在1ng/ml，当DNA注射浓度超过一定上限时，实验效果不佳，而且大于5 ng/ml会产生明显的毒性作用。导入DNA的制备程序如下：1）&&通过在Tris/acetate/EDTA缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳从载体中分离待插入DNA，用5mg/ml溴乙啶染色。2）&&为防止对插入DNA的溴乙啶的破坏，用长波紫外光显影。3）&&切下目的基因所在凝胶片，电泳制备目的DNA，或用Qiaex凝胶抽提试剂盒进行抽提。4）&&乙醇沉淀目的DNA。在样品中加入1/10体积的3M乙酸钠，混匀，再加入2-2.5倍体积无菌100%乙醇进行沉淀。5）&&-200C 孵育过夜后，超速离心机10000转/分，离心5分，收集沉淀，重悬沉淀于Elutip缓冲液。6）&&用Elutip-D微型柱对目的DNA过柱处理。7）&&按照步骤4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗与干燥过程极其重要，因为残余的盐和乙醇对受精卵的发育是致命的。8）&&注射缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重悬沉淀，缓冲液必须是Milli-Q纯化水配制9）&&通过荧光光度计或凝胶电泳比色法评估目的DNA的浓度10）&&用注射缓冲液调整目的DNA的浓度在5-10ng/l.（2） 器械准备[注射针的制作] 注射针是内含玻璃细丝的薄壁毛细吸管，它可以通过毛细管虹吸作用进行载样。用拉针仪（SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具体操作程序详见产品说明书）可以把注射针水平或垂直扯下来。必须保证制备的毛细管可以进入拉针仪这样加热组件大约在毛细管的中央位置。一般用内径为1.0mm的微电极管为材料制作注射针,微电极管可以买到,它与拉针仪是匹配的。另外，应该对拉针仪的设置进行选择，使细丝温度和扯拉力度(主拉力和次拉力)将处于最佳状态。具体需要预实验来确定其最佳设置。待用注射针应该用蒸馏水严格清洗以除去残留炭化物颗粒。严格的实验微电极管在使用前应经过泡酸、泡蒸馏水和硅化的程序,但有人省略了此步也有较好的结果,经拉针仪拉针后就没法清洗,好的拉针仪是不会残留炭化物颗粒,若拉成后清洗其针尖很容易断掉,可用Narishige Japan model PN-30。[持卵管制作]为避免机械损伤，持卵管口应该是钝性末端而且其孔隙有限，使受精卵轻轻依附在负压管道中。这种高度密实可抵抗密封系统的破损，而密封可以减少受精卵注射时的旋转运动。持卵管的口部应该光滑，平整及与其长轴垂直。具体制备操作：双手执毛细玻璃管的两端，将管的中部置酒精灯外焰烧红至变软后离开火焰，同时双手外伸，将烧软的部分拉细。用玻璃刀或细沙轮小心将细管切开，在镜下观察切口应平齐(如不平齐，应重新切割)。然后于酒精灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理(即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧，然后于显微镜下检查管口形状，如此反复，直至满意)。如实验室配有持卵管制作仪，则可在显微镜下直接监视热灯丝对持卵管管口灼烧后的形状，及时调整二者之间的相对位置，更易得到满意的持卵管。持卵管应该做调整，用熔断仪将其打弯使其末端成15度(不同的显微注射仪度数可能有差异,打弯成25度左右,一般为20-25度)轻微弯曲以方便使用。此持卵管为不含细丝的玻璃，显微镜下用含刻度目镜确定持卵管的外径应该为100-140m。持卵管的内径很重要,可用铂金灯丝灼烧管口,使其内径为30-50m左右,内径要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管内。为便于操作，持卵管可进一步调整使其末端轻微弯曲（15度）。[洗卵管制作]1）&&点燃酒精灯，调节火焰到最佳。捏持玻璃毛细吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋转过火。2）&&当吸管开始变软，快速撤离火焰，向外急剧扯拉使吸管变长，形成口径大约200l的吸管。注意制备过程中离开火焰的时间以及扯拉的力度，尽量保证制备吸管的一致性。3）&&为吸管评分，轻柔地折断吸管，辨别其声音是否清脆，或扯拉吸管或只做弯曲直到两根同分数的吸管断裂为止。4）&&解剖镜下(要在熔断仪上)检查吸管，并对其进行调整，确定其口径以及管口光滑平整。[移卵管的制作]
用于转移注射后受精卵到假孕鼠体内的吸管制作过程同上洗卵管。不同的是，这些吸管的口径稍微小一些，大约150m(150-160m)，直径比单受精卵的口径略大一些，将促使卵细胞精细的充满移卵管并转移到输卵管。移卵管在打磨过程中要求管口更光滑平整以减轻插入输卵管时对输卵管的损伤，同时必须注意移卵管头在火焰上时间不可太长，防止融化堵塞。管口要平且要钝化。[凹玻片的准备]必须准备适合承载用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽，也可用培养皿做注射槽，载玻片上的受精卵应该浸润在pH缓冲工作液中，如M2溶液，使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保护。具体凹玻片的准备程序如下：1）&&在超净台内利用手动移液器将M2溶液加入凹玻片窝的基底部形成直径大约0.6cm液面，液滴的液面要水平平整，避免液体的折射效应。吸取胚胎实验用矿物油于M2溶液上，矿物油的量以刚刚达M2溶液最高液面为宜，将凹玻片置于倒置显微镜的载物台上，在低倍镜下调节焦距，使M2溶液液滴的底面清楚为止。2）&&覆盖矿物油的作用：防止液滴脱水以及浓缩；使受精卵处于无菌状态；固定M2溶液液滴。3）&&从孵箱中取出受精卵，用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗涤2-3次，调整实验用量，将其置于凹玻片的M2溶液中，调焦使在低倍镜下清楚地看到受精卵的轮廓，并且保证受精卵有足够空间自由移动，用持卵器将卵汇聚到一起，移卵时注意不要将气泡移入，影响操作视野。[显微注射设备]显微注射仪的基本工作原理是运用立体倒置相差显微镜进行观察监测，显微镜两侧各置一台显微操作仪，一侧接持卵管，另一侧接注射针，可调节持卵管或注射针的空间位置。持卵管通过塑料管连接一个装满矿物油的带微调的注射器，通过调节压力控制卵的运动。注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪。将注射时间与压力固定后，进行注射操作。操作系统有LEICA AS TP基因转殖操作系统（major instruments.co.Ltd）等，具体操作程序按其说明书严格进行。（3）注射针内DNA的装载
把注射针的钝性头浸在盛待注射DNA的管中，溶液通过毛细吸管的虹吸作用进入注射针。注射针的末端应该一直留在DNA溶液中直到注射针末端有小泡形成。这说明DNA溶液装载完毕。仔细检查注射针针头末端，距其几毫米处可见一个小凹液面。最后可将载满DNA溶液的吸管装在持针器或固定在器械环中待用。（4）受精卵的显微注射受精卵的显微注射过程相对简单，制作大量样品过程中，为保证显微注射量的一致性，必须通过大量反复有效的练习才可以成功。1）&&置凹玻片于显微镜下，低倍聚焦。2）&&调节持卵管，注射针与受精卵在同一视野下后，转换到高倍镜（32X）下时位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。3）&&挨近注射针到工作液或油界边缘，稍微进入油界。在注射前，增加注射针的压力可见DNA溶液泡在油内形成囊状，以此确定DNA溶液流存在。4）&&如果未见DNA溶液流，则轻轻摩擦持样器钝缘，渐渐的打开注射器针头。针头重新进入油内确定DNA溶液流的存在。5）&&移动持卵管回到受精卵下部。通过微分驱动水压控制系统使持卵管内产生温和的负压，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必须确保受精卵基底部与凹玻片基底部轻轻接触。注意不宜吸得过紧，否则会使卵变形，甚至会将卵吸人持卵器内。6）&&对持卵管内真空进行缓慢调节，使持卵管内受精卵轻柔地旋转，使卵内原核位于持卵管口的远侧端。7）&&维持持卵管稳定，使注射针的针头紧靠受精卵的透明带，进行调节并使针与原核处于同一平面上。用注射针依次刺破透明带，细胞外膜，前核核膜，进入核膜内，受精卵的透明带易被针尖刺破，前核核膜相当有弹性，应用不同的方法进行尝试突破此结构。操作时避免与核接触损伤核仁。8）&&保持注射针位置固定，轻轻增加压力使DNA溶液流入前核中。注射过程中可能出现的现象如下：①&&注射后原核将膨大到原来的两倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射针。②&&一气泡出现在注射针尖端，透明带可能膨胀，表明受精卵的膜非常艰固，没有被刺破，此时需继续向内进针，直到尖端进入核，同时要小心注射针尖端极易破损。③&&注射针压力较大，看不到任何现象，可能是注射针堵塞，需换针或更换DNA溶液。④&&若见胞质颗粒涌出到卵黄周围空间，说明受精卵破裂。注射过程中，发现卵破裂数目较多，则需更换注射针。一支注射针一般可注射5―10枚卵。9）&&用持卵器移动受精卵到凹玻片凹内相对隔离的位置，以区分注射组与非注射组。重新安装持卵管并进行下一组操作。5．受精卵的输卵管转移（1）受精卵的输卵管注射1）将麻醉小鼠放置于一塑料平皿盖上，固定小鼠牙齿于皿缘以确保小鼠气道通畅。用70%乙醇涂搽切口部位。也可预先在手术部位剔除毛发。2）将受精卵从培养液转移至工作液内。因受精卵在转移过程中在孵箱外操作，所以应该将其从培养基中移到工作液中。4）&&用移卵管装载受精卵。移卵管的正确装载对输卵管转移的成功非常重要。如图11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些许空气制成一个小气泡。再吸取与气泡体积大约相当的工作液，紧接着在吸取另外一个小气泡。收集受精卵于尽可能小容积的工作液中，将其线形排列于移卵管中。当所有的卵被负载后，再吸取小量气体制成小气泡，接着吸取最终容量的工作液。气泡将有利于对压力进行调节，更容易使卵移动。
受精卵图11-1
移卵管的装载过程5）&&手术暴露输卵管复合体。如图所示，在离中线约0.5厘米、背驼峰与后腿髋关节之间作横行切口。仔细用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛发。捏住一侧切口皮肤，钝性分离皮下组织。移动皮肤直到腹壁神经走行清晰可见。这时可看到腹壁下红色卵巢或浅色卵巢脂肪垫。用眼科镊捏住腹壁，并作约0.5厘米横行切口，钝性分离组织，轻轻移出脂肪垫、卵巢、输卵管以及子宫。用弹簧夹夹住脂肪垫并保持子宫在适当位置。若子宫及子宫角频繁滑回腹腔，在保证气道通畅的前提下，可适当重新布置其位置。6）&&轻轻移动塑料平皿，使小鼠位于解剖显微镜下，适当调节显微镜及小鼠位置使其输卵管卷曲部清晰可见。7）&&用眼科镊于漏斗部透明囊膜处钝性撕开小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部应用肾上腺素以减少出血，并用纱布擦拭保持操作视野干净。8）&&一旦漏斗部清晰可见，用镊子夹持其边缘并充分暴露漏斗管口。在避免壶腹损伤的前提下，尽可能插入移卵管。9）&&在压力可调节的前提下，轻轻把卵吸吹进入漏斗部。气泡可以阻止卵回流而且很容易使卵进入输卵管漏斗管。若吹卵的压力太大，那么移卵管口可能抵在输卵管壁上，这时可稍微后撤移卵管再进行操作，也可能由于血块堵塞移卵管，若这样，则应该吹出细胞在培养皿中，重新吸卵。10）&&移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置将各器官重置于腹腔内。10）缝合切口，用小夹夹持皮肤。常用自动小夹代替缝线，这样可以避免小鼠啃嘶缝线，切口裂开。11）若进行双侧手术，则于另一侧子宫角重复上述操作。12）手术完成后，安置小鼠于清洁的笼中。麻醉状态下，小型哺乳动物无法有效维持机体温度。所以应该注意小鼠的保温。可以用热垫保持其温度直到动物苏醒。所有的动物在回笼前20-30分可苏醒。由于妊娠很容易使受体母鼠产生应激反应导致流产或食子，所以对受体母鼠必须严格监护。（2）注射后期监护：手术后严格监护防止并发症的发生非常重要。麻醉易诱导小鼠出现血压升高，所以手术后必须严密监护至少2小时，同时推荐进行保温处理。
处于麻醉状态的小鼠应该用软纱布包裹，而且笼中加垫草垫以及软材料，并保持鼠笼温度。正常体温的维持可以缩短动物处于麻醉状态的时间。
手术后小鼠常规4-5天观察一次以确保小鼠处于恢复中，清醒小鼠应活动自如。腹腔手术后小鼠有发生肠疝的可能。所以手术时保持切口尽量小，缝合严密，而组织胶水的正确应用可以避免此类并发症的发生。皮肤必须用缝线或不锈刚夹夹闭，手术后1-2周可拔除。如果动物状态不良，表现厌食，脱水，或明显弓背，通过动物饮水可给予羟苯基乙酰胺以及同类止疼药。若发生脱水，可腹腔注射0.9%生理盐水或林格氏液。若仍无改善可在麻醉状态下重新打开手切口确认是否有疝发生。若动物状态无明显好转，最终采用安乐死进行。（四）转基因小鼠的鉴定产出的鼠仔中，属转基因小鼠者，约占全部仔小鼠的20％-30％。因此，对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。1．&&转基因整合检测鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DNA，检测其基因型。检测方法包括PCR和Shouthern 杂交。（1）&&基因组DNA的提取：1）&&将离乳期小鼠（&4周龄）麻醉标记。2）&&用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下约1cm的鼠尾。3）&&将剪下的鼠尾放入500l消化缓冲液中（50mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 100mmol/LEDTA; 100mmol/LNaCl; 1%SDS）, 并加入蛋白酶K使其终浓度为100 g/ml，550C下震荡孵育3~4 小时或过夜孵育。4）&&加入5 l RNA酶A，370C孵育1~2小时。5）&&DNA的分离纯化步骤参见第一章的第三节。 （2）&&PCR检测： 转基因的初始筛选通常采用PCR检测技术。该技术操作简便、快速、费用低而有效，适合大量标本的分析。由于该技术特别敏感，可能产生假阳性结果。因此，在操作过程中必须特别小心，避免质粒DNA或其它标本的基因组DNA的污染。假阳性的产生对转基因小鼠的筛选工作将是致命的。PCR实验应采用双复管，甚至三复管。阳性结果最好用Southern杂交技术进一步证实。
PCR的实验操作参见第一章的第六节。（3）&&Southern blot分析：该技术虽然没有PCR技术那样敏感，且费力费时，但是避免了因污染导致假阳性结果的麻烦，可以得到目的基因整合后的基因组、整合位点数目、转基因拷贝数等的确切信息。Southern blot的实验操作参见第一章的第八节。2．&&转基因表达检测转基因整合检测是确定目的基因是否整合到了小鼠的基因组中，同时可确定整合的位点和拷贝数，这在遗传学上是十分重要的。而转基因表达检测是确定目的基因在转基因小鼠器官组织中表达的时空分布。其检测包括RNA分析技术和蛋白质检测技术。（1）&&RNA的分离：根据实验者的需要从转基因小鼠组织或细胞中提取总RNA或mRNA。分离总RNA比较简单，且适合做基因做基因转录分析。实验操作参见第一章的第四节。（2）&&Northern 印迹分析：该技术用于定性检测转基因动物组织或细胞中转基因转录的相对水平。其实验操作参见第一章的第九节。（3）&&RT-PCR检测：该技术可定量或半定量检测转基因小鼠组织或细胞中转基因特异表达的mRNA，且非常敏感，Northern 印迹未能检测到的转录子，该技术亦可检测到，甚至可测出1000个细胞中的一个拷贝的转录子。其实验操作参见第三章第一、二节。（4）&&Western 印迹分析：该技术通常用于转基因小鼠组织或细胞中转基因编码蛋白的表达水平。其实验操作参见第一章第十节。（5）&&免疫组织化学分析：该法可检测转基因编码蛋白表达在转基因小鼠中的组织分布。有多种实验方法，可参看相关的免疫学检测技术书籍。附录：特殊实验溶液的配制1. M16溶液：称取 0.5534 g NaCl，0.0356 g KCl，0.0162 g KH2PO4，0.0294 g MgSO4&#O，
0.0252 g CaCl2&#O，0.32 ml乳酸钠(60% 糖浆)，0.0036 g丙酮酸钠, 0.1000 g D-葡萄糖，0.0010 g酚红，0.2106 g NaHCO3。溶于100ml超纯水，0.22m滤膜过滤除菌，分装后40C储存不超过3周，加入4 mg/mL BSA可立即使用。2. M2 溶液：称取0.5534 g NaCl, 0.0356 g KCl, 0.0162 g KH2PO4, 0.0294 g MgSO4&#O,0.0252 g CaCl2&#O,0.32 ml 乳酸钠(60% 糖浆), 0.0036 g丙酮酸钠, 0.1000 g D-葡萄糖,0.0010g酚红 0.0337g NaHCO3, 0.5000g HEPES。定容于100ml超纯水，0.22m 滤膜过滤除菌，分装后40C储存不超过3周。M2用于孵箱外卵的操作，用HEPES调节pH,加入4 mg/m BSA可立即使用。3.工作液：无丙酮酸钠的高糖（4500 mg/mL）DMEM。具体配制见说明书4.注射缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, 调节pH 为7.5.名称：大鼠阴道混合感染的模型建立标准操作规程(SOP)关键词：大鼠;感染模型目的：建立大鼠阴道混合感染模型方法
将大鼠双侧卵巢和子宫角在无菌条件下切除后，皮下注射雌二醇建立假动情期。处于假动情期的大鼠，经阴道先后注入白色念珠菌［（2～3）×108/ml］、阴道滴虫［（2～2.5）×108/ml］和大肠埃希氏菌（21×108/ml），白色念珠菌和阴道滴虫注入量为0.04ml/100g体重，大肠埃希氏菌注入量为0.03ml/100g体重。感染5d后取大鼠阴道分泌物病原体检查为阳性，且肉眼和病理组织学检查阴道粘膜均发生充血、水肿、出血或浸润者为感染成功。将感染成功的大鼠随机分组治疗。
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