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家兔大椎穴注射扑热息痛的药动学研究
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你可能喜欢结核融合蛋白疫苗FdxA-Hrp1的构建及对家兔肺部卡介苗潜伏感染模型的治疗作用研究--《兰州大学》2014年硕士论文
结核融合蛋白疫苗FdxA-Hrp1的构建及对家兔肺部卡介苗潜伏感染模型的治疗作用研究
【摘要】：目的：全世界有三分之一的人群感染了结核分枝杆菌,其中有90%的人群处于潜伏感染状态,5%～10%的潜伏感染者未来会发展成为活动性结核,潜伏期的结核分枝杆菌的再活化与复发成为近年来结核病暴发的重要组成,而当前广泛使用的结核疫苗BCG不能杀死处于潜伏期的结核分枝杆菌,无法有效地预防潜伏状态结核分枝杆菌的活化。本研究的主要目的有：(1)筛选结核分枝杆菌在潜伏状态下高表达的抗原。(2)以结核潜伏期抗原为基础构建针对潜伏期结核分枝杆菌的融合蛋白亚单位疫苗。(3)建立易于操作的、安全的、与肺结核的发病机制相似的家兔肺部卡介苗(BCG)潜伏感染模型。(4)利用家兔肺部卡介苗潜伏感染模型评价多个结核亚单位疫苗的治疗作用。该研究对于探讨如何构建潜伏性结核的治疗性疫苗有重要的参考价值。
方法：(1)通过文献资料的搜集、整理与分析,找到结核分枝杆菌在不同潜伏模型(不可培养模型、休眠调控子模型、巨噬细胞模型、不可复制模型、生长曲线改变模型、营养缺陷模型和人造肉芽肿模型)中高表达的基因258个,经过筛选得到有较强免疫原性的在多个结核潜伏模型中都有高表达的抗原基因,包括Rv2031c (HspX), Rv2626c (Hrp1), Rv2007c (FdxA), Rv1738和Rv1733c。(2)根据GeneBank数据库中的各个基因的信息,设计特异性引物,以结核分枝杆菌H37Ra菌株的全基因组DNA为模板,PCR扩增出FdxA和Hrpl两个目的基因,将目的基因逐个依次连接在载体质粒pET30a上,构建重组质粒pET30a-FdxA-Hrp1,将该重组质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21中大量表达融合蛋白FdxA-Hrp1(F6)。用镍离子金属鳌合(Ni-NTA)亲和层析的方法纯化带有His标签的融合蛋白F6。(3)用牛分枝杆菌减毒株卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌无毒株H37Ra菌株通过气管感染家兔肺部,感染后第十二周肌肉注射地塞米松降低家兔的免疫力,用量是0.5mg/kg,每天一次。连续干预5周后使用深度麻醉的方法使家兔安乐死,解剖家兔,进行肺部结核菌落计数及肺部组织病理切片观察与分析,根据两种分枝杆菌在地塞米松干预后的暴发情况选择合适的建模菌株。我们发现BCG做为感染菌株建立家兔肺部潜伏感染模型,在免疫抑制干预后可以有大量的BCG复活,并有特征性病理改变,故采用BCG建立家兔肺部潜伏感染模型。(4)利用建立的家兔肺部卡介苗潜伏感染模型评价融合蛋白疫苗的治疗作用,使用的融合蛋白疫苗包括：重组了结核潜伏期抗原基因Rv2031c、Rv1738、Rv1733c的融合蛋白HspX-Rv1738-Rv1733c (H83)重组了结核潜伏期抗原基因Rv2007c、Rv2626c的融合蛋白疫苗FdxA-Hrp1(F6),和重组了结核生长期抗原基因ESAT6、Ag85B、Mtb8.4的融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT-Mtb8.4(EAMM),我们实验室已经证实EAMM对感染结核菌的小鼠具有较强免疫保护力。家兔肺部感染结核菌后应用随机数字表对实验家兔进行完全随机分组：BCG+生理盐水(BCG组),BCG+佐剂(佐剂组)；BCG+(F6+H83)(F6+H83组)；BCG+EAMM (EAMM组)；BCG+EAMM+(F6+H83)(EAMM+F6+H83组),共计五组。疫苗组家兔分别于第5周、第7周、第9周在家兔左前臂用皮下注射的方法进行疫苗治疗干预,生理盐水组和佐剂组家兔在左前臂皮下注射生理盐水和佐剂做对照。五组家兔从第11周开始连续通过肌肉注射地塞米松的方法免疫干预35天。第16周运用深度麻醉的方法使家兔安乐死,进行脏器分离与解剖,主要分离出家兔的胸腺、脾脏和肺脏,对各组家兔的肺部组织进行苏木精伊红染色及抗酸染色观察并进行病理学分析,同时进行结核结节计数及肺脏BCG菌落计数。
1.通过抗原筛选我们得到了5个潜伏期结核高表达的抗原基因Rv2031c、 Rv2626c、Rv2007c、Rvl738和Rv1733c。
2.以潜伏期结核抗原FdxA和Rv2626c为基础构建的融合蛋白F6在大肠杆菌中可溶性稳定表达,并且可以运用镍离子层析柱得到较高纯度的蛋白。
3.成功建立了家兔肺部卡介苗潜伏感染模型,通过气管感染途径使家兔肺脏感染卡介苗BCG,4周后从家兔肺部组织中培养不出分枝杆菌,但经过地塞米松的免疫抑制剂干预后引起分枝杆菌的大量暴发,可以从肺脏中培养出大量的分枝杆菌。
4.利用建立的家兔肺部卡介苗潜伏感染模型,对融合蛋白疫苗的治疗效果进行评价,发现疫苗组家兔肺部载菌量(EAMM组7.9×103；F6+H83组3.2×103；EAMM+F6+H83组1.6×103)均明显低于对照组(BCG组1.2×105；佐剂组5.7×104),p值均小于0.05, p(EAMM vs BCG)=0.0015,p(F6+H83vs BCG=0.0015, p(EAMM+F6+H83vs BCG)=0.0001, p(EAMM vs佐剂)=0.0368,p(F6+H83vs佐剂)=0.00326,p(EAMM+F6+H83vs佐剂)=0.0001；EAMM+F6+H83组家兔肺部载菌量明显低于EAMM组或F6+H83组,p(EAMM+F6+H83vs EAMM)=0.00003, p(EAMM+F6+H83vs F6+H83)=0.0216,而F6+H83联合疫苗组家兔肺部载菌量明显低于EAMM组,p(F6+H83vs EAMM)=0.0209。
1.家兔肺部卡介苗潜伏感染模型可以用于融合蛋白疫苗的结核治疗作用初步评价；家兔肺部BCG潜伏感染模型提供了一个简单易行并且安全有效的结核治疗效果评价模型,为今后结核疫苗、抗结核药物及相关的免疫调节剂的结核治疗作用研究打下基础。
2.新构建的结核融合蛋白疫苗(F6+H83)对于潜伏状态的BCG有一定的清除能力。
3.以结核菌潜伏状态下高表达的抗原为基础构建的疫苗(F6+H83)和以结核菌生长状态下高表达的抗原为基础构建的疫苗(EAMM)联合使用可以明显降低家兔肺部潜伏存在的BCG。
【关键词】：
【学位授予单位】：兰州大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：R392【目录】：
中文摘要3-6Abstract6-12缩略词对照表12-13前言13-20 1. 结核病简介13 2. 结核杆菌潜伏的相关机制13-14 3. 结核病研究的动物模型14 4. 结核病治疗性疫苗的研究及现状14-15 5. 结核分枝杆菌潜伏相关模型的研究及抗原筛选15-20实验一、构建结核融合蛋白疫苗FdxA-Hrp1(F6)20-37 1.1 主要材料20 1.2 主要仪器设备20 1.3 实验方法20-27
1.3.1 抗原筛选20-21
1.3.2 融合蛋白FdxA-Hrp1(F6)的构建21-24
1.3.3 SDS-PAGE蛋白电泳24-25
1.3.4 融合蛋白FdxA-Hrp1(F6)的表达25-26
1.3.5 融合蛋白FdxA-Hrp1(F6)的纯化26-27
1.3.6 Lowry法测定蛋白FdxA-Hrp1(F6)的浓度27 1.4 实验结果27-36
1.4.1 抗原筛选27-28
1.4.2 重组质粒的构建及鉴定28-33
1.4.3 融合蛋白FdxA-Hrp1(F6)表达33-34
1.4.4 融合蛋白FdxA-Hrp1(F6)纯化34-35
1.4.5 融合蛋白FdxA-Hrp1(F6)的浓度检测35-36 1.5 实验小结36-37实验二、建立家兔肺部卡介苗潜伏感染模型37-48 2.1 主要材料37 2.2 主要仪器设备37 2.3 实验方法37-42
2.3.1 利用罗氏培养基进行BCG培养及计数37-38
2.3.2 苏木素伊红染色及抗酸染色38-39
2.3.3 家兔解剖实验流程39-41
2.3.4 肺部菌落计数41-42 2.4 实验结果42-47
2.4.1 结核菌株的选择42-44
2.4.2 地塞米松干预时间的确定44-47 2.5 实验小结47-48实验三、利用家兔肺部卡介苗潜伏感染模型评价蛋白疫苗的治疗作用48-56 3.1 主要材料48 3.2 主要仪器设备48 3.3 实验方法48-50
3.3.1 疫苗与佐剂混合方法48-49
3.3.2 实验流程49
3.3.3 实验分组49
3.3.4 统计学方法分析49-50 3.4 实验结果50-55
3.4.1 家兔整体状态观察50
3.4.2 CFU计数结果50-51
3.4.3 各脏器指数结果51-53
3.4.5 家兔肺部组织病理切片分析53-55 3.5 实验小结55-56讨论56-59 1. 潜伏期抗原与生长期抗原联合作用可以提高疫苗的治疗作用56 2. 潜伏感染的定义与BCG潜伏感染模型的建立56-57 3. 结核潜伏感染模型上评价治疗性疫苗治疗作用的研究意义57-59结论59-60参考文献60-63在学期间研究成果与参与课题63-64致谢64
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京公网安备74号第十二节　中医中药研究中实验动物的选择与应用(中医|动物模型|实验动物)
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[第十二节　中医中药研究中实验动物的选择与应用(中医|动物模型|实验动物)]《实验动物科学》 > 第十章　生物医学重点研究课题中的实验动物选择与应用第十二节　中医中药研究中实验动物的选择与应用一、中医药研究中开展动物实验的意义
中国医药学自从有文字记载以来的几千年悠久历史中，总结了劳动人民长期和疾病作斗争的丰富经验。它对中华民族的繁衍昌盛有很大贡献，对世界医…… [关键词:中医 动物模型 实验动物 大黄 医学 药物 小鼠]…
《实验动物科学》 > 第十章　医学重点研究课题中的实验动物选择与应用第十二节　中医中药研究中实验动物的选择与应用
一、中医药研究中开展动物实验的意义
中国医药学自从有文字记载以来的几千年悠久历史中，总结了劳动人民长期和疾病作斗争的丰富经验。它对中华民族的繁衍昌盛有很大贡献，对世界医学的发展也有很大的影响。科学研究最贵有创造性，有特点。在发展中、西医学的同时，用唯物辩证法指导中西医结合，对于促进我国医学科学发展、赶超世界先进水平具有重要意义。在唯物辩证法指导下用现代科学知识和方法整理研究世界各国各民族传统医学并与现代医学的精华相结合，创立新的世界医学，是实现世界医学史中从朴素辩证唯物论和形而上学影响下的旧医学飞跃为唯物辩证法指导下的新医学的正确道路。医学科学研究中我们强调中西医结合方向决不是要闭关自守或夜郎自大。相反，我们对西医（更不用说其他现代自然科学）的一切长处都应该认真学习研究，要有分析地研究应用西医的一切新成就，引起可能引进、应该引起的新技术，注射西医和一切现代科学研究的新动向、新思路，以便洋为中用，启发思想，广开思路。另外，中国医药学这个宝库必须用现代科学知识和方法（包括各自然科学和现代西医中合乎科学的知识和方法）加以发掘、整理和提高。从中医发展史看，中医学几千年来的研究途径几乎全是通过临床观察方法以认识疾病的发生、发展、变化规律及总结有效的防治措施。医学发展的历史证明：局限于临床观察方法是中医学发展缓慢的原因之一。动物实验是现代医学的常用方法和手段，中医药学利用动物实验方法，在一定范围内可以提示更为具体的中医理论本质，有利于中医学科学达到一个新的认识水平。随着现代医学的迅猛发展，中医将动物实验手段从现代医学中移植过来，近几十年才逐渐发扬光大，将动物实验方法渗入到了中医生理、病理、方药、针灸、防治等研究领域，通过动物实验，提示了一些中医理论实质，为中医理论提供了一些实验科学依据，使动物实验方法在中医学研究中出现了新的苗头，表现了强大的生命力。总结近几十年中医动物实验研究概况，五六十年代多是通过动物实验研究针刺对疾病的防治作用；70年代多是通过动物实验进行中药药理研究；80年代则有通过动物实验，利用中医治疗手段对西药实验性病变进行防治。中医药研究中开展动物实验的好处有如下几方面：（一）可以替代人体，预测中药毒副作古今中外有关中药毒副作用的记载并不少见，如：《淮南子·修务训》记载：“神农尝百草之滋味，水泉之甘苦，全民知所避就，当此之时，一日而遇七十毒”《备急千金要方》记载：“水银中毒发生口舌糜烂”近年来报导：误服大青龙汤致死；误服大承气汤致死。《日本医药品副作用文献抄录》报告：葛根汤、十味败毒散、八味地黄丸、柴胡加龙骨牡蛎汤、半夏泻心汤等36种方剂有副作用。还报导苍耳子中毒致死、乌头中毒致死等等。究竟有毒副作用的药物安全量是多大？中毒致死量是多少？服用后会出现哪些不良反应？哪些药物在什么情况下有毒副作用？以及发生毒副反应后如何救治？这些方面至今多还缺乏比较精确的认识。要解决这些问题，不可能也不允许在人体身上直接进行试验，因为医学的宗旨是为人类防病治病、增进健康的，所以最好的方法就是进行动物实验。（二）可以严格控制实验条件，较可靠地证实治疗效果人类疾病的转归除药物治疗外还受着多种因素的影响，如：气候环境、精神情绪、饮食劳逸等，这些因素在一定条件下会造成疾病好转或恶化。临床上还可见到由于患者产生强烈的治愈要求，对接受治疗产生良好的疗效愿望，心理上产生一种有效偏因，从而出现治疗有效的反应，即所谓的“假阳性”现象；反之，临床上也常见到患者在治疗中因饮食起居不慎或受到精神刺激等因素的影响，从而造成疾病恶化。这些情况都会造成医生在治疗疾病中产生错误的疗效判断。之所以有些个案报道或新方疗效报道的疗效结果在临床上重复使用时出现与原报道结果不符的现象；其原因之一就与其它因素影响有关。所以要比较可靠地评论药物在治疗效果就需要在严格控制各种影响因素的条件下进行，但是由于人类的高度复杂性，在多数情况下很难严格控制，而对于动物来说就比较容易严格控制。（三）可以验证和发展中医理论，为中医理论提供实验科学依据中医学产生于自然哲学时期，是在长期的医疗实践经验积累的基础上，以整体综合观察方法，在不干扰原有生理病理的情况下逐渐形成和发展起来的高度概括的医学理论。在其形成和发展过程中由于缺乏科学实验和其它科学手段，造成中医理论难以深入地提示更为具体的规律，出现一些笼统、抽象、模糊的概念，使丰富的实践经验与笼统、抽象、模糊的理论结合起来。动物实验可以使人的认识深入到直接观察难以达到的物质内部更深的层次，提示一些更为具体、更为确切的规律，尤其是当需从组织形成学角度来观察时，就更需要借助动物实验。通过动物实验不仅可以为验证中医理论提供科学的实验依据，而且可以进一步发展中医理论提供科学的实验依据。如：王氏为阐明“肺主通周水道”的理论，通过人工扩肺以增强免疫肺通气量观察对兔排出尿量的影响，发现当扩肺后2分钟左右每只动物尿量开始减少，伴随扩肺时间的延长，尿量减少越明显，停止扩肺后，尿量逐渐恢复到扩肺前水平。莫氏等在中医“肾开窍于耳”的理论基础上，用电作为内耳功能指标，证实了醛固酮对内耳功能有促进作用，由此提出把醛固酮作为联系中医肾与耳之间的物质基础的设想。辽宁中医学院等人通过对脾虚动物模型(Animal Models)葡萄糖转运电位（PD）的观察分析，发现脾虚时PD明显地受到抑制，而四君子汤则有促进PD恢复的作用。日本的久保道德为说明桂枝汤具有发汗作用，他在小鼠血中注入炭，小鼠皮色变黑，病理切片有大量炭附着于皮肤肌肉下层组织的血管壁内，灌服桂枝汤为主方剂后，异物消除。（四）可以缩短研究周期，加快中医发展中医学的发展历史告诉我们：有此问题单凭临床经验积累需要花费很长时间才能得到解决，或者虽花费很长时间，问题仍得不到解决，而通过动物实验有些问题就可以得到迅速解决。如中药十八反中几对相反药，历来有人主张必须恪守，有人则认为不必绝对化，更有人认为合用显著的治疗效果，多少年来一直没有充分的依据来说明这一问题，有人通过动物实验仅在几个月内不仅证明了相反药配伍后毒性远比单味药高，而且证明了两种药物用量不同产生的毒性大小也不一样。
二、中医证型动物模型(Animal Models)复制方法及动物选择
中医证型的动物模型(Animal Models)大约有“阳虚”、“阴虚”、“脾虚”、“脉微欲绝”、“血虚”、“血瘀”、“肝郁”、“寒证”、“热证”、“温病”及“里实”等11种。其造型的思路和方法除个别者外，均是选择一些造成与临床证型相仿的致病因素，作用于动物机体使其产生类似临床某些证的模型，而致病因素不外乎物理、化学、生物以及某些内脏损伤或切除等。如①用生大黄、番泻叶、玄明粉造成脾虚运化失常模型；②用阿托品（胆碱能M型受体阻断剂）、利血平（耗竭儿茶酚胺类递质）造成植物神经功能失调拟脾虚、阳虚、阴虚模型；③根据中医饥饱无度、损伤脾胃的理论，用甘兰加猪脂使饮食失节造成脾虚生化乏源模型；④以大剂量醋酸氢化可的松使动物产生一系列耗竭现象，达到虚损状态比拟阳虚模型；⑤以适量的大肠杆菌(Escherichia coli)静脉注射，复制急性和暴发性大肠杆菌(Escherichia coli)败血症比拟温病模型；⑥依中医“正邪相争”理论为指导，用给动物注入强毒细菌以“助邪”及结扎血管阻断血运降低机体抗病力以“伤正”的办法，造成动物“里实”模型；另外，还开展了采用多种病因造型方法的尝试，其造型所用动物主要还是小动物（大、小白鼠），也有用金黄地鼠、家兔和猫的。给药（或作用）途径除胃饲外，是肌肉、皮下、腹腔及耳缘静脉注射。中医证型动物模型(Animal Models)造型方法。1．“卫气营血”模型（熊启达等：四川医学杂志，（2）：65，1982）：选用家兔，体重2.1～2.75kg。用强毒力的大肠杆菌(Escherichia coli)以0.75ml（每ml含大肠杆菌(Escherichia coli)27亿个）/kg体重，注射至兔耳缘静脉造型。感染后动物表现蜷缩、懒动、少食、体温升高、心率增快、耳血管周围渗血、出血；舌象有明显病理改变；血培养有大肠杆菌(Escherichia coli)生长，白细胞及血小板显著减少。可100%造型成功，适用于开展实验性温病研究。2．“寒证、热证”模型（梁月华等：在医杂志，（11），1982．）：选用雌性大白鼠，体重170～210g。热证型：用温热药（附子、干姜、肉桂、党参、黄芪、白术）制成100%水煎剂灌胃，每次2ml，每日2次。寒证型：首先于腹腔内注射三联疫苗(vaccine)1ml，每日1次共2次；然后给予寒冷药（胆草、黄连、黄柏、银花、连翘、石膏）制成的100%水煎剂灌胃，每次2ml，日2次。给药后15天60-70%造型成功。热证型：心率加快，饮水量增多，尿内儿茶酚胺及17-羧皮质类固醇排出量增多。寒证型：心率减慢，尿内儿茶酚胺及17-羧皮质类固醇排出量减少。用此模型可测量痛阈和惊厥阈值及脑内介质；观察动情周期及血内孕酮含量。3．“血瘀”模型：高粘滞血症模型（阮景绰等）：选用家兔，耳缘静脉注入10%葡聚糖生理盐水，每公斤体重注入5ml，可100%造型成功。给药后可见微循环血液变慢，红细胞聚集，全血及血浆粘度增加，血沉快，红细胞电泳变慢。此模型适用于“活血化瘀”药物作用原理的研究。“血瘀”模型（毛腾敏：北医学报，（4）：305，1981。）：选用大白鼠，皮下注射0.1%肾上腺素0.2ml/次，日2次，加冰水刺激5分钟处置1日或2日，给药后次日，血粘度明显升高，血中纤维蛋白及红细胞压积亦升高。用此法连续处置2天，隔48小时处死，心肌出现散在性坏死灶。心肌病变能模拟克山病心肌坏死，此模型已用于大剂量维生素C治疗克山病机制的研究。“血瘀”模型（金惠铭等：中华医学杂志，（1）：50，1982.）；选用家兔，耳缘静脉快速注射10%高分子右旋糖酐（HMWD）生理盐水溶液，剂量为1.5g/kg。注药后30分钟即可从微循环活体观察到血流明显减慢，血细胞严重聚集、微血管周围明显渗出和出血管微循环障碍表现。12～24小时后微循环障碍达高峰。此模型主要用于研究微循环障碍、中医血瘀及探讨活血化瘀药物作用原理。第二军医大学亦用此法制造“”血瘀模型，选用未孕家兔，雌雄不构，体重2～2.5kg，10%HMWD静脉注射，每次15ml/kg，每周2次，历时10周。4．“血虚”模型（贲长恩等：中医杂志（6）：69，1981.）：选用雄性大白鼠，体重180-250g。于实验第1、4、7天皮下注射2%乙酰基苯肼（Acety-Pheny　hydrazine,APH）生理盐水溶液，以每100g体重计，第1次1ml，第2、3次0.5mll给药后可形成实验性溶血性贫血。红细胞与血红蛋白减少，出现大量海氏（Heine）小体。可维持9～14天。此模型适用于血虚与气虚药物的研究。5．“脾虚”模型（李传英等：淅江中医杂志（8）：355，1982）：选用雄性大白鼠。以大黄、玄明粉、玄明粉水煎剂和大黄、番泻叶的水浸泡液灌胃给药。给药后动物发生泄泻、清瘦、食量下降、精神萎磨不振，毛发欠光泽，基本符合临床脾虚病人症状。另外还有报导选用昆明种雄性小鼠，体重18～20g；25日龄Wistar大鼠，体重70～100克；叙利亚金黄地鼠。用大黄水浸煎剂，小鼠0.5g/ml/日/只，金黄地鼠每日100g体重0.7～1.25g/ml，大鼠用15%大黄粉悬液3～5ml。胃饲法给药，每日1次，大鼠每日二次，给药后第8天90%以上造型成功。6．“肝郁”模型（陈国林）：选用大、小白鼠。小白鼠腹腔注射艾叶注射液0.6ml（含生药0.3g），每日1次，分别于45天及60天处死。大白鼠腹腔注射艾叶注射液2ml(含生药2.0g)每日1次，半月后改为隔日1次，40天处死。艾叶中毒后动物易激怒，好斗，咬人，进食量少，体重增加慢。小白鼠：肝脏有灶性坏死，以60天组较45天组为重。大白鼠：肝细胞肿胀，胞浆疏松出现颗粒，门区有嗜酸细胞浸润，中央静脉充血。7．“阳虚”模型：选雄性小白鼠，体重25～30g。以大剂量醋酸氢化可的松肌肉注射1mg/保，每日1次，约7次，约7次造型成功，适于研究补肾药的作用。也可选用20～28g小鼠，急性组织分别用利血平5、10、20、50、100、200μg/只；亚急性组，给500μg/kg（隔天下午）；均腹腔给药。亚急性组另加更生霉素74μg/kg，共7次，亦腹腔给药，均可100%造型成功，适于“形寒肢冷”证发病机理研究和探讨中药（理中汤）作用机理研究。还可给小鼠每日灌喂甲基氧嘧啶2.5mg/只或5-10mg/日，一周左右即可有95%造型成功，适用于观察受体与甲状腺素减少之间关系。8．“阴虚”模型：选用雄性小鼠，体重20-30g，甲状腺素片3mg/只/月，利血平0.02mg/只/日共研成粉末，以生理盐水稀释，充分摇匀后灌胃给药。8～10天造型成功，适用于研究滋阴中药作用原理。9．“阴证”与“阳证”模型（董筠一等：陕西中医学院学报，（3）：1，1981）：选用雄性小白鼠，体重20～30g。利血平10μg（溶于0.1ml盐水）/只/日肌注，4～5天后出现类似阴证症候；阿托品15～20μg/只/日肌注，，2天后出现类似阴证症候。适于观察机体各器官系统的机能改变，细胞水平的变化以及中药或针刺对上述变化的改善情况。10．“脉微欲绝”模型（左箴等：第二军医大学学报（1）：19，1982）：选用猫，经股静脉注入3%戊巴比妥钠溶液，按0.25～0.5ml/kg剂量造型。注药后心肌收缩力极度减弱，近于停跳状态，血压降至10mmHg左右，动物股动脉搏动微弱，几乎不能触及，可100%造型成功，适于观察强心升压药物，如附子制剂及其分离物的急性效应。11．“气虚”模型（上海第二医学院：上海中医药杂志（5）：8，1964）：选用家兔，体重1.07～2.5kg，通过人工慢性贫血造型。每日由耳动脉、耳静脉或心脏放血10ml左右。动物可出现精神萎顿、嗜睡、四肢蜷缩，肌张力减低、体温较正常稍高。血细胞压积下降，总蛋白略有减低，舌质苍白、胖嫩、湿润。适用于“气虚”舌象研究。12．“阴阳失调”模型（杨连卿等：中西药结合杂志（6）：353，1983）：选用雄性Wistar大鼠，体重235～297g。以外源性糖皮质激素地塞米松混悬液7.5μg/100g体重灌胃，每日下午时藻胃，共7次（7天实验）；另组同法灌胃28次，中途休息2天（30天实验）。经电镜观察，肾上腺皮囊状带细胞线粒体退行性变性变化明显，血浆皮质酮水平低下，示动物HPA（下丘脑一垂体-肾上腺皮质）轴功能受抑。13．“里实”模型（孙爱真等）：选用狗，以中医“邪正相争”理论为指导。“助邪”，选择毒性极强的细菌，经多次复种，增强致病毒力后，注入阑尾肌层；“伤正”：结扎阑尾根部，并阻断血循环以大大削弱机体抗病能力。术后二天内拒食、神萎、倦伏不动；大体标本见阑尾粗大，浆膜面血管扩张、充血、有脓性、纤维素性渗出物，肠管增厚水肿、粘膜见散在坏死及溃疡形成，腔内积有浓性渗出物，镜检：阑尾腔内积有成片脓性渗出物，粘膜坏死、脱落，有肉芽组织增生，各层有不同程度充血、水肿等，WBC、MPT急剧升高。适于研究中医通里攻下治则作用原理以及大承气汤等复方的药理作用。
三、中医证型动物模型(Animal Models)在中国药研究中的应用
国内早在1960年邝氏等就指出皮质素型动物（即醋酸氢化考的松模型、氨考模型或“阳虚”模型）一系列病态与阳虚临床特征基本符合。1963年邝氏等又观察发现，助阳药能减轻或纠正过量皮质素引起的动物耗竭现象，并对助阳药作用机理进行探讨，认为助阳药的作用并非单纯促进蛋白质合成或补充了钾或者替代肾上腺皮质激素，其确切作用机理是否是纠正了机体“阳虚”本质难以肯定尚待探讨。1964年上海第二医学院附属广慈医院舌研究小组，为开展气、阴虚舌象的动物实验研究，以人工慢性贫血及高位小肠侧瘘，造成“气虚”和“阴虚”模型。1977年上海中医学院正常人体学教研组，认为助阳及滋阴药能调节“阳虚”及“阴虚”现象，可反证造型的属性。1980年施氏等首先采用电镜技术观察某些助阳药对“阳虚”模型的肝细胞亚微结构的作用，发现助阳药能调节细胞核DNA复制及RNA、蛋白质合成，改善细胞能量代谢(energy metabolism)；同年，北京师范大学生物系消化生理科研组在国内首先报道用中药大黄水浸煎剂造成“脾虚”模型，并用四君子汤反证。1981年陕西中医学院生理教研室用改变植物神经系统(Nervous System)机能状态的药物建立类似“阳证”（阿托品）及“阴症”（利血平）模型，并设想临床“阳症”和“阴证”的产生与交感、副交感神经系统(Nervous System)机能的盛、衰有关，同年，贲氏等以皮下注射乙酰苯肼（APH）造成实验性溶血性贫血，拟“血虚”模型；同年，施氏等认为“阳虚”模型，早期以“阴虚”为主，滋阴药有一定作用，后期才以“阳虚”为主，助阳药对之有显著作用，说明中医阴阳贯穿整个疾病过程。1982年施氏等又发现某些助阳药对“阳虚”动物脾脏淋巴细胞有显著保护作用；严氏等对“脾虚”动物的体表冷光、温度及皮肤电阻、体重等多种体表物理信息的研究，发现体表冷光变化幅度最大，其次是体表温度、体重，而体表电阻较差，并认为这些指标有方便、快速无损等优点，是可取的；南京医学院中西结合研究组，开展了脾虚泄泻证的动物模型(Animal Models)研究，认为番泻叶与大黄致泻理作用基本一致，但其用量为大黄的1/10，主张番泻叶可作为复制脾虚泄泻证动物模型(Animal Models)的首选药物；张氏等认为助阳药能提高“阳虚”动物DNA合成率、降低死亡率；史氏等于家兔耳缘静脉注入10%高分子右旋糖酐造成“血瘀”动物模型(Animal Models)，并观察川芎注射液治疗作用；梁氏等用三联疫苗(vaccine)及寒凉药造成寒证，以温热药造成热证模型，观察电刺激效应；夏氏等模拟几种常见的虚证病人，用不同方法同时建立四种（互相对立的两组）病理模型，即甲状腺功能亢进（甲亢组）及减退（甲减组）；糖皮质激素过多（氨考Ⅰ组）及肾上腺皮质抑制（氨考Ⅱ组）等四组。然后用滋阴药（生地、龟板）和助阳药（附子、肉桂）进行反证（即“诊断性治疗”）区分证型。结果，甲亢组和氢考Ⅰ组服用滋阴药有效（用助阳药反恶化），辩证为阴虚为主；甲减组及氨考Ⅱ组服用助阳药有改善（用滋阴药恶化），故属阳虚为主。上述情况与临床所见基本一致。另外，两组模型血浆中环核苷酸含量的变化与临床结果亦一致。本实验在方法学上进行了一些改进，采用了先注射β-肾上腺素激动剂（异丙基肾上腺素）或M-胆碱能激动剂（氨甲酰胆碱）引起血浆中cAMP和cGMP大幅度升高，然后取血测定cAMP、cGMP含量，且观察cAMP、cGMP系统对相应受体激动剂刺激的反应强度。从而，不仅相对提高了测定方法的灵敏度，且比单纯测定血浆中环核苷酸的含量，获得更多的信息。1983年徐氏等观察“阳虚”动物牙周变化及助阳药作用；耿氏等观察了助药对“阳虚”模型免疫功能影响；熊氏等以大肠杆菌(Escherichia coli)注入兔耳缘静脉复制温病卫、气、营血模型；胡、关氏等观察大黄致虚模型的形态及免疫功能变化；黄氏等报道用100%的大黄、甘遂、大戟、芫花煎剂及100%的甘遂合剂（甘遂、芫花、大戟）喂饲小鼠未形成脾虚模型，而采用甘兰加猪脂喂饲小鼠则成功；施氏等观察到右归丸（温肾阳、补精血方剂）对“阳虚”动物肝细胞核亚微结构有保护作用，杨氏等用外源性糖皮质激素地塞米松灌胃造成下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴受抑模型。1984年于氏等建立脾虚荷瘤动物模型(Animal Models)为临床健脾理气法治疗肿瘤获得一定的启示，马氏等观察到补骨脂注射剂能减轻因大剂量醋酸氢化考的松对肝细胞的损伤作用及使受氢考影响而下降的酶反应上升；李氏等以反映上皮细胞葡萄糖转运系统各种性能的葡萄糖转运电位（Transmural　Potential　Difference,PD）为指标，观察脾虚动物离体小肠不同环境下PD受抑，四君子汤有促进恢复的作用；另外，汪氏等还发现小鼠氨考模型的腹膜细胞总数显著减少，中药（附子、肉桂、仙灵脾等）对其有调节保护作用。国外，1971年日本有地滋为了解膈肌、肝脏病变与胸胁苦满证的关系，在家兔身上进行了以下实验：①分别于左膈肌边缘及中央，肝右叶被膜及肝右叶（作45°角）等部位刺入两根粗0.5mm、长4mm的针并留针两周。②皮下注射四氯化碳0.3ml（隔日1次注射4次；继而隔5日1次共注射3次，同时每日胃内注入柴胡浸膏颗粒5g,计10天）。③连日皮下注射苯肼（Phenyl　hydrazin）。④肝左叶注入10%氢氧化钠及肝右注入10%盐酸等。根据2周后检查所见认为，胸胁苦满体征（捏诊皮肤增厚、压痛；观察压痛的方法是：将动物的四肢和颈部固定，捏诊时躯干部跳起）与季肋部浮肿带的病变相同，为同一体征。当肝损伤严重及膈肌边缘部发生病变时均出现胸胁苦满证，而单味柴胡剂有防止出现该证的效应。另外，还观察到膈肌中央部位病变（出现于胸骨柄一带），表现为梅核气，而贫血引起的膈肌、肝脏等部位血流量减少时，不出现胸胁苦满。1984年日本久保道德为研究伤寒论方剂的药理作用而制作中医“证”的动物模型(Animal Models)；以病毒、细菌及致敏物质（异性蛋白和多糖抗原）造成太阳病模型，并用桂枝汤反症；以自身免疫性疾病--大鼠性关节炎当作胸胁苦满证的模型；抗原抗体反应可导致轿小板聚集、血栓形成而诱发瘀血症模型；大鼠性关节炎2个月后注入酪蛋白，再经过2个月后出现阴证，八味丸对其有预防作用。
四、中医药研究中开展动物实验应注射的问题
（一）中医证型动物模型(Animal Models)的制作方法和评价问题中医诊治疾病的核心是辩证施治，所以制作中医证候动物模型(Animal Models)是研究中医的重要手段。目前，称之为中医“证”的动物模型(Animal Models)。一般有两类：一是根据临床某些证候表现，采用相应的手段在动物身上复现，再用临床常用的方剂反证，有效者亦称之为某证型的模型，如“脾虚”型、“阳虚”型等；另是无明确设想，即用某种方法造成病的模型，把西医“病”的模型当成中医某种证的模型，如，将溶血性贫血称之为“血虚”模型或以高粘滞血症作为“血瘀”模型等，前者比起后者较有思路、设想，具有一定的中医特色，当然严格说来也不能排除急性药物中毒所造成的病理状态。近二十多年来制作成中医证候的动物模型(Animal Models)约有十几种，制作方法包括病因模型和症状模拟。病因模拟如饥饿引起脾虚、风寒湿引起痹证等。这种方法所复制的中医证候动物模型(Animal Models)，从形式上看很有中医代表性，但是中医对于病因造成证候发生这一过程的认识还很笼统，其中尚有一部分还没有从个性中找出共性，甚至从偶然性中找出必然性，再者所认识到的同一致病因素又会造成多种证候发生，而不同的致病因素也会造成同一证候发生；而且还有相当一部分致病因素又难以作用于动物等；症状模拟如用大剂量醋酸氢化可的松复制阳虚模型，出现体重减轻、拱背少动、反应迟钝、体毛不荣等。这方法存在的问题在于中医证候不仅是几个症状相加，而是对病因、病性、邪正盛衰等情况的概括。复制祖国医学“证”的动物模型(Animal Models)难度较大，因为中医的证是疾病的病因、病位及病邪性质的概括，且临床多以病人主观感觉反映出来，确切的客观指标尚在探索之中，即使客观表现如舌象、脉诊及神志等也不易在动物身上模拟出来。所以，多数学者认为目前只有尽可能从“证”的临床辩证标准来评价中医“证”的动物模型(Animal Models)。（二）判断中医证候模型成功与否问题至今判断中医证候动物模型(Animal Models)的方法有两种：一种是根据病因、症状直接判断；一种是根据常用方剂反证。从直接判断来看，由于低等动物皮毛与人有差别、语言不通脉诊又不适于动物等，这就造成有相当一部分病情资料，按中医传统的望、闻、问、切诊察方法在动物身上难以收集。所以对于复制的中医证候模型成功与否，因病情资料不全而难以给予比较确切的判断。如近年来复制的肝郁模型，动物表现是易激怒、好斗咬人、进食量少、体重增加慢。这一模型按中医传统的辩证方法来衡量，仅从症状来看也难以说就是中医的肝郁证。因为在症状方面还缺少胸胁满闷、善太息、脉弦等辩肝郁证的主要依据；从反正法来看，用临床常用的方剂作用于从病因、症状尚难以直接判断的模型动物，有效者称之为该证型，如用补脾药有效的可能是脾虚证。由于中医辩证施治具有高度的灵活性，而且对于相当一部分证候的治疗用什么方药至今还不完全统一，所以这一方法必须建立在一定的基础之上。（三）利用西药动物模型(Animal Models)问题中医研究中不能无明确设想，如未能以中医理论为依据，单纯把西医疾病模型当成中医证的模型，用此研究中药药理尚可，但要作为中医证的模型则不相宜。如中药对动物实验性关节作用的研究、大柴胡汤对动物实验性急腹症作用的研究、Ⅲ号排石汤对实验性肾结石作用的研究、四逆散对动物实验性休克作用的研究等，都是用西医现成的动物模型(Animal Models)。这种方法对于进一步研究中药疗效和促进中西结合可能有一定的参考意义，但是对于发扬中医特色来说则无多大参考价值。因为中医诊治疾病有其独特的方法，理法方药有其一套理论体系，中西医之间无论理论上还是在临床上都有着相当大的差别。临床上经常可以看到同一种西药疾病，中医可能诊断为多种证候，用不同的方法来治疗；而对不同的西医疾病，中医也可能诊治方法完全相同。所以要研究中医、发展中医，在进行动物实验时，不能完全照搬西医动物模型(Animal Models)，否则就弃掉了中医几千年来总结的、至今仍极为宝贵的辩证施治规律。（四）中医动物实验设计问题中医研究中动物实验设计应考虑到人与动物的差异问题。人与动物的生命现象，其基本的生命过程，有一定的共性。这是医学实验中可以应用动物实验的基础，但另一方面，不同种属的动物，在解剖、生理特征、病理特点和对各种因素的反应上，又各有其个性。例如不同种属动物对同一致病因素的易感性不同，甚至对一种动物是致命的物质，对另一种动物可能完全无害。我国古代就已认识到：“人食矾石而死，蚕食之而不饥；鱼食巴菽而死，鼠食之而肥，类不可必推”正因如此动物的疾病模型和人类的对应病证，虽有相似之处，但不一定完全相同。另一方面由于在动物实验中往往仅改变一个条件，而使其他因素保持不变，而人体的许多生理过程是同时受多种因素影响的，显然在比较简单的条件下，得出的结论，可能就不一定完全适用于较复杂的人体情况。根据中医整体观的特点，在中医模型客观化研究中，以体表物理量（如体表冷光、体表温度和电阻以及体重等）为指标，快速、无损的探查方法是可取的，值得进一步探索。采用多种病因、以不同的方法同时建立几种互相对立的模型以及指标测定方法学的改进等，不仅相对提高了测定方法的灵敏度，且获得了较大的可信性，思路和方法学上的这种改进，在中医模型研制中也是一个可喜的苗头。中医“证”的动物模型(Animal Models)主要用于各种证型产生、发展及转归的规律性探讨，并寻找其预防和治疗的理论根据。而中药药理的研究，一般说来，则不必拘泥于此，其现代医学多种病理模型（或制备的标本）均可采用。（五）关于“脾虚”和“阳虚”动物模型(Animal Models)评价问题关于“脾虚”动物模型(Animal Models)：①迄今对脾虚泄泻动物的评价，尚无肯定的意见。从大黄致虚模型来看，致虚物大黄是中医常用的苦寒药，我国医家通过临床大量医疗实践认识到，过量服用苦寒泻下药伤脾胃、耗正气，产生脾胃虚寒；又依中医“虚者补之”的道理，用适量四君子汤等理气健脾方药可使脾虚模型复健。从临床脾虚辩证标准及药物反证作用来看，大黄致虚的动物病理模型符合脾虚证。但也有作者用苦寒泻下法复制脾虚模型未成功；还有人认为，在短期内用过量大黄所致“脾虚”大鼠模型在唾液腺分泌功能方面与临床脾虚病人所见，不完全相符。②依据饮食不节，饥饱无度损伤脾胃的道理，采用甘兰加猪脂喂饲养动物制成腺虚模型，其设计思路较合理，且操作简单，制作容易。③采用饮食蛋白缺乏这样一种单纯因素短期内使动物呈现恶性营养不良状态，与临床脾虚证不尽相同，认为用此种状态代表中医临床的脾虚证似欠相宜。关于“阳虚”动物模型(Animal Models)：自60年代初，国内即有文献报道，应用大剂量外源性糖皮质可导致实验动物耗损，出现一系列虚损症状，类似中医的“阳虚”，此种异常状态可用助阳药经纠正，故称之为“阳虚”模型。目前国内普遍采用这一方法复制“阳虚”模型，并开展了一系列的、多指标的助阳药药理研究工作。关于此种造型的评价，亦持不同见解，国内有人比较不同种类糖皮质（醋酸可的松、醋酸氢化可的松--为混悬剂，局部注射后吸收慢，作用时间长交易造成蓄积；氢化可的松琥珀酸钠、地塞米松--水溶性制剂，注射后吸收快，毒性作用小）对造型的影响，结果认为“氢考”所致的“阳虚”表现，可能是混悬剂长期应用所导致药物的在体内积蓄中毒反应的结果。本造型方法值得商榷，而慢性“阳虚”模型有待研究探讨。
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