焦磷酸测序分析ABCG2基因多态性方法的建立_万子睿01
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焦磷酸测序分析ABCG2基因多态性方法的建立_万子睿01
?７７９?；临床药理学；中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办／ＣＮ３４；焦磷酸测序分析ＡＢＣＧ２基因多态性方法的建立；万子睿１，谢海棠２，俞竞１，刘英姿１，曾飞跃３，；中南大学临床药理研究所，长沙４湖南；皖南医学院弋；芜湖２安徽；中南大学湘雅医院放射科，长沙４湖南４；摘要目的：建立ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和４２１Ｃ＞Ａ；单核苷酸多态性位点的焦磷酸测序方法；验证
?７７９?◇临床药理学◇中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办／ＣＮ３４１２０６Ｒ，ＩＳＳＮ１００９２５０１　－　－／／ｈｔｔｗｗｗ．ｃｃｔ．ｃｏｍｐ：ｊｐ；：２０１２Ｊｕｌ１７（７）７７９－７８４焦磷酸测序分析ＡＢＣＧ２基因多态性方法的建立万子睿１，谢海棠２，俞竞１，刘英姿１，曾飞跃３，王果１１２中南大学临床药理研究所，长沙４湖南；皖南医学院弋矶山医院临床药学部，１００７８，３芜湖２安徽；中南大学湘雅医院放射科，长沙４湖南４１００１，１０００８，摘要　目的：建立ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和４２１Ｃ＞Ａ　单核苷酸多态性位点的焦磷酸测序方法。方法：抽取志愿者静脉血入Ｅ常规苯酚／ＤＴＡ抗凝管，氯仿法制备全血ｇ生物素标记引物对扩增ＤＮＡ，多态位点目的片段，制备生物素标记单链模板，与测序引物退火结合后行焦磷酸测序。分析结果经毛细管电泳测序验证，并进行重复性检验。结果：本文建立了针对ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和４２１Ｃ＞Ａ多　经毛细管电泳测序态性位点的焦磷酸测序方法，验证和重复性验证，结果准确可靠。ＡＢＣＧ２３４Ｇ　和３４Ａ等位基因频率分别为７９．５％和２０．５％；４２１Ｃ和４２１Ａ等位基因频率分别为７２．７％和均符合Ｈ本２７．８％，ａｒｄｅｉｎｂｅｒ－Ｗｙｇ平衡。结论：高通量、快速检文建立的焦磷酸测序方法可准确、测ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和４２１Ｃ＞Ａ单核苷酸多态　性，并且特别适宜大样本量的临床及科研批量检测需要。关键词　药理学；焦磷酸测序；乳腺癌耐ＡＢＣＧ２；药蛋白；单核苷酸多态性中图分类号：Ｒ９６８文献标识码：Ａ２０１２０３３１收稿　２０１２０５２５修回－－－－）；国家自然科学基金项目（高等学校博士学８１０７２７０６，８１１７３１３４）；湖南省科技计划科点专项科研基金资助课题（２００９０１６２１２００２４）；项目（中央高校基本科研业务费（２００９ＪＴ３０２０２０１２ＱＮＺＴ０８５，）２０１２ＱＮＺＴ１３３万子睿，男，硕士研究生，主要研究方向为遗传药理学。：：ｍＴｅｌ１８６８４７０９７５９　Ｅ－ｍａｉｌａｘｉｍ＿ｗ＠１６３．ｃｏｍ，，，，，王果通信作者男博士副教授主要研究方向为遗传药理和临床药理学。：：Ｔｅｌ０７３１８４８０５３８０８４０７　Ｅ－ｍａｉｌｗａｎｕｏ３０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ－－ｇｇ（）文章编号：１００９２５０１２０１２０７０７７９０６－－－ＡＢＣ转运体蛋白超家族（ＡＴＰｂｉｎｄｉｎｃａｓ－－ｇ　，ｓｅｔｔｅｔｒａｎｓｏｒｔｅｒｓｕｅｒｆａｍｉｌＡＢＣｔｒａｎｓｏｒｔｅｒ　　　ｐｐｙｐ）Ｇ亚家族第２个成员ＡｓｕｅｒｆａｍｉｌＢＣＧ２位于ｐｙ人染色体４编码产生乳腺癌耐药蛋白２２～２３，ｑ（，Ｂ。ｂｒｅａｓｔａｎｃｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＣＲＰ）ｒｏｔｅｉｎ　ｃ　ｒ　ｐ广泛分布于ＢＣＲＰ的功能是依赖ＡＴＰ的外排泵，具有分泌和排泄功能的正常组织的细胞浆膜，参与血脑屏障和胎血屏障等，因此在机体的防御机制中发挥重要作用。同时，ＢＣＲＰ在药物的吸收、分布和排泄过程中起着非常重要的作用，肠道细胞表达的ＢＣＲＰ通过将从肠腔进入细胞的药物泵回肠腔来调节药物的吸收。已知的ＢＣＲＰ特异性底物药包括米托蒽醌、蒽环类抗生素等抗肿瘤药物以及羟甲基戊二酰辅酶Ａ（还ＨＭＧ－ＣｏＡ）原酶抑制剂等。编码ＢＣＲＰ的ＡＢＣＧ２存在广泛目前在不同种族人群中发现的单的遗传多态性，，核苷酸多态（ｏｔｍｏｒｈｉｓｍｓｓｉｎｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　　ｇｐｙｐ［］）已经超过５ＳＮＰｓ０种１－４。其中，ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞　和４在亚洲Ａ（ｒｓ２２３１１３７）２１Ｃ＞Ａ（ｒｓ２２３１１４２）人群中最为常见，分布频率显著高于高加索人和美国非洲人。研究表明ＡＢＣＧ２４２１Ｃ＞Ａ多态对　多种ＢＣＲＰ底物药的体内药物代谢动力学过程［５］）都有显著影响，如瑞舒伐他汀（以Ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ及用于治疗非小细胞肺癌（ｎｏｎｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎ－　　ｇ，的小分子靶向药物吉非替尼ｃａｎｃｅｒＮＳＣＬＣ）［］（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）６等。此外，ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和　前列腺癌、弥漫性大Ｂ４２１Ｃ＞Ａ还与肾细胞癌、细胞淋巴瘤（等疾病的发生与预后相ＤＬＢＣＬ）７］。关［?７８０?焦磷酸测序技术（Ｐｒｏｓｅｕｅｎｃｉｎｙｑｇ）是由Ｎｒｅｎ等人于１９８７年发展起来的一种新型的测ｙ该方法适用于对已知短序列的测序分析，序技术，其可重复性和精确性能与ＳａｎｅｒＤＮＡ测序法相　ｇ并能够实时、直观地提供序列信息，以及进媲美，行等位基因定量分析。因为该技术无需电泳分因此其测序速度远远快于传统的毛细管电泳离，测序技术。焦磷酸测序技术具备同时对较大量样品进行测序分析的能力，为ＳＮＰｓ研究和临床基］８－１０。因扩增检验提供了非常理想的技术平台［；（）ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ２０１２Ｊｕｌ１７７作为扩增模板。ｄｄＨ２Ｏ溶解，１．４　单核苷酸多态位点扩增　所有志愿者全血ＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和４２１Ｃ＞ＡＤＮＡ样品均进行Ａ　ｇ多态位点的分型分析。两个位点ＰＣＲ扩增体系相同：５０μＬ体系中含ｇＬＤＮＡ模板１μ（／，５０ｎＬ）１０×ＰＣＲｕｆｆｅｒＬ，ｄＮＴＰ　Ｂ　５μｇμ（／２．５ｍｍｏｌＬａｃｈ）１．５μＬ，正向引物　ｅ（／／１０μｍｏｌＬ）０．５μＬ，反向引物（１０μｍｏｌＬ）／０．５μＬ，ｒＴａ５ＵＬ）０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足ｑ酶（μ至５０μＬ。循环参数为９５℃预变性５ｍｉｎ；９５℃变性，３０ｓ－５３℃复性，３０ｓ－７２℃延，伸，扩增产物保存３０ｓ３５个循环；７２℃，５ｍｉｎ，于４℃。扩增产物通过２％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物片段大小和特异性。１．５　生物素标记单链测序模板制备与焦磷酸测序　生物素标记单链测序模板的制备参照文献方１１］，法进行［简述如下：４５μＬＰＣＲ产物加入等量　ＴＭＢｉｎｄｉｎＢｕｆｆｅｒ和３μＬＳｔｒｅｔａｖｉｄｉｎＳｅｈａｒｏｓｅ　　ｇｐｐ　／多功能振荡混匀器上，Ｂｅａｄｓ后，２０００ｒｍｉｎ震荡本文拟建立快速、高通量检测ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和　４２１Ｃ＞Ａ单核苷酸多态性的焦磷酸测序方法。１　材料与方法１．１　仪器与装备　焦磷酸测序仪（ＰｒｏＭａｒｋｙ和单链ＤＩＤ）ＮＡ样本制备装置（Ｖａｃｕｕｍｒｅ　ｐｐ）购自Ｑ台式高ｉａｅｎ公司，ＰＣＲ仪、ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎｇ）为Ｅ速离心机和多功能振荡混匀器（ＭｉｘＭａｔｅ－ｐｅｎｄｏｆｆ公司产品，ＤＧＧ９０２３Ａ型电热恒温鼓风－ｐ微量移干燥箱购自上海森信实验仪器有限公司，液枪为吉尔森和Ｅｅｎｄｏｆｆ公司产品。ｐｐＴＭ　１．２　试剂　ＰｒｏＭａｒｋＧｏｌｄＱ９６Ｒｅａｅｎｔｓ试　ｙｇ、、剂盒、ＢｉｎｄｉｎＢｕｆｆｅｒＡｎｎｅａｌｉｎＢｕｆｆｅｒＷａｓｈｉｎｇｇｇ　　。经变性和洗涤处理，将结合单链纯孵育１０ｍｉｎ化测序模板的ＳｅｈａｒｏｓｅＢｅａｄｓ释放到Ａｎｎｅａ　－ｐｌｉｎＢｕｆｆｅｒ中。反应板置于８０℃变性，２ｍｉｎ后ｇ　自然冷却至室温。按照Ｐ取出，ｒｏＭａｒｋＩＤ仪器　ｙ操作说明设定各反应孔检测程序（各ＳＮＰ位点的待测序列和软件自动生成的ＤｉｓｅｎｓａｔｉｏｎＯｒｄｅｒ　ｐ），见表２在试剂仓对应试剂孔中添加足量的Ｐ－ｙＴＭ　ｒｏＭａｒｋＧｏｌｄＱ９６Ｒｅａｅｎｔｓ试剂盒所含的酶混　ｇ、）合物（荧光底物（和４种ｄ将反应板放Ｅ）ＳＮＴＰ，ＳＱ９６孔焦磷酸测序反应板均购自Ｂｕｆｆｅｒ和Ｐ　ＴＭ　Ｑｉａｅｎ公司，ＳｔｒｅｔａｖｉｄｉｎＳｅｈａｒｏｓｅＢｅａｄｓ购　ｇｐｐ自Ｇ扩Ｅ公司，ｒＴａａＫａＲａ公司，ｑ酶购自大连Ｔ含生物素标记引物）和测序引物由上海博增引物（尚生物技术有限公司合成（各引物名称及序列见）。其它试剂如无水乙醇、平衡酚、氯仿、表１ＳＤＳ、Ｔｒｉｓ和ＥＤＴＡ等均为国产分析纯试剂。１．３　采血与外周血ｇＤＮＡ制备　２００名无亲缘关系中国健康志愿者，每人采集２ｍＬ静脉血至充分混匀抗凝。外周血ｇＥＤＴＡ抗凝管中，ＤＮＡ采用常规苯酚／氯仿法制备，每样品用３００μＬ表１　引物序列表引物名称ＡＢＣＧ２４２１ｉｏＦ　－Ｂ　ＡＢＣＧ２４２１　－Ｒ　ＡＢＣＧ２４２１Ｓ　－　ＡＢＣＧ２３４　－Ｆ　ＡＢＣＧ２３４ｉｏＲ　－Ｂ　ＡＢＣＧ２３４Ｓ　－　）引物序列（５＇３＇－进行检测。入检测仓，１．６　重复性试验及测序验证　任意选取４８例样本在一周内重复检测３次，观察检出率和检测结果的一致性。在所有检测样本中随机抽取各多态位点不同基因型标本扩增后送测序公司行毛细管电泳测序，验证焦磷酸测序结果的正确性。引物说明５＇－生物素标记正向扩增引物反向扩增引物焦磷酸测序引物正向扩增引物５＇－生物素标记反向扩增引物焦磷酸测序引物ＡＴＧＴＴＧＴＧＡ　ＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＡＣ　　　　　　　ＣＣＡＣＡＴＴＡＣＣＴＴＧＧＡ　ＧＴＣＴＧＣＣ　　　　　　ＧＡＡ　ＧＡＧＣＴＧＣＴＧ　ＡＧＡ　ＡＣＴ　　ＡＴＧ　ＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣ　　　　ＧＴＣＧＣＧＧＧＧ　ＡＡＧＣＣＡ　ＴＴＧ　　　　ＡＴＧＴＣＧ　ＡＡＧＴＴＴＴＴＡ　ＴＣＣ　　　；（）中国临床药理学与治疗学２０１２Ｊｕｌ１７７表２　ＡＢＣＧ２多态位点的核酸序列和ＤｉｓｅｎｓａｔｉｏｎＯｒｄｅｒ　ｐ待测ＳＮＰ位点ＡＢＣＧ２４２１Ｃ＞Ａ　（）ｒｓ２２３１１４２ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ　（）ｒｓ２２３１１３７）待测序列（５＇３＇－／ＧＴＴＡＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＧＴＣ　?７８１?（）ＤｉｓｅｎｓａｔｉｏｎＯｒｄｅｒ５＇３＇　－ｐＣＧＴＣＡＧＴＴＣＴ／ＣＡＡＧＴＧＴＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＡＣＣ　ＧＣＡＧＡＴＧＴＣ２　结果２．１　ＰＣＲ扩增产物的凝胶电泳分析　以志愿者得到的Ａ外周血ｇＣＲ扩增，ＢＤＮＡ为模板行Ｐ－ＣＧ２４２１Ｃ＞Ａ和３４Ｇ＞Ａ多态位点扩增产物大　小分别为１５８ｂ０４ｂｐ和２ｐ。２％琼脂糖凝胶电泳检测Ｐ各多态位点扩ＣＲ扩增产物结果见图１，目的片段大小正确。增产物条带特异，２．２　焦磷酸测序方法建立与重复验证　所有标本均进行了上述两个多态位点的焦磷酸测序，检出率１分型成功率１００％，００％。焦磷酸测序结果见图２，所得结果信噪比高，出峰顺序与待测序列完全相符，多态位点基因型可以清晰判断（因ＡＢ－ＣＧ２４２１Ｃ＞Ａ位点生物素标记在正向扩增引物　上，故为反向焦磷酸测序，结果与多态位点序列互。随机抽取标本的毛细管电泳测序分型结果补）与焦磷酸测序完全相符。４８例标本的３次重复实验结果一致，每次重复的检出率和成功率均为１００％。图１　ＰＣＲ扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图１～３道：ＡＢＣＧ２４２１Ｃ＞Ａ扩增产物；４～６道：ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ　　扩增产物；分别为Ａ７～８道：ＢＣＧ２４２１Ｃ＞Ａ和ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ　　／Ｍ（）阴参；相对分子质量ＭＭ道：ＵＣ１９ＤＮＡｓＩＨａＩＩａｒｋｅｒ　ｐｐｐ　（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司）２．３　ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和４２１Ｃ＞Ａ多态位点频　率　中国健康人群ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和４２１Ｃ＞Ａ　多态位点等位基因及等位基因型频率见表３。ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和４２１Ｃ＞Ａ等位基因型频率均　符合Ｈａｒｄｅｉｎｂｅｒ３４Ｇ＞Ａ，Ｐ＝０．１２；－Ｗｙｇ平衡（）。４２１Ｃ＞Ａ，Ｐ＝０．４０图２　ＡｒｏｓｅｕｅｎｃｉｎＢＣＧ２ＳＮＰ位点ｐｙｑｇ检测结果图、突变杂合子（和突变纯合子（焦磷酸测序结果（反向测序，检测结果：Ａ：ＡＢＣＧ２４２１Ｃ＞Ａ多态性野生纯合子（ＣＣ）ＣＡ）ＡＡ）ＫＴＡ－　、和对应的毛细管电泳测序结果；突变杂合子（和突变纯合子（焦磷ＡＧＴＴＴＴＣＴ）Ｂ：ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ多态性野生纯合子（ＧＧ）ＧＡ）ＡＡ）　酸测序结果（测序结果：和对应的毛细管电泳测序结果ＣＡＲＴＧＴＣ）?７８２?）表３　ＡＢＣＧ２多态位点频率（ｎ＝２００多态位点ＡＢＣＧ２４２１Ｃ＞Ａ　　ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ　　等位基因型频数ＷＷ（％）（）１０２５１．０（）１３０６５．０ＷＭ（％）（）８５４２．５（）５８２９．０；（）ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ２０１２Ｊｕｌ１７７等位基因频数ＭＭ（％）（）１３６．５（）１２６．０Ｗ（％）（）２８９７２．２（）３１８７９．５Ｍ（％）（）１１１２７．８（）８２２０．５３　讨论本文所检测的２００例健康志愿者中，ＡＢＣＧ２３４Ｇ和３４Ａ等位基因频率分别为７９．５％和２０．５％，３４ＧＧ、３４ＧＡ和３４ＡＡ３种等位基因型频　率分别为６５％、２９％和６％；ＡＢＣＧ２４２１Ｃ和　４２１Ａ的等位基因频率分别为７２．７％和２７．８％，４２１ＣＣ、４２１ＣＡ和４２１ＡＡ３种等位基因型频率分　别为５１％、４２．５％和６．５％。我们发现中国健康人群ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和４２１Ｃ＞Ａ多态频率与韩　１２］，国人群比较一致［也与前期报道的中国人群频］１３－１４。率一致［］１８－１９，性［但Ｍｉｚｕａｒａｉ等也揭示ＡＢＣＧ２３４Ａ多态　２０］。导致蛋白膜定位紊乱，并引起转运活性降低［Ｋｏｒｅｎａａ等发现ＡＢＣＧ２４２１ＣＣ基因型在　ｇ肾细胞癌患者中的频率显著高于健康对照，证明６］。Ｈ该等位基因是肾细胞癌的易感因素［ａｈｎ等对前列腺癌患者的生存分析发现ＡＢＣＧ２４２１ＣＣ　基因型患者１５个月生存率远低于４２１Ａ携带２１］。王潇潇等发现Ａ者［ＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和４２１Ｃ　［２］。胡丽莉等发ＬＢＣＬ的预后２＞Ａ单倍型影响Ｄ现携带ＡＢＣＧ２３４ＡＡ基因型的肝细胞肝癌　（，患者总体生存ＨｅａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒＣａｒｃｉｎｏｍａＨＣＣ）　ｐ情况显著差于携带３而４Ｇ野生型等位基因患者；携带ＡＢＣＧ２４２１ＣＣ基因型的ＨＣＣ患者，其死　亡危险度是携带４２１Ａ等位基因患者的２．８５２３］。倍［ＢＣＲＰ底物药的药物代谢动力学存在显著个［５］。体差异，ＡＢＣＧ２的ＳＮＰｓ是重要的影响因素１亚洲人群中最普遍的ＡＢＣＧ２多态性是发生在外显子５上的４碱基Ｃ＞Ａ突变造成１２１位，４１位带正电荷的赖氨酸残基取代了中性的谷氨酰胺（，，该变异造成ＡＧｌｎ→ＬｓＱ１４１Ｋ）ＢＣＧ２表达下ｙ调，并进而引起转运体转运活性降低。Ｕｒｕｈａｒｔｑ１６］等［研究发现ＡＢＣＧ２４２１Ｃ＞Ａ导致吉非替尼　血药浓度升高，可能增加药物毒性反应的风险，导基于焦磷酸测序仪平台，本文建立了ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ和４２１Ｃ＞Ａ多态性检测的焦磷酸测序技术，通过重复性试验和毛细管电泳测序验证，方法确证可靠。目前进行ＳＮＰ分型分析的技术有多种，最常见的包括Ｐ常规毛细管电ＣＲ－ＲＦＬＰ、泳测序、Ｔａｍａｎ探针技术等。焦磷酸测序技术ｑ作为一种第二代Ｄ能通过荧ＮＡ序列分析技术，光信号种类和强度，定性和／或定量检测各种等位基因型，并能实现一次检测９且能做到６个体系，具有非常大的检测灵每个体系的检测位点不同，活性。焦磷酸测序技术与传统的ＰＣＲ－ＲＦＬＰ和具有快速、通量高、毛细管电泳测序等方法相比，方法简便高效、仪器易于操作、敏感性更佳等优点。例如毛细管电泳测序一般的检测下限为但是使用焦磷酸测序可以达到５％甚２５％左右，至更低，因此在进行体细胞突变检测时，焦磷酸测序方法具有无可比拟的优势；此外，相同样本量情况下，毛细管电泳所需耗费的人力和时间均远远与Ｔ大于焦磷酸测序方法；ａｍａｎ探针等技术相ｑ比，焦磷酸测序相对成本低廉，能够实时直观反映且一次反应可以检测相邻的多个Ｓ序列信息，ＮＰ致病人腹泻。Ｋｅｓｋｉｔａｌｏ等证实ＡＢＣＧ２４２１Ｃ等　其氟伐他汀（血药浓位基因携带者，Ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）度显著高于４２１ＡＡ基因型受试者；４２１ＣＣ基因型受试者辛伐他汀（血药浓度比Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）［７］。Ｚ４２１ＡＡ基因型高１１１％１ｈａｎｇ等的研究结果也表明ＡＢＣＧ２４２１Ａ等位基因导致瑞舒伐他　５］。血药浓度显著高于野生型［汀（Ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ）该ＡＢＣＧ２Ｇ３４Ａ是亚洲人群中另一常见的ＳＮＰ，多态导致ＢＣＲＰ蛋白第１２位氨基酸由缬氨酸变，，异为甲硫氨酸（关于ＡＶａｌｅｔＶ１２Ｍ）ＢＣＧ２→Ｍ３４Ａ等位基因对ＢＣＲＰ转运活性的影响作用存在矛盾的报道。以脱氢表雄酮（Ｄｅｈｄｒｏｅｉ－ｙｐ，、和ａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅＤＨＥＡＳ）Ｍｅｔｒｏｔｒｅｘａｔｅ（ＭＴＸ））卟啉（为探针药进行的研究表明ＡＰｏｒｈｒｉｎＢ－ｐｙＣＧ２３４Ａ多态具有与野生型相似的转运活　；（）中国临床药理学与治疗学２０１２Ｊｕｌ１７７?７８３?［］朱利军，李定云，李智，等．焦磷酸测序技术快速１０测定肾移植受体人群ＣＹＰ３Ａ５＊３基因多态性方法］：的建立［Ｊ．中国现代医学杂志，２０１０，２０（１５）２３０２－２３０６．［］贾政军，王华，彭向京，等．焦磷酸测序技术检测１１］ＬＡＭＡ５ｒｓ９４４８９５基因多态性方法的建立［Ｊ．中）：国临床药理学与治疗学，２０１１，１６（６６４７－６５１．［，Ｐ１２］Ｋｉｍ　ＫＡ，ＪｏｏＨＪａｒｋＪＹ．ＡＢＣＧ２ｐｏｌｍｏｒ　　－ｙ，ｈｉｓｍｓ３４Ｇ＞Ａａｎｄ４２１Ｃ＞ＡｉｎａＫｏｒｅａｎｏｕｌａ　　　　　　－ｐｐｐ：ｔｉｏｎａｎａｌｓｉｓａｎｄａｃｏｍｒｅｈｅｎｓｉｖｅｃｏｍａｒｉｓｏｎｗｉｔｈ　　　　　ｙｐｐ［］，Ｊ．ＪＣｌｉｎＰｈａｒｍ　Ｔｈｅｒ２０１０，３５ｏｕｌａｔｉｏｎｓｏｔｈｅｒ　　　ｐｐ（）：６７０５－７１２．［］Ｚ１３ａｍｂｅｒＣＰ，ＬａｍｂａＪＫ，ＹａｓｕｄａＫ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒａｌ　　　　ａｌｌｅｌｉｃｖａｒｉａｎｔｓｏｆｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｒｏｔｅｉｎ　　　　　　ｐ（ＢＣＲＰ）ａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｔｏＢＣＲＰｅｘｒｅｓｓｉｏｎ　　　　ｐｐ　［］，ｉｎｈｕｍａｎｉｎｔｅｓｔｉｎｅＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｅｎｅｔｉｃｓ２００３，１３　　ｇ（）：１１９－２８．［］ｄ１４ｅＪｏｎＦＡ，ＭａｒｓｈＳ，ＭａｔｈｉｓｓｅｎＲＨ，ｅｔａｌ．ＡＢ　　　　－ｇｊ　：ｅＣＧ２ｐｈａｒｍａｃｏｅｎｅｔｉｃｓｔｈｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎａｌｌｅｌｅ　　　ｇｆｒｅｕｅｎｃａｎｄａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ　　　　　ｑｙ　［，２：ｄｉｓｏｓｉｔｉｏｎＪ］．ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ００４，１０（１７）　　ｐ５８８９－５８９４．［］Ｓｌｃｏｒｏｔｅｉｎｌａ１５ａｒｒｅｂｏｏｍ　Ａ，ＮｏｏｔｅｒＫ．ＤｏｅｓＰ　　－　ｇｙｐｐｙｐ［］？ｒｏｌｅｉｎａｎｔｉｃａｎｃｅｒｄｒｕＪＤｒｕｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓａ　　　　ｇｇｐ　，（）：ＲｅｓｉｓｔＵｄａｔ２０００，３６３５７－３６３．　ｐ［］Ｕ１６ｒｕｈａｒｔＢＬ，ＷａｒｅＪＡ，ＴｉｒｏｎａＲＧ，ｅｔａｌ．Ｂｒｅａｓｔ　　　　ｑｃａｎｃｅｒｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｒｏｔｅｉｎ（ＡＢＣＧ２）ａｎｄｄｒｕｄｉｓｏ　　　－ｐｇｐ　：ｉ，ｐｏｌｍｏｒｈｉｓｍｓｓｉｔｉｏｎｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ　　ｙｐｐ［］ｒｏｂｅｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅａｓａｎｉｎｖｉｖｏＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｅｎｅｔ　　　　　ｐｇ，（）：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２００８，１８５４３９－４４８．［，１７］ＫｅｓｋｉｔａｌｏＪＥ，ＰａｓａｎｅｎＭＫ，ＮｅｕｖｏｎｅｎＰＪｅｔａｌ．　　　　ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅＡＢＣＧ２ｃ．４２１Ｃ＞ＡＳＮＰｏｎ　　　　　　，ｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｒａｖａｓｔａｔｉｎｏｆｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎａｎｄｔｈｅ　　　　ｐｐ［］，（：Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｅｎｏｍｉｃｓ２００９，１０１０）ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎｇ１６１７－１６２４．［］Ｔ１８ａｍｕｒａＡ，ＷａｔａｎａｂｅＭ，ＳａｉｔｏＨ，ｅｔａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　　　　－ｅｎｅｔｉｃｏｌｍｏｒｈｉｓｍｓａｌｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｏｆｈｕｍａｎ　　　　　　　ｇｐｙｐＡＴＰｂｉｎｄｉｎｃａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣ）ｔｒａｎｓｏｒｔｅｒＡＢＣＧ２：－　ｇｐ　ｏｒｈｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｌｌｅｌｅｓｔｈａｔａｒｅｄｅｆｅｃｔｉｖｅｉｎ　　　　　　　－ｐｐｙ］，２：ｒｉｎｔｒａｎｓｏｒｔ［Ｊ．ＭｏｌＰｈａｒｍａｃｏｌ００６，７０（１）　　ｐ２８７－２９６．［］Ｔ１９ａｍｕｒａＡ，ＷａｋａｂａａｓｈｉＫ，ＯｎｉｓｈｉＹ，ｅｔａｌ．Ｒｅｅ　　　　－－ｙｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｏｎｓｎｏｎ　　　　　－ｙｙｍｏｕｓｓｉｎｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｏｌｍｏｒｈｉｓｍｓｏｆｔｈｅｈｕｍａｎ　　　　　　ｇｐｙｐＡＴＰｂｉｎｄｉｎａｓｓｅｔｔｅｒａｎｓｏｒｔｅｒＢＣＧ２［Ｊ］．－　ｔ　Ａｇｐ　ｃ，（）：ＣａｎｃｅｒＳｃｉ２００７，９８２２３１－２３９．　［］Ｍ２０ｉｚｕａｒａｉＳ，ＡｏｚａｓａＮ，ＫｏｔａｎｉＨ．Ｓｉｎｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　　　　ｇｏｌｍｏｒｈｉｓｍｓｒｅｓｕｌｔｉｎｉｍａｉｒｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｌｏｃａｌｉ　　　　　－ｐｙｐｐｚａｔｉｏｎａｎｄｅｄｕｃｅｄａｔａｓｅａｃｔｉｖｉｔｎｕｌｔｉｄｒｕ　　ｒ　　　ｍｐｙｇ　ｉ位点以及短的缺失或者插入情况，因此具有更大的检测灵活性等优势。综上所述，焦磷酸测序技本文术更加适合在临床核酸检验中应用。因此，基于焦磷酸测序平台所建立的ＡＢＣＧ２３４Ｇ＞Ａ　和４为基２１Ｃ＞Ａ多态性检测的焦磷酸测序方法，础科研以及临床基因分型检测提供了一种新一代、快速、灵敏、高通量的检测方法。参考文献［］１ｉｄａＡ，ＳａｉｔｏＳ，ＳｅｋｉｎｅＡ，ｅｔａｌ．Ｃａｔａｌｏｏｆ６０５　Ｉ　　　　　ｇ　ｏｌｍｏｒｏｈｉｓｍｓ（ｓｉｎｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳＮＰ）ａｍｏｎ１３－　ｐｙｇｇ　ｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｈｕｍａｎＡＴＰｂｉｎｄｉｎｃａｓｓｅｔｔｅｔｒａｎｓ　　－　－ｇｇｇ　　：ＡＢＣＡ４，ＡＢＣＡ７，ＡＢＣＡ８，ＡＢＣＤ１，ＡＢｏｒｔｅｒｓ－ｐＣＤ４，ＡＢＣＥ１，ＡＢＣＦ１，ＡＢＣＧ１，ＡＢＣＧ２，ＡＢ－，ＣＧ４，ＡＢＣＧ５，ａｎｄＡＢＣＧ８［Ｊ］．ＪＨｕｍ　Ｇｅｎｅｔ　　（）：２００２，４７６２８５－３１０．［］２ａｍｂｅｒＣＰ，ＬａｍｂａＪＫ，ＹａｓｕｄａＫ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒａｌ　Ｚ　　　　ｒｏｔｅｉｎ（ａｌｌｅｔｉｃｖａｒｉａｎｔｓｏｆｂｒｅａｓｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＢＣＲＰ）　　　　　ｐａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｔｏＢＣＲＰｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎ　　　　　　ｐｐ　［］，：ｉｎｔｅｓｔｉｎｅＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｅｎｅｔｉｃｓ２００３，１３（１）１９ｇ－２８．［，Ｈ３］ｏｂａａｓｈｉＤ，ＩｅｉｒｉＩｉｒｏｔａＴ，ｅｔａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｋ　　　　ｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ）ｅｎｅｏｌｍｏｒｈｉｓｍｓ　　　ｇｐｙｐ］ｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎＪ．Ｄｒｕｔｏｒｏｔｅｉｎｌａｃｅｎｔａ［　　　　　ｐｇｐｐ，（）：ＭｅｔａｂＤｉｓｏｓ２００５，３３１９４－１０１．　ｐ［］，Ｍ４ａｃｋｓｔｒｏｍ　Ｇ，ＴａｉａｌｅｎｓｕｕＪｅｌｈｕｓＨ，ｅｔａｌ．　Ｂ　　　ｐＧｅｎｅｖａｒｉａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＡＴＰｂｉｎｄｉｎｃａｓｓｅｔｔｅｔｒａｎｓ　　　　－　－ｇ　ＡＢＣＧ２（ＢＣＲＰ）ｉｎａＳｗｅｄｉｓｈｏｒｔｅｒｅｎｅｏｕｌａ　　　　　－ｐｇｐｐ［］，（）：ｔｉｏｎＪ．ＥｕｒＪＰｈａｒｍＳｃｉ２００３，１８５３５９－３６４．　　　［，５］ｈａｎＷ，ＹｕＢＮ，ＨｅＹＪｅｔａｌ．ＲｏｌｅｏｆＢＣＲＰ　Ｚ　　　　　ｇ　４２１Ｃ＞Ａｏｌｍｏｒｈｉｓｍｏｎｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎｈａｒｍａｃｏ　　　　－ｐｙｐｐｋｉｎｅｔｉｃｓｉｎｈｅａｌｔｈＣｈｉｎｅｓｅｍａｌｅｓ［Ｊ］．ＣｌｉｎＣｈｉｍ　　　　ｙ　，（／）：Ａｃｔａ２００６，３７３１２９９－１０３．［］６ｏｒｅｎａａＹ，ＮａｉｔｏＫ，ＯｋａａｍａＮ，ｅｔａｌ．Ａｓｓｏｃｉａ　Ｋ　　　　－ｇｙｔｉｏｎｏｆｔｈｅＢＣＲＰＣ４２１Ａｐｏｌｍｏｒｈｉｓｍ　ｗｉｔｈｎｏｎ　　　　　－ｙｐ，ａｉｌｌａｒｒｅｎａｌｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ　　　　ｐｐｙ　（）：２００５，１１７３４３１－４３４．［］７ＢＣＧ２基因单核苷酸多态性研　肖宇山，胡丽莉．Ａ］：究进展［Ｊ．广东药学院学报，２０１０，２６（５）５４０－５４５．［］８　翟仙敦，刘之江，侯一平．焦磷酸测序技术及其法］：医学应用［Ｊ．中国司法鉴定，２００９，１（４）３９－４２．［］９ｒｏｓｅｕｅｎｃｉｎ　赵钢涛，丁媛媛，杨凡，等．Ｐｙｑｇ检测ＣＹＰ２Ｃ９＊３基因多态性方法的建立及其可靠性研］：究［Ｊ．中国临床药理学与治疗学，２００９，１４（７）７９９－８０３．包含各类专业文献、各类资格考试、行业资料、生活休闲娱乐、幼儿教育、小学教育、中学教育、焦磷酸测序分析ABCG2基因多态性方法的建立_万子睿01等内容。　
　(单核苷酸多态性)下一篇阅读质粒图谱 具体事例【摘要】 建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对 基因表达量测定法(简称“SRPP”... 　(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术,焦磷酸测序法 适于对已知的短序列的测序分析, 其可重复性和精确性能与 SangerDNA 测序法相媲美, 而速 度却大大... 　焦磷酸测序:在实际工作中,很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证,而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下,Sanger法未必是最合适的DNA序列分析...}