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产抗生素放线菌LJ-7的筛选
【来源/作者】江苏省南京师范大学--卢佳 【更新日期】 16:56:00
The screening of Actinomycetes LJ- 7 producing antibiotics
Abstract Eight strains of Actinomycetes were screened out from soil on Gause Ι medium. The strains were cultured (28℃,160 rpm) for 7 days, and used for determination of inhibition zone on the indicator medium contained Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Shigella dysenteriae, respectively. An antibiotic producing Actinomycetes LJ-7 was screened and indentified preliminarily.
Key words Actinomycetes , antibiotic , indicator, inhibition zone
微生物是生物农药的重要来源，其中放线菌是主要的抗生素产生菌，其所产生的抗生素应用范围较广，数量也较多。在植物病害的防治上,抗生素以其高效、低毒、与环境相容性好等优点越来越受到人们的关注，也成为新农药创制的热点之一[1]。另外， 放线菌是拥有巨大应用价值的一类微生物类群，是一种能产生多种有益代谢产物且具有很高经济价值的菌种。到目前为止从放线菌发现的具有生物活性的物质大约有12000种，大约占整个天然生物活性物质的50％左右，其中仅从链霉菌一个属就发现近万种。因此，放线菌的研究具有十分重要的科学价值和实用价值[2]。
放线菌主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养，从而产生某一类抗生素[2]。
因放线菌能产生生物活性物质，放线菌必然与人类的生产、生活有密切的关系,例如在人类疾病防治方面，抗生素滥用情况严重，且以往的抗生素已经不能有效的治疗人类的疾病，所以，继续寻找和筛选产生新颖抗菌物质的放线菌有着重要意义。本实验旨在尝试从土壤中筛选产抗生素的野生型放线菌。
1 材料与方法
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".1 仪器
本项目研究所用主要仪器为：立体式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40AI，上海申安医疗器械厂），生化培养箱（HPS-250，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），分析天平（ESJ180-4，沈阳龙腾电子科技有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（GZX-GFC.101-1-BS，上海博泰实验设备有限公司），微波炉（EM-183MS1，安徽省合肥市荣事达三洋电器股份有限公司），空气恒温震荡器（HZQ-C，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".2 试剂
NaOH，乙醇，10%酚等。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".3 菌种
本实验所用指示菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".4 培养基
（1）高氏I号培养基（g/L）[3]：可溶性淀粉 20；NaCl 0.5；KNO3 1；K2HPO4&#8226;3H2O 0.5；MgSO4&#8226;7H2O 0,01；FeSO4&#8226;7H2O 0.5；琼脂粉15-25，加去离子水至1L, pH7.4-7.6。121℃,灭菌20min。
（2）牛肉膏-蛋白胨培养基（g/L）[3]：牛肉膏3；蛋白胨10；NaCl5；琼脂粉15-20，加去离子水至1L,pH7.0-7.2。121℃,灭菌20min。
（3）发酵培养基（g/L）[4]：蔗糖45；黄豆粉25；KH2PO4 0.2；NaCl 1；NaSO4 0.1；FeSO4 0.01；CaCO3 3；加去离子水至1L，pH7.2。121℃，灭菌 20min。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".1采土样
在校园（实验楼后）选取有机质丰富、通气性良好的、偏碱性的土壤，（pH 7.0-7.5）。用小产挖取地表下5-25cm 的土壤5g装入塑料袋中。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".2放线菌的筛选
（1）土壤悬浊液梯度稀释：将5.0g土壤加入到50ml无菌水中，震荡10min制备土壤悬液；用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml无菌水中作10倍稀释；按1:10稀释至10-3、10-4、10-5 [3]。
（2）倒平板：取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5，每个稀释度做两个培养皿）。然后在融化并冷却至50℃左右的高氏I号培养基加入10％的酚数滴，混合均匀；在每个培养皿中倒15-20ml左右，待冷凝备用[3]。
（3）涂布： 用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-3、10-4、10-5的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小的开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀 [3]。
（4）培养： 接种完毕，将平皿放入28℃培养箱中培养7天，观察平皿上放线菌菌落生长情况[3]。
（5）平板划线分离纯化：挑取培养7天后的平皿上的单个放线菌菌落，在淀粉琼脂平皿上进行三区划线法一次分离纯化，28℃培养7天。若不纯，则如上方法进一步分离纯化，直至纯培养为止，并观察放线菌菌落特征[3,4]。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".3 鉴定菌种
制作装片，镜检，观察菌落特征，判断是否属于放线菌。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".4产抗生素放线菌的筛选
（1）初筛：配制高氏I号液体培养基，分装于8个250mL的三角烧瓶中，每瓶50ml；鉴定出的菌株接种于高氏I号液体培养基中，于28℃，160r/min振荡培养7天。
（2）抑菌实验：配制牛肉膏蛋白胨培养基，分别倒15ml于12个培养皿中，冷却后作下层平板，将三种指示菌菌悬液和牛肉膏-蛋白胨培养液混匀后倒上层平板，并在其上放入牛津杯，在牛津杯中分别加入经离心（4000rmp，15min） 的供试菌培养液0.1ml，于 28℃培养24小时，观察抑菌圈情况，并测量其直径[5.6]。
（3）复筛：配制发酵培养基，分装于6个250ml三角烧瓶中。将初筛到的放线菌培养液以6%的接种量转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃，160r/min培养4天【5】，得发酵液。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".5抗菌谱测定：
配制牛肉膏蛋白胨培养基，倒双层平板，方法同上，然后牛津杯中分别加入经离心（4000rmp，15min） 的发酵液0.1ml，于28℃培养24小时，观察两种不同培养液的抑菌圈生长情况[5,6]。
2 结果与讨论
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".1 菌种鉴定结果
所筛选的菌株为放线菌LJ-7，见图1和图2。
图 1 放线菌LJ-7
图 2 高氏Ⅰ号培养液抗菌谱测定
注：A:指示菌为大肠杆菌；B:指示菌为金黄色葡萄球菌；C:指示菌为痢疾杆菌。
供试菌在高氏I号培养基中培养情况，见表1。
表1 高氏I号培养液-抑菌圈直径大小
金黄色葡萄球菌
1.5注：单位表中的数均为每个平板中对应的3个抑菌圈直径的平均值。
表1数据显示：LJ-4和LJ-7均有抑菌圈。从指示菌角度来看，大肠杆菌作指示菌时，只有LJ-4和LJ-7有抑菌圈，说明这两种菌产的抗生素能抑制大肠杆菌的生长；而金黄色葡萄球菌和痢疾杆菌作指示菌时，除LJ-5和LJ-6外，抑菌圈都较大。以上说明在高氏I号培养液中，LJ-5和LJ-6抑菌效果差，而LJ-1、LJ-3、LJ-4和 LJ-7抑菌效果较好。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".2 产抗生素放线菌筛选结果
图3 发酵液抗菌谱测定
注：A:指示菌为大肠杆菌；B:指示菌为金黄色葡萄球菌：C:指示菌为痢疾杆菌.
供试菌在发酵液中培养情况，见表2。
表2发酵液-抑菌圈直径大小
金黄色葡萄球菌
注：单位表中的数均为每个平板中对应的3个抑菌圈直径的平均值。
表2数据显示 ：LJ-5和LJ-6没有抑菌圈；LJ-4和LJ-7的抑菌圈较大，从指示菌角度看，金黄色葡萄球菌和痢疾杆菌基本可被放线菌（除LJ-5和LJ-6外）抑制，而大肠杆菌不能被放线菌（除LJ-4和LJ-7外）的抗生素抑制。可以看出。发酵液中，LJ-4和LJ-7的抗菌效果较好。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".1关于菌种鉴定
放线菌可以产生色素，且放线菌代表属也分好几种。其菌落一般为圆形，菌落质地致密表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱、地衣状、表面干燥，可作为鉴别菌种的基本参考依据。孢子丝生长到一定阶段可形成孢子。由于孢子含有不同色素，成熟的孢子堆也表现出特定的颜色，而且在一定条件下比较稳定，故也是鉴定菌种的依据之一（但孢子的形态和大小不能笼统地作为分类鉴定的重要依据）。本实验采用形态学特征来筛选放线菌，正如图1 菌落的颜色为白色、圆形，且质地致密、表面干燥，故初步确定为放线菌并命名为LJ-7。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".2关于放线菌的分离纯化
分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理，或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。本实验即是通过稀释涂布和平板划线分离纯化而得到放线菌的。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".3 关于菌株筛选
在土壤放线菌的筛选时，利用高氏I号培养基培养时，放线菌均长势良好，但LJ-5和LJ-6没有产生抗生素说明这两种菌抑菌活性小，故将其淘汰，而LJ-1、LJ-3、LJ-4和LJ-7产抗生素能力强。在发酵液抗菌谱测定时，对于剩余的6株菌，LJ-4和LJ-7产抗生素能力强。综述说明LJ-1、LJ-3、LJ-4和LJ-7这四株菌抗菌谱测定效果良好，故本实验选定放线菌LJ-7。
<ST1:CHSDATE w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".4 关于抗菌谱测定
由表1和表2数据说明：以上几株放线菌产生的抗生素几乎不能抑制大肠杆菌的生长，抗菌谱测定效果不佳；而对金黄色葡萄球菌和痢疾杆菌抑制效果较好。故认为金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌可作为鉴别放线菌的最佳指示菌。另外，同一种放线菌在不同的培养液中培养时产抗生素的情况也不同；同一种放线菌抗菌谱测定时选用不同的指示菌抑菌活性也不同。综上可知，高氏I号培养基培养放线菌效果较好，发酵培养基使放线菌产抗生素效果较好。
参考文献：
[1] Okami Y. and Hotta, K.1988, Search and discovery of new antibiotics. In Actinomycetes in Biotechnology (Goodfellow,M.,Williams, S. T. and Mordarski, M., Eds), pp.36-37. London: Academic Press.
[2] 冯轶男，放线菌分离与筛选方法的研究进展 [J]，《生物技术》)：68-70.
[3] 沈萍，陈向东主编，微生物学实验指导，第四版，高等教育出版社，18-241.
[4] 安德荣，穆晓倩，刘翠娟，赵文军，张勤福，马驰，土壤拮抗放线菌的分离和筛选[J]，微生物学杂志）：1-3.
[5] 王群利，师宝君，卞小莹，姬志勤，土壤拮抗放线菌的分离及其抗菌活性筛选植物保护[J]，)：42-43.
[6] 徐路明，都明亮，王金果，罗兰，土壤放线茵X1的筛选及其抑茵活性初探[J]，中国农学通报20ll，27(9)：195-200.
【关键词】放线菌,抗生素，指示菌,抑菌圈，&
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木有牛津杯
用什么方法代替比较好啊。。。。。。。。。。。。。。
做抑菌试验&&实验室没有牛津杯&&买又不方便&&用什么代替好啊？或者有啥好方法啊？
滤纸片法做出来效果不咋地，出去纸片半径，抑菌圈才2mm，有用过打孔器的能否详细指点下？
唉&&%>_<%&&
一个牛津杯几块钱，可以散买的，要不了多少钱，去淘宝看看吧 楼主用滤纸做药敏纸片能确定纸片中的药量吗？有没有用标准药敏片进行比较？ 只知道液体的浓度，但由于是蛋白液体，不好浓缩啊，不知道下步该怎么做，有没有意义，浓度该怎么设。木有对照啊，一般用啥啊 : Originally posted by hnjdd at
楼主用滤纸做药敏纸片能确定纸片中的药量吗？有没有用标准药敏片进行比较？ 只知道液体的浓度，但由于是蛋白液体，不好浓缩啊，不知道下步该怎么做，有没有意义，浓度该怎么设。木有对照啊，一般用啥啊 打孔器是打固体琼脂块的，你的不是液体吗，拿来干嘛啊？
要我说你还用96深孔板吧，“基础培养基+菌悬液+你的样品”这样做个适当的优化后通过测定菌浓会有较好的结果 曾经做过双层平板打孔法，可以做出很漂亮的抑菌圈，不过加药体积不能太多，10ul左右吧。做好双层平板，待上层凝固之后，用灭过菌的吸管截出圆形区域，再小心的用镊子挑掉那块小的上层素琼脂，形成一个小凹陷，药物就可以加到这里面。呵呵，微操要求比较高，LZ可以尝试一下。 : Originally posted by zqp9110 at
曾经做过双层平板打孔法，可以做出很漂亮的抑菌圈，不过加药体积不能太多，10ul左右吧。做好双层平板，待上层凝固之后，用灭过菌的吸管截出圆形区域，再小心的用镊子挑掉那块小的上层素琼脂，形成一个小凹陷，药物就 ... 双层平板？第一次听说啊&&具体怎么做双层平板啊&&能再详细点吗？
吸管打孔是用乳胶管的那头吧？深度如何控制？
非常感谢！ : Originally posted by zzqbaidu at
只知道液体的浓度，但由于是蛋白液体，不好浓缩啊，不知道下步该怎么做，有没有意义，浓度该怎么设。木有对照啊，一般用啥啊... 液体的浓度，你用酶标仪或者比浊仪进行测定了。 : Originally posted by zzqbaidu at
双层平板？第一次听说啊&&具体怎么做双层平板啊&&能再详细点吗？
吸管打孔是用乳胶管的那头吧？深度如何控制？
非常感谢！... 当时用双层平板法来做抑菌圈实验是因为直接单层平板涂布接种长出来的菌苔会有涂布棒的痕迹，卖相不好。受到做噬菌体效价实验的启发，就把双层平板法用上了。其实就是把涂布接种这一步用上层平板代替了，具体的：将要接种的菌液融入7ml左右的素琼脂（琼脂加到水中溶解，无营养成分，一般用0.8%）中，混匀后倒在普通平板上铺满，长出来的菌就很平整，没有任何刮痕。至于打孔，其实是有点自虐的选择。倒好双层平板之后，可以用普通的滤纸片法做抑菌圈，但是当时实验结果有些诡异，怀疑是滤纸片有影响，就想不用滤纸片。在上层平板凝固之后，直接用那种薄壁的透明的最普通的吸管（直径约3mm）垂直穿透上层平板那一薄层，形成一个圆饼形上层胶，然后用尖头小镊子小心的挑掉那一小块琼脂胶，形成一个圆形小凹陷，最后往凹槽里加入要检测的药物，正置培养即可。 : Originally posted by zqp9110 at
当时用双层平板法来做抑菌圈实验是因为直接单层平板涂布接种长出来的菌苔会有涂布棒的痕迹，卖相不好。受到做噬菌体效价实验的启发，就把双层平板法用上了。其实就是把涂布接种这一步用上层平板代替了，具体的：将 ... 7ml左右的素琼脂也要高压灭菌吧？等琼脂降到多少度倒入菌液？50度？菌液量一般是多少？
谢谢！:D : Originally posted by zzqbaidu at
7ml左右的素琼脂也要高压灭菌吧？等琼脂降到多少度倒入菌液？50度？菌液量一般是多少？
谢谢！:D... 素琼脂一般是先用沸水煮化之后，分装到小的玻璃试管，盖上胶塞，121℃灭菌。降到不烫手再加菌液。一般来说，做抑菌圈实验的每块平板都是加入10^6个菌体细胞，体积根据这个换算就行。 可以买一段摩托链条，拆解上有很多小环也可以的，还不宜上锈！&#xe621; 上传我的文档
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