黄芩栽培化学控制技术的研究及黄芩苷生物合成基因的克隆--CNKI数字图书馆
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黄芩栽培化学控制技术的研究及黄芩苷生物合成基因的克隆
作&&&&者：
来&&&&源： 北京中医药大学
摘&&&&要： 唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi.)是一种常用中药材,其主要活性成分为黄酮类化合物,包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素等。活性成分含量是衡量中药材质量的重要指标,在栽培过程中受到多种因素的影响,包括发育阶段、环境和栽培条件等。如何对这些因素进行优化以提高栽培药材活性成分的含量是日前研究的热点之一。本研究以黄芩为研究对象,围绕中药材采收期研究,分析不同生长发育阶段对黄芩质量、产量与活性成分积累的影响,结合活性成分合成关键酶基因的表达水平,并对物候期影响黄芩活性成分积累的机制进行探讨,在此基础上确定黄芩活性成分积累的关键时期及最佳采收期。选择在黄芩道地产区承德进行生产性试验,初步建立适合黄芩的化控生产规程。并对黄芩苷生物合成途径的关键酶基因进行解析、克隆及重组表达,验证其功能,从而为构建生产黄芩有效成分的工程菌建立基础。本研究基于以上目的和内容,得到以下结论：
1.确立黄芩生长的关键物候期及最佳采收期
据本草记载黄芩采收“二月八月采根,暴干用之”,但长期以来黄芩最佳采收期尚无定论。本研究采用化学、生态学、植物物候学和统计学等多学科手段研究黄芩在不同生长发育阶段形态、质量产量及基因表达水平的变化规律,并结合前人对气候、土壤等环境因子与其产量和质量关系的研究,发现展叶期和枯黄期是黄芩活性成分积累的主要时期,与我国北方地区早春和晚秋基本一致,而枯黄期黄芩地下部分的生物量最高,且活性成分积累的含量也很高,最适宜采收。
2.植物生长调节剂缩节胺对黄芩活性成分积累的影响及应用
在细胞受控试验、盆栽植物受控试验、田间试验水平上,分别利用植物生长调节剂赤霉素、缩节胺分析其对黄芩生长发育和活性成分积累的影响,结合黄芩采收与活性成分积累的最佳物候期设计黄芩化学控制生产规程,并在黄芩道地产区承德进行生产性试验。试验结果表明,喷施浓度为100mg·L-1的缩节胺可以有效地提高黄芩的产量和活性成分的积累,且对药材体外抗氧化活性没有显著影响。
3.黄芩苷生物合成基因功能的初步研究
本研究通过黄芩cDNA文库克隆得到F6H及UBGAT两条关键酶基因,通过生物信息学分析结果表明SbF6H包含1002bp开放阅读框,与番茄(Solanum lycopersicum)(NP_OO1233840)氨基酸序列的相似性达到76%；SbUBGAT包含1431bp开放阅读框,与紫苏(Perillafrutescens)(BAG31952)氨基酸序列的相似性达到71%。然后目的基因连接表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-F6H及pET-UBGAT,转化宿主菌E.coli BL21(DE3),30°C0.4mmol-L-1IPTG诱导4h后,可表达出分子量约为54kD及72kD的重组融合蛋白,其具体的生物学功能还需进一步研究。
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目录3-6? 摘要6-8? ABSTRACT8-10? 縮略语10-11? 前言11-13? 第一章 文献综述13-25?
1.1 黄芩概述13-14?
1.1.1 来源及性状13?
1.1.2 化学成分研究13?
1.1.3 药理作用研究13-14?
1.1.4 生物技术在黄芩研究中的运用14?
1.2 环境因子对黄芩生长发育及活性成分影响的研究进展14-15?
1.2.1 不同产地黄芩的比较14-15?
1.2.2 温度对黄芩的影响15?
1.2.3 水分对黄芩的影响15?
1.2.4 发育阶段对黄芩的影响15?
1.3 植物生长调节剂对黄芩生长发育及活性成分影响的研究进展15-18?
1.3.1 中药材生产化学调控的意义和优越性16?
1.3.2 植物激素与中药材的有效成分的相互作用16-17?
1.3.3 植物生长调节剂在中药材生产上的应用17-18?
1.3.4 中药材生产化学调控的应用前景18?
1.4 黄酮类化合物生物合成途径研究进展18-25?
1.4.1 黄酮类化合物的结构特征19?
1.4.2 黄酮类化合物生物合成途径19-22?
1.4.3 黄酮类化合物生物合成途径的调控机制22-25? 第二章 研究背景,研究目的和技术路线25-27?
2.1 研究背景25?
2.2 研究目的25-26?
2.3 技术路线26-27? 第三章 发育阶段对黄芩生长发育和活性成分积累的影响27-35?
3.1 发育阶段对黄芩生长和活性成分积累的影响27-30?
3.1.1 实验材料27?
3.1.2 实验方法27-28?
3.1.3 实验结果28-30?
3.2 不同发育阶段黄芩苷生物合成酶基因的表达分析30-32?
3.2.1 实验材料30?
3.2.2 实验方法30-31?
3.2.3 实验结果31-32?
3.3 讨论32-35?
3.3.1 发育阶段对黄芩生长的影响32?
3.3.2 发育阶段对黄芩活性成分积累的影响32-33?
3.3.3 发育阶段对黄酮生物合成途径酶基因转录水平的影响33-35? 第四章 植物生长调节剂缩节胺对黄芩生长发育及其活性成分积累的影响35-39?
4.1 实验材料与方法35-36?
4.1.1 材料35?
4.1.2 药剂处理设计35?
4.1.3 黄芩主要物质含量的测定35?
4.1.4 DPPH自由基清除率的测定35-36?
4.1.5 标准曲线绘制36?
4.2 结果与分析36-38?
4.2.1 缩节胺对黄芩生长发育的影响36-37?
4.2.2 黄芩活性成分含量变化37?
4.2.3 黄芩醇提物对DPPH自由基的清除作用37-38?
4.3 讨论38-39?
4.3.1 赤霉素与缩节胺对黄芩生长的影响38?
4.3.2 赤霉素与缩节胺对黄芩活性成分积累的影响38-39? 第五章 黄芩苷生物合成基因的克隆及分析39-55?
5.1 实验材料39?
5.2 实验方法39-46?
5.2.1 黄芩总RNA的提取39?
5.2.2 总RNA逆转录39-40?
5.2.3 基因克隆40-41?
5.2.4 PCR产物的凝胶电泳分析与切胶回收41?
5.2.5 PCR产物和T载体的连接41?
5.2.6 连接反应产物转化大肠杆菌41?
5.2.7 重组T载体的鉴定41-42?
5.2.8 原核表达载体的构建42-44?
5.2.9 转化表达宿主菌BL2144?
5.2.10 IPTG诱导蛋白表达44-46?
5.3 实验结果46-54?
5.3.1 RNA提取结果46?
5.3.2 cDNA逆转录及目的基因扩增46?
5.3.3 T-载体连接克隆46-48?
5.3.4 生物信息学分析48-50?
5.3.5 表达载体的构建与鉴定50-52?
5.3.6 转化表达宿主细胞52?
5.3.7 重组表达宿主菌的诱导表达52-53?
5.3.8 表达条件的优化53-54?
5.4 讨论54-55? 第六章 小结55-57? 第七章 总结与展望57-59? 参考文献59-65? 致谢65-67? 个人简历67
中国学术期刊网络出版总库[1] 周志凯;任旭琴;;;安徽农业科学;2008年27期[2] 李鹏飞;邹志荣;杨振超;胡晓辉;任雷;孙心心;;;安徽农业科学;2010年26期[3] 马文景;米受恩;;;甘肃农业大学学报;1993年01期[4] 张延红;何春雨;林丽;陈红刚;;;甘肃中医学院学报;2008年06期[5] 赵维合;凌征柱;陈超君;;;广西医学;2006年06期[6] 田建红;;;海峡药学;2009年03期[7] 丁义峰;刘萍;常云霞;赵乐;韩德果;徐克东;;;河南农业科学;2007年01期[8] 毛秀杰,张广臣,刘彦斌,张会春;;吉林农业大学学报;1999年02期[9] 高扬,梁宗锁;;现代中药研究与实践;2004年03期[10] 周守标,郭新弧;;植物研究;2001年04期
中国博士学位论文全文数据库[1] 李化;;中国中医科学院;2008年
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&&&&家种黄芩受欢迎&&&&黄芩为唇形科多年生草本植物，药用根茎，有清热燥湿安胎凉血的作用，别名黄金茶，用来泡茶喝，有清凉败火、消炎去暑的功能。中医中，银花清感方等有关方剂及制品都要用到大宗原料――黄芩。&&&&黄芩适应性很强，不畏严寒、干旱，荒山荒坡、树林、野地都能生长。有的地方将种子撒播于沙滩上，也有的地方撒播于山坡上都得到了成功，见到了效益。近几年，家种黄芩大受市场欢迎，价格也稳中上涨；同时近年来黄芩种植力度减弱，市场库存薄弱，支撑价格上涨。目前价格在17～21元/公斤，其价格后市依然看好，值得发展种植。&&&&在平原地区选地以沙质或半沙质土壤为好，要有相应的水利条件，施足底肥，深耕后做畦，不论冬播、春播，还是夏播，亩用种都是2公斤左右。采取平畦宽幅条播种植，比种白菜还要简单，播后浇水，遇阴雨天可推迟浇水，小苗只要出了就不会再旱死，耐力很强。&&&&干旱地区要在雨季种植，成功率很高，尽量多使一些种子。黄芩种植管理简单，采收容易，可用拖拉机作业，提高采收效率。黄芩亩产200～350公斤，亩效益高。&&&&棉花怎样抗逆早熟高产&&&&今年初，极端天气屡屡显露颜色，尤其是3月下旬，很多地区出现了异常高温，紧接着4月上旬，不少地区又出现了大幅降温和罕见降雪。在这种天气背景下，今年的棉花怎样种植才能抗逆、早熟、稳产、高产呢？&&&&在采用措施上应把握以下几点：选好品种在品种选择上应以抗逆性强和稳产高产为主要着眼点，既早熟性好，又有高产潜力，而且受灾后恢复快，具备这几条的品种应成为首选。&&&&根据不同品种特性和土壤肥力，合理密植蕾期化控，控制株高，每株少留果枝，及时打顶，把结铃的任务由个体和群体共同分担。&&&&协调好氮、磷、钾肥的关系，磷有降低营养体和促早熟的作用，钾能防病防早衰，这两种肥料都能增强棉株的抗逆性，应在底肥中施足；氮肥应在棉株开花结铃后重点追施，在苗期和蕾期控制施用，以防营养体过大，影响棉株正常的开花结铃。氮肥不要一次用量过多，一旦氮肥、水分、温度碰在一块，很易造成棉株徒长，形成蕾铃大量脱落，脱落的结果是营养过剩，其办法是中后期多进行叶面喷肥，既及时补充营养，又不造成营养过剩和养分失调。&&&&运用好促控手段促控棉花除靠水、肥、中耕等措施，还靠生长调节剂。喷施缩节胺主要是控制棉株生长过快，而当棉株受到不利条件影响造成生长缓慢甚至停滞，或因风雹等袭击破坏棉花生长时，就要喷施生长素促其加速生长；生长素只能加快细胞分裂，并不能给棉株提供营养，所以要结合施用营养剂。有时棉株生长快，但营养又不足，就需要既喷缩节胺，又加营养素，这并不矛盾。因为棉花同时受到的外界不良影响可能是多元的，所以我们采取的措施也应该是多元的。这就要求同时运用好促控棉花的各种手段。&&&&及时严格防治病虫害极端天气对棉花病虫害的发生和危害也产生着复杂影响，要不断地对新情况进行跟踪、观察和研究，加强预测，以防为主，探索新的防治方法。如棉花苗期病害、角斑病、二代棉铃虫、棉盲蝽、棉红蜘蛛等问题，近年来在一些棉区都有加重发生的趋势。病虫害一旦开始发生，要及时严格除治，不能贻误时间，不留后患；也不能盲目混配和加大药量，以防影响棉花正常生育。要通过深耕和增施有机肥等措施培育壮苗壮株，增强棉花抗病虫能力。要改善棉田小气候，营造不利于病虫害暴发的环境。&&&&中药材砂仁采果后的田间管理&&&&割除老苗。砂仁结果后植株群体中的枯老苗，长势已经衰退，不但消耗水分、养分，而且易感染病虫害，影响群体中健株生长。因此在采果后，应立即将枯老弱株、病株割除，集中地外烧毁，每平方米只留下40～50健株，而利于砂仁地内通透光，减少养分消耗和病虫害发生，促进植株生长健壮。&&&&调节荫蔽度。砂仁是一种喜阴植物，按其生长发育习性，只有在50%荫蔽度的条件下才能正常生长发育。荫蔽度过小或过大均不利于其生长发育。因此，在每年收果后应对砂仁地内的荫蔽度进行适当调节，荫蔽过大的应将砂仁地内荫蔽树进行修枝或砍伐，减少其荫蔽度。荫蔽过小的地块则种上速生树种以增加荫蔽度，而有利砂仁植株群体生长健壮。&&&&施肥。经过开花结果的砂仁植株群体，消耗了大量养分，为了使其群体长势得到迅速恢复和促进秋笋长出，为第二年获得高产打下坚实基础，在收果割老苗后，每亩用厩肥、堆肥3000kg，花生30kg（或豆饼50kg），过磷酸钙25kg。将上述肥料经共同沤制腐熟后均匀撒施入砂仁地内，施后培土盖过葡萄茎1/2为度。这次施肥称促笋肥。进入第二年2月下旬至3月上旬，每亩施入人粪尿1000kg，尿素5kg进行泼施，这次称壮苗肥，而促进砂仁多长笋，苗长壮，为砂仁群体多花结果打下基础。&&&&病虫害防治。常见病虫害有：（1）叶枯病多发生于秋冬季荫蔽不足地块。防治方法：调节砂仁地内荫蔽度在50%5左右为宜；天气干旱时加强浇水或灌溉；发病初期用70%托布津1000倍液喷洒防治。（2）叶斑病冬季干旱或霜冻后易发生。防治方法：采果后清除病株病叶集中烧毁；增施磷钾肥，并适当喷水；发病初期用50%托布津可湿性粉剂800倍液喷洒防治。（3）钻心虫为害砂仁幼笋生长点，造成枯心。防治方法：发现被害幼笋立即割除集中烧毁，成虫产卵期用40%乐果1000倍液或90%敌百虫800倍液喷杀。
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