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ad-ing4-polya-promoter-osm对spc-a1肺腺癌细胞的体外抑癌增效作用及其分子机制
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外周血循环中肺癌细胞的流式细胞仪定量分析
来源：青年人()&更新时间： 18:14:12 &【字体： 】
摘　要：目的　运用流式细胞仪定量分析外周血循环中肺癌细胞。方法　外周血经Ficoll梯度离心分离单核细胞组分，后者用CD45、细胞角蛋白(CK)及肺癌特异性单抗(2F7/S5A)染色后，应用流式细胞仪检测CD45-CK+2F7/S5A+细胞。然后计算每升血中上述细胞含量。结果　(1)外周血单核细胞的表型为CD45+CK-2F7/S5A-，而小细胞和非小细胞肺癌细胞系均为CD45-CK+2F7/S5A+。因此，应用此方法能从106白细胞中检测到1个肺癌细胞，敏感性达到每毫升血中检测到5个肺癌细胞；(2)15例正常人及7例肺部良性疾患外周血中CD45-CK+2F7/S5A+细胞均为阴性，而40例肺癌患者外周血14例发现阳性细胞，阳性率达35 %，阳性细胞含量平均为1×105/L。结论　本方法具有较好的敏感性和特异性，能够定量分析外周血中的微量肺癌细胞。关键词：肺癌细胞；　外周血；　流式细胞仪；　定量分析中图分类号：R734.2　文献标识码：A文章编号：00)01-0031-04
QUANTITATIVE ANALYSIS OF CIRCULATING LUNG CANCERCELLS IN THE PERIPHERAL BLOOD BY FLOW CYTOMETRY
DONG Qiang-gang（Shanghai Institute of Thoracic Tumors,Shanghai Chest Hospital ,Shanghai 200030,China）JIANG Xiao-feng（Shanghai Institute of Thoracic Tumors,Shanghai Chest Hospital ,Shanghai 200030,China）SHA Hui-fang（Shanghai Institute of Thoracic Tumors,Shanghai Chest Hospital ,Shanghai 200030,China）
Abstract：Objective　To analyse circulating lung cancer cells in the peripheral blood by flow cytometry.Methods　The monocyte fraction in the peripheral blood was isolated by Ficoll-Hypaque gradient centrifugation.The cells obtained were labeled with antibodies against CD45,cytokeratin (CK) and antigen (2F7/S5A)expressed on lung cancer cells. The CD45-CK+2F7/S5A+ cells were analyzed by flow cytometry and their concentration per liter of blood was calculated.Results　(1) The phenotype of blood monocytes was CD45+CK-2F7/S5A-，while that of small-cell and non-small-cell lung cancer cells was CD45-CK+2F7/S5A+。Therefore,using this method one lung cancer cell can be detected in one million of white blood cells,with sensitivity of 5 cancer cells per milliliter of blood.(2)The CD45-CK+2F7/S5A+ cells were detected in none of 15 healthy objectives nor 7 patients with benign pulmonary diseases.Meanwhile,fourteen cases out of 40 lung cancer patients(35 %) were found to have cancer cells in the peripheral blood,with the concentration of 105 cancer cells/L blood.Conclusion　The method described herein has a good sensitivity and specificity for detection of lung cancer cells in the peripheral blood.Key words：Lung cancer cells；Peripheral blood；Flow cytometry；Quantitative analysis▲
　　近年来大量研究指出，实体肿瘤(包括肺癌)患者的外周血中存在癌细胞。这些循环的癌细胞(Circulating Cancer Cells)可能是导致肿瘤广泛播散的重要原因，随访观察揭示，血循环中癌细胞阳性患者的生存期较短、预后显著较癌细胞阴性患者差。因此，检测血循环中的癌细胞不仅有助于正确的临床分期和疗效判断，而且对及时的抗转移治疗和改善患者预后也具有重要的应用价值。　　血循环中癌细胞的含量甚微，因而要求检测方法的敏感性高(通常需要从105白细胞中检测到一个癌细胞)和特异性好［3］。此外，最好能为临床提供定量的分析报告，如每升血中癌细胞的数量。迄今为止，能同时满足上述要求的检测方法尚不多见。本文应用流式细胞仪(Flow Cytometry,FCM)分析技术，以白细胞共同抗原CD45、上皮细胞标志细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)和肺癌特异性单抗为指标，建立了一种外周血肺癌细胞的定量分析方法。现报道如下。
材料与方法
　　1.抗体　FITC标记的小鼠同型IgG、抗人CD33单抗、CD45单抗和PE标记的小鼠同型IgG、抗人CD45RO单抗、CD53单抗、以及PE标记的Strep-avidin(PE-SVA)购自美国PharMingen公司。FITC标记的抗人Pan-cytokeratin单抗、PE-CY5(PC5)标记的小鼠同型IgG、抗人CD45单抗购自法国Immunotech公司。 生物素化抗人小细胞肺癌单抗2F7和肺腺鳞癌单抗S5A10-2由上海肿瘤研究所制备［4，5］。　　2.细胞系　小细胞肺癌细胞系NCI-H446和肺腺癌细胞系A549购自中科院上海细胞所。肺腺癌细胞系SPC-A1和大细胞肺癌细胞系SPC-L1由上海市胸部研究所建系。所有细胞均培养在含10 %胎牛血清(FCS，美国Hyclone公司产品)的RPMI 1640培养液(美国GIBCO BRL公司产品)中传代培养。　　3.病例选择　月间在本院收治的肺部疾患47例，年龄为36～80岁，平均60岁。入选患者中40例经细胞学或病理学证实为非小细胞肺癌，其中22例接受外科手术治疗，18例接受化疗。7例为肺部良性疾患，包括气胸3例，肺结核伴胸水3例，肺源性心脏病1例。正常人15例均为上海市胸部肿瘤研究所工作人员。　　4.标本采集及处理　非手术患者抽取5 ml外周血，肝素抗凝；手术患者在术中结扎肺静脉后，在近端肺静脉中抽取5 ml血，肝素抗凝。血样经Ficoll分离液(本所自配)离心2 300 rpm 30 min后收集界面细胞，用生理盐水洗涤1次，重悬于1 ml磷酸缓冲液(PBS，内含0.01 % NaN3和20 % FCS)中，采样经血细胞计数仪计数，记录白细胞数(LKC，单位：106/ml)。其中5例患者在术后取肺癌组织制成单细胞悬液，按上述方法离心处理。　　5.抗体标记　取1～2×106细胞，离心后重悬于0.1 ml PBS中，加入20 μl PC5-CD45和10 μl生物素化2F7/S5A抗体(0.2 mg/ml)，20 ℃温育10 min，加入10 μl PE-SVA继续温育20 min。生理盐水离心洗涤后，细胞经IntraPrep A液(法国Immunotech公司)4℃固定过夜。次日用生理盐水离心洗涤细胞1次，用IntraPrep B液通透5 min后，加入20 μl FITC-CK抗体20℃标记30 min，生理盐水离心洗涤2次，上机分析。　　6.流式细胞仪(FCM)分析　标记样本经EPICS-XL流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司产品)分析，参照国际血液治疗和移植工程协会(ISHAGE)推荐的方法分析CD45- CK+ 2F7/S5A+细胞［6］。简述如下：(1)以侧向散射(SS)对CD45-PC5作二维散点图，设A门；(2)取A门细胞，以SS对CK-FITC作二维散点图，选择CK+细胞设B门；(3)取B门细胞，以SS对CD45-PC5作二维散点图，选择CD45-细胞设C门；(4)取C门细胞，以SS对2F7/S5A-PE作二维散点图，选择2F7/S5A+细胞设D门；(5)分别记录A门和D门内细胞数。各阶段均以同型抗体染色作为阴性对照。
　　正常人外周血经Ficoll梯度离心后回收率(即从Ficoll界面收集的细胞数与白细胞总数的比值)约为10 %，此类细胞主要是单核细胞，FCM分析(见图1)证实其表达单核细胞相关抗原CD33(阳性率90 %)和CD45RO(阳性率86 %)，以及白细胞共同抗原CD45(阳性率100 %)和CD53(阳性率80 %)。但这些细胞不表达肺癌特异性单抗2F7和S5A所识别的抗原，也不被CK特异性单抗染色(见图2)。
图1　外周血单核细胞的表型分析正常人外周血经Ficoll离心收集单核细胞，然后分别用荧光素标记抗体染色，FCM分析。
图2　单核细胞和肺癌细胞的表型分析Ficoll分离的单核细胞(PBMC)、小细胞肺癌细胞系NCI-H446和大细胞肺癌细胞系SPC-L1分别用FITC-CD45、FITC-CK和2F7/S5A-PE标记及同型对照抗体染色(略)，FCM分析。
　　四系肺癌细胞在相同的Ficoll分离条件下，回收率均高于95 %，图2显示二个肺癌细胞系经抗CK和2F7/S5A单抗染色后，阳性率均在97 %以上，但CD45抗体染色阴性。　　因此，将CD45(PE-CY5标记)、CK(FITC标记)和生物素化2F7/S5A(SAV-PE标记)单抗组合，能够特异性地区别白细胞和肺癌细胞。图3显示，正常人白细胞经抗体染色标记并经FCM序贯设门(Gating)后，不能检测到CD45- CK+ 2F7/S5A+细胞(见图3A)；而小细胞肺癌细胞系NCI-H446经过同样分析，90 %以上为CD45- CK+ 2F7/S5A+细胞(见图3B)，用非小细胞肺癌细胞系如SPC-L1、SPC-A1和A549进行分析也获得相同结果。此外，从非小细胞肺癌手术标本分离的细胞中，也可以清楚地分辨出癌细胞和浸润的白细胞，CD45- CK+ 2F7/S5A+细胞比例达到47.7%(见图3C)，表明不仅肺癌细胞系，而且肿瘤组织中的肺癌细胞均表达CK和2F7/S5A所识别的抗原。
图3　外周血中肺癌细胞的FCM分析外周血PBMC(A)、NCI-H446细胞(B)、非小细胞肺癌手术标本(C)和PBMC：SPC-A1(104∶1)混合细胞(D)分别经PC5-CD45，2F7/S5A-PE和CK-FITC染色，FCM分析，见材料与方法。
　　将非小细胞肺癌细胞SPC-A1按不同比例加入外周血中，然后检测其中的癌细胞含量，图3D结果表明，应用本方法可以将白细胞与混杂的肺癌细胞区分开来。表1结果显示此方法能检测的肺癌细胞最低频率约为10-6，相当于1 ml外周血中存在5个肺癌细胞，但此时的检出值约为掺入值的1倍，提示所得结果尚存在一定误差。然而，在10-5～10-3频率范围内，检出的癌细胞数与掺入的癌细胞数基本一致。
表1　外周血中肺癌细胞检测的敏感性评估
癌细胞频率
癌细胞数量
　　5 ml外周血中掺入指定数量的肺癌细胞后，分离PBMC并用荧光素标记抗体染色和FCM分析，计算检出的癌细胞数量，详见材料与方法。
　　进一步检测15例正常人、7例肺部良性疾患和40例肺癌外周血，发现正常人外周血中CD45- CK+ 2F7/S5A+细胞最高值为22/5万细胞，而肺部良性疾患者外周血中上述细胞量为25/5万细胞，因此，若按平均值±2个标准差(即≤30/5万细胞)作为正常值，则正常人和肺部良性疾患均为阴性，而35 %(14例/40例)肺癌患者外周血可检测到癌细胞，其含量从0.01×106/L至0.18×106/L不等，平均为0.10±0.06，即每升血中含十万肺癌细胞(见表2)。此外，22例外科手术的肺癌患者之肺静脉血中，9例(41%)发现肺癌细胞，阳性率明显高于非手术患者的外周血(5/18例，28%)。
表2　外周血肺癌细胞的流式细胞仪分析
血标本来源
CD45- CK+ 2F7/S5A+细胞
阳性细胞数
肺部良性疾患
0.10±0.08
其中：术中肺静脉血
0.10±0.05
　　　非手术病人外周血
0.09±0.05
　　检测肿瘤患者外周血循环中的癌细胞是目前颇受关注的一项诊断新技术，具有广泛的临床应用价值。但其可信度如何主要取决于检测方法的敏感性和特异性。一般认为，外周血中癌细胞含量甚微，但由于缺乏定量分析方法，尚难以估计血液中癌细胞含量的确切数据。对这些细胞目前多采用Rt-PCR进行分析(敏感性约为从105～106白细胞中发现1个癌细胞)，主要的观察指标是PBMC中存在细胞角蛋白(CK)mRNA。但也有若干FCM的研究报道［7～11］。然而，以CK单一指标作为判断存在癌细胞的标准，会产生假阳性结果，因为正常白细胞也表达某些CK(如CK-19) mRNA。将白细胞共同抗原CD45与CK组合，采用FCM方法可以排除大部分假阳性细胞(即CD45+CK+细胞)，但无法区分血液中的良性和恶性上皮细胞(均为CD45-CK+细胞)。也就是特异性问题还没有得到解决。　　解决上述问题的理想途径是在CD45/CK组合的基础上，增加一项肿瘤特异性指标。但迄今为止，只有在前列腺癌等少数肿瘤中能做到这一点，如前列腺癌细胞表达前列腺特异性抗原PSA。本文试图建立一种外周血肺癌细胞的定量检测技术。实验结果达到了预期目的，证明应用本方法最低可以从106血细胞中发现一个肺癌细胞。主要有二点，一是利用癌细胞和正常血细胞的密度差异，通过简单的Ficoll梯度离心去除了90 %以上的白细胞(如淋巴细胞和粒细胞)，使敏感性提高了一个数量级。二是将外周血CD34+造血干细胞定量检测技术移植到本系统中，进一步排除了假阳性干扰并获得定量的分析结果。国际血液治疗和移植工程协会(ISHAGE)推荐用序贯设门(Gating)方法排除假阳性细胞。据此可从外周血白细胞中找出0.01 %量的CD34+细胞，并能计算出总的CD34+细胞数量。本文将该方法的原理应用到外周血肺癌细胞的检测之中，并增加特异性单抗标记，使之能选择性识别肺癌细胞，其结果是可信的。　　应用上述方法分别分析了正常人、肺部良性疾患和肺癌病人的外周血标本，初步结果提示，35 %肺癌患者血液中存在癌细胞，此数值与台湾学者最近的报道吻合。此外，41 %肺癌患者在术中阻断血流后，其近端肺静脉中出现肺癌细胞，提示这些患者在接受外科手术后体内出现微量癌细胞播散，其含量约为1×106/L。这些微量癌细胞播散可能是术后肿瘤复发转移的重要原因。　　综上所述，本文报道了一种敏感性高、特异性好的外周血肺癌细胞定量分析方法。应用本方法能够区分外周血中的正常白细胞和肺癌细胞，发现35 %肺癌患者的外周血中存在癌细胞。初步结果提示，应用本方法有可能早期发现肺癌细胞的血源性播散，为有效控制肿瘤复发转移创造条件。但本方法的临床价值尚需进行大量深入的研究才能确认。■
基金项目：获上海市医学发展基金重点项目资助作者简介：董强刚，男，博士，副教授，硕士导师。作者单位：董强刚（上海市胸科医院、上海市胸部肿瘤研究所，上海，200030）　　　　　江晓丰（上海市胸科医院、上海市胸部肿瘤研究所，上海，200030）　　　　　沙慧芳（上海市胸科医院、上海市胸部肿瘤研究所，上海，200030）　　　　　李鲁萍（上海市胸科医院、上海市胸部肿瘤研究所，上海，200030）　　　　　乔生军（上海市肿瘤研究所）　　　　　许凯黎（上海市肿瘤研究所）
参考文献：
［1］Peek K, Sher YP,Shih JY, et al. Detection and quantitation of circulating cancer cells in the peripheral blood of lung cancer patients〔J〕.Cancer Res,):2761［2］Yeh KH,Chen YC,Yeh SH, et al. Detection of circulating cancer cells by nested reverse transcription-polymerase chain reaction of cytokeratin-19(CK19)——possible clinical significance in advanced gastric cancer〔J〕. Anticancer Res,B):1283［3］Funaki NO,Tanaka J,Ohshio G, et al. Cytokeratin 20 mRNA in peripheral venous blood of colorectal carcinoma patients〔J〕. Br J Cancer,):1327［4］张瑞鉴，李斯德.三株肺癌单抗混合血清测肺癌的价值〔J〕.肿瘤，)：281［5］洪锦心，张欣，魏明辉，等.抗原分子量50-kD和40-kD的人体小细胞肺癌单克隆抗体〔J〕.肿瘤，)：248［6］Gratama JW,Orfao A,Barnett D, et al. Flow cytometric enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells〔J〕. Cytometry,［7］Simpson SJ,Vachula M,Kennedy MJ, et al. Detection of tumor cells in the bone marrow,peripheral blood,and apheresis products of breast cancer patients using flow cytometry〔J〕. Exp Hematol,):1062［8］Planz B,Szyska P,Valdor M, et al. Detection of circulating prostatic cells during radical prostatectomy〔J〕. Urol Res,):385［9］Krismann M,Todt B,Schroder J, et al. Low specificity of cytokeratin 19 reverse transcriptase-polymerase chain reaction analyses for detection of hematogenous lung cancer dissemination〔J〕. J Clin Oncol,):2769［10］Dingemans AM,Brakenhoff RH,Postmus PE, et al. Detection of cytokeratin-19 transcripts by reverse transcriptase-polymerase chain reaction in lung cancer cell lines and blood of lung cancer patients〔J〕.Lab Invest,):213［11］Jung R,Kruger W,Hosch S, et al. Specificity of reverse transcriptase polymerase chain reaction assays designed for the detection of circulating cancer cells influenced by cytokines in vivo and in vitro〔J〕. Br J Cancer,):1194［12］Brandt B,Junker R,Griwatz C, et al. Isolation of prostate-derived single cells and cell clusters from human peripheral blood〔J〕. Cancer Res,):4556
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人肺腺癌细胞SPC—A1与人胚肺细胞WI—38对纳米颗粒吞噬作用的研究
摘　要：目的探讨人肺癌细胞及胚肺细胞对氨基硅烷纳米Fe3O4颗粒的吞噬行为的生物学特性及二者之间吞噬特性的差异.方法分别培养肺腺癌细胞株SPC-A1及人胚肺细胞株WI-38至对数生长期,更换为分散有氨基硅烷纳米Fe3O4颗粒的培养液,经培养1、3、6 h,分别取所培养的细胞进行超微结构观察.另取培养6 h的部分SPC-A1细胞传代培养,并对每一代细胞作超微结构观察.结果培养1 h氨基硅烷纳米Fe3O4颗粒即已能进入癌细胞SPC-A1的细胞质,培养至6 h已见有大量颗粒成簇进入细胞质内.然而,在同一的条件下,培养6 h后仍未观察到氨基硅烷纳米Fe3O4颗粒进入WI-38细胞.经吞噬了氨基硅烷纳米Fe3O4颗粒的SPC-A1肺癌细胞传至10代后仍生长良好,且在第7代仍然能观察到细胞内存在纳米颗粒并且未出现团聚现象.结论在同一细胞培养的条件下,肺癌细胞SPC-A1明显地比胚肺细胞WI-38更易吞噬氨基硅烷纳米Fe3O4颗粒,且前6h内未观察到纳米颗粒进入WI-38细胞.凡进入癌细胞内的纳米Fe3O4颗粒具有良好的生物相容性并在细胞中停留数代之久且保持良好的分散状态.根据本实验研究的结果进一步提示采用Fe3O4纳米颗粒将开拓一条颇有潜在性价值的纳米颗粒对肿瘤治疗的临床应用途径.
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这个帖子发布于3年零0天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
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我是重医的
重庆的同胞有谁正在培养肺癌细胞SPC-A1的吗
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ruanjunsky 我是重医的
重庆的同胞有谁正在培养肺癌细胞SPC-A1的吗我们实验有这种细胞，可以有偿提供
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ruanjunsky 我是重医的
重庆的同胞有谁正在培养肺癌细胞SPC-A1的吗在广州的可以寄到重庆！！
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pearli24 本人是武汉大学的学生，武汉的同胞有正在培养肺癌细胞SPC-A1和人正常肺支气管上皮细胞的吗？我的实验急需这两种细胞，但怕在商家购买的细胞不可靠，如有同仁有多余能赠送的本人万分感激。请问楼主现在还有这两种细胞么？
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人肺腺癌细胞SPC-A1
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简介：本公司为您提供：人肺腺癌细胞SPC-A1，公司主营菌种，细胞，抗体，试剂，耗材，实验室常用设备等，更多信息请咨询在线客服：71
产品名称：人肺腺癌细胞&SPC-A1规格：70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶特点：细胞代数为4-5代左右包装：内层无菌自封袋；专用防压泡沫盒；外层防压保温气泡袋；说明书细胞来源：ATCC、sciencell、ICLC货期：1-2周运输方式：快递运输售后：收到细胞后7天，如发现细胞有质量问题（如污染，死亡，快递运输等原因）时，应出具书面质量问题报告并及时传真或E-mail致销售人员，我们将尽快为您解决。细胞培养常见问题分析细胞培养1、冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后， 须立即放入37 ℃水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。2、细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS （calf serum） 则是指小牛血清。HS （horseserum） 则是指马血清。6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。7、何时须更换培养基？视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。8、培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于&20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。10、悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。11、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg （约1,000rpm），5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。12、细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。13、细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。14、DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4&C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。15、冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃ 30~60 分钟& （-20 ℃30 分钟*） & -80 ℃16~18 小时（或隔夜） & 液氮槽vaporphase 长期储存。冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃ 至&80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 ℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。15、细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。16、应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。17、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。18、支原体（mycoplasma） 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。19、支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。20、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？定期（至少每两周一次） 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。21、为何培养基保存于4 ℃ 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？培养基保存于4 ℃ 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenol red） 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。22、各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。23、购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？ 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于&80℃太久。24、收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧 。25、如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。27、GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。28、什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。29、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。30、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。31、书上说，Hank&s 平衡盐溶液（HBS）要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank&s 平衡盐溶液（HBS）和Earle&s平衡盐溶液（EBS）有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L） 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。血清&
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