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96T/48T大鼠肺表面活性物质相关蛋白A（SP-A）ELISA试剂盒
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公司名称：
上海邦奕生物科技有限公司
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简单介绍：
中文名称：大鼠肺表面活性物质相关蛋白A（SP-A）ELISA试剂盒英文名称：Rat Pulmonary surfatcant-associated protein A
ELISA Kit 产品规格：96T/48T试剂盒包被板，蛋白标准品，检测抗体由国外实验室生产，其他辅助产品由国内生产。属于科研产品，不得用于临床，欢迎新老客户前来订购。
中文名称：大鼠肺表面活性物质相关蛋白A（SP-A）ELISA试剂盒英文名称：Rat &&Pulmonary surfatcant-associated protein A&&&ELISA Kit&&产品规格：96T/48T保存条件：2-8℃有效期：6个月标本收集 注意事项：1）在收集标本前都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。2）我们提倡新鲜标本尽早检测，对收集后及时进行检测。说明：样品类型： 标本必须为液体，不含沉淀。包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织匀浆等。1ml的全血可得到0.5ml的血清 或血浆。每个标本量收集体积＝100ul&检测种类。样品采集： 收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天进行检测的标本，储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本， 将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。避免反复冻融。标本2-8℃可保存48小时，-20℃可保存1个月。-70度可保存6个月。部分激素类标本需添加抑肽酶。四、液体类标本：包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。1）血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。2）血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。3）尿液：用无菌管收集。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。4）细胞培养上清：A、检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（转/ 分）。仔细收集上清。B、检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并 放出细胞内成份。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5）组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。Elisa试剂盒标本要求1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。ELISA试剂盒操作步骤方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.　包被：用0.05MPH9.短妓嵫伟换撼逡航固逑∈椭恋鞍字屎课1～10&g／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。& 4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以&+&、&-&号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。&方法二　用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10&g／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。&加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）&于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。仅供参考，以随货说明书为准.
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&&& 肾脏缺血再灌注损伤（ischemia and reperfusion injury，IRI）常发生于肾脏手术如肾移植、肾部分切除、肾血管成形术等，是急性肾衰竭的主要原因之一[1]。姜黄素是从我国传统植物姜黄中提取的生物成分，具有抗炎、调脂等作用，最近研究显示，其对大鼠心肌、肝、肾的IRI均有保护作用，其机制与减轻凋亡、抑制炎症等有关。Toll样受体是一类广泛存在的模式识别受体，有文献报道Ⅰ型跨膜蛋白TLR4激活的炎症反应与肾脏IRI有关[2] 。本研究观察姜黄素对肾脏缺血再灌注组织内TLR4表达的影响，并进一步探讨其发生机制。
&&& 1 材料与方法
&&& 1.1 材料 选择健康雄性Wistar大鼠36只，体重200～280g，由武汉大学医学院实验动物中心提供，TLR4、&-actin单克隆抗体购自Santa Cruz公司。姜黄素购自武汉中西仪器大全公司，含量＞90%。
&&& 1.2 实验模型的制备 36只大鼠常规喂养，术前禁食12h。随机分为假手术组、缺血再灌注组、姜黄素组，每组各12只。3组均予2%戊巴比妥钠（45mg/kg）腹腔麻醉，500U肝素钠腹腔注射，游离双侧肾脏，切除右肾。假手术组直接缝合腹壁；缺血再灌注组在右肾切除、左肾游离后进行左肾缺血试验，将左肾动、静脉用血管钳夹闭45min后恢复灌流；姜黄素组于左肾动、静脉夹闭前30min行尾静脉注射姜黄素注射液（20mg/kg），余实验过程同缺血再灌注组。
&&& 1.3 标本采集与处理 分别于再灌注24h后静脉采血2ml检测血肌酐（Cr）、尿素（BUN）水平。后处死各组大鼠，留取左肾组织标本，一部分速置-80℃冰箱保存待测，余用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后制备切片。
&&& 1.4 观察指标
&&& 1.4.1 Cr、BUN浓度测定：将血液标本注入试管中，常温下3000r/min离心10min后，用奥林巴斯公司Au2700 全自动生化分析仪测定血清Cr、BUN浓度。
&&& 1.4.2 组织学检查：固定的肾组织制备石蜡切片后行HE染色，在奥林巴斯200倍光镜下观察其病理改变。
&&& 1.4.3 免疫印迹（Western blotting）法检测TLR4表达：从液氮罐中取出保存后的肾组织，BCA法检测蛋白浓度，取40&g/lane上样，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电转到硝酸纤维素膜NC膜上，用5%脱脂牛奶封闭2h，后加入TLR4单克隆抗体，按1∶1000稀释，4℃摇床过夜。再与辣根过氧化物酶结合的二抗结合，按1∶2000稀释，室温孵育1h，TBST洗涤后ECL法显色照相。
&&& 1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计学软件进行数据处理。计量资料以均数&标准差(&s)表示，多组间比较采用F检验，两组间比较采用t检验，以&=0.05为检验水准。
&&& 2 结果
&&& 2.1 各组Cr和BUN水平 缺血再灌注组和姜黄素组Cr和BUN水平明显高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，姜黄素组的Cr和BUN水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。
图1 假手术组、缺血再灌注组和姜黄素组血肌酐和尿素水平比较
&&& 注：与假手术组比较，aP＜0.05；与缺血再灌注组比较，cP＜0.05
&&& 2.2 肾组织病理学改变 假手术组光镜下见肾小管上皮细胞无明显改变，间质无明显充血水肿及炎性细胞浸润。缺血再灌注组见肾小管上皮细胞明显变性坏死，管腔扩张，内有脱落坏死细胞，刷状缘脱落明显，间质内有充血水肿及炎性细胞浸润。姜黄素组见部分近曲小管细胞轻度水肿样变性，偶见管型。
&&& 2.3 肾组织中TLR4蛋白变化 Western blotting法检测结果显示，假手术组大鼠肾组织内有少量的TLR4蛋白表达，而缺血再灌注组和姜黄素组的TLR4水平明显高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与缺血再灌注组比较，姜黄素组TLR4表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
&&& 3 讨论
&&& Toll样受体是一类能识别外源性微生物和内源性配体的跨膜受体，其以细胞内高度进化保守的TLR结构域为主要特征[3] 。TLR受体可启动免疫和炎性反应，在无外源性感染的IRI中起重要作用[4] 。TLR4是已发现的13种Toll受体中的一种，在人类所有细胞包括肾小管上皮细胞中表达，在TLR家族中占有十分重要的地位[5] 。Chong等[6]应用TLR4缺陷型小鼠观察TLR4在心肌IRI中的作用，发现与野生型小鼠相比，TLR4缺陷型小鼠梗死区域减少了40%，证实TLR4可能介导心肌IRI炎性反应的理论。TLR4可通过启动核内相关基因，增加炎性因子（TNF-&、IL-1&、IL-6）及&干扰素(IFN&)等细胞因子的表达，促进单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和中性粒细胞趋化因子IL-8的聚集，引起毛细血管通透性增高，粒细胞、巨噬细胞趋化聚集等炎性反应，从而参与肾脏IRI[7]。肾脏IRI是众多复杂机制相互作用的结果，常发生于肾移植、保留肾单位手术（NSS）、肾积水、肾动脉狭窄、栓塞性疾病、主动脉搭桥手术、意外或医源性损伤等，与促炎因子释放、中性粒细胞浸润和氧自由基产生等有关[8] 。
&&& 姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种酚类色素，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理学作用，能够直接或间接地保护机体细胞免受有害因素的损害，维持细胞正常的新陈代谢和生理功能，从而实现保护作用。由于姜黄素活性广泛，安全有效，因此极具临床开发前景。近年来的国内外研究发现姜黄素对心肌、脑、肾等脏器的IRI均有保护作用[9] ，但缺乏对其分子保护机制的深入探讨。为探究姜黄素对肾脏IRI的保护机制，本研究构建了大鼠肾脏IRI模型，观察姜黄素对肾脏IRI的作用，并用Western blotting法检测TLR4的表达。结果表明，姜黄素组Cr和BUN水平均低于缺血再灌注组，差异有统计学意义，说明姜黄素对肾脏IRI有保护作用。本研究组织病理学检查也显示，缺血再灌注组的肾小管上皮细胞明显变性坏死，管腔内有脱落坏死细胞，间质内有充血水肿及炎性细胞浸润，而姜黄素组的细胞损伤明显轻于缺血再灌注组。Western blotting检测结果显示，缺血再灌注组和姜黄素组的TLR4水平明显高于假手术组，差异有统计学意义；姜黄素组TLR4表达水平显著低于缺血再灌注组，差异有统计学意义。
&&& 综上所述，姜黄素预处理可保护肾脏IRI，其机制可能是抑制缺血再灌注肾组织内TLR4受体表达，从而抑制之后的一系列炎症级联反应，减轻肾脏IRI。
&&& 来源：王磊.临床误诊误治,)096.
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