我妈52岁，今年7月中下旬这样查出胃癌，是印戒细胞癌，恶性肿瘤，扩散的很快，现在吃不了饭，每天禁食，已经一个月了，7月27号动的手术，医生说送来的太晚了，胃跟肠子全都粘在一起了，分也分不开，只能在胃跟肠子里接两根管子，做多能活三个月，但是到现在为止我妈也没有一天好转，情况一天比一天差，连讲话的力气也没有，我妈在杭州浙二医院动的刀，现在还住着院，我的姐姐去杭州其他的大医院、肿瘤医院都问过了，那里的医生也没有办法，预约了上海肿瘤医院在下下个礼拜，怕时间太久，因为我妈现在真的一点时间都拖不了了，所以想在这问问，有没有好心人帮帮忙，拜托了，医生说我妈这种情况可能会不了家了，吃不了饭只能每天在医院打营养液，我知道我妈治不好了，我只希望我妈能回家治疗，延长点寿命，最希望的是能回家。
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　　这是我的妈的病例　　
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　　建议了解下：好医生慷复新美洲大蠊精粉，我做这个，但是不可以跨区域销售，我们这边很多病人都在诊所打针了，了解到后，试试看的态度试服后一直在用，效果还行！反正几天就知道有没有效果，也不用花很多钱，不耽误你其他治疗，可以试下！也可以加我Q:8228700了解下。买还是找当地的买。1、抗肿瘤作用2、提高免疫作用3、保肝作用4、促进组织修复作用5、抗炎、镇痛作用。一个病人60多了，医院判刑了，家里棺材等等都准备好了，亲戚朋友也都通知了。试了几天居然还能下地，都以为回光返照！一个月后拍片发现肿瘤小了，这药治不了癌症，但是可以抑制癌细胞生长发育，延长寿命，还有止疼作用。
　　是啊 ，很多病人手术台一上去，下来后就另外一个人了，但是现在普遍没有找到最直接有效的办法治愈癌症！能延长寿命就很不错了，建议病人家属不要期望太高，退而求其次就好，让病人寿命长些，活的体面些就好，一旦想治愈癌症，就陷入歧途，给骗子乘虚而入的机会，最后人财两空！要知道放疗化疗副作用相当大，医院那边我就嘿嘿了！
　　恩，方便留一下电话吗？联系交流具体情况，希望能帮助到一些。
　　今天医生下病危通知书了，说随时会走，没有征兆的　　
　　你别等着预约的了，你先看你要看病的那个医生最近的门诊是什么时候，你直接冲到门诊让他给你加号啊，不过，医生看病肯定要看到病人的，你想在上海看的话，最好还是让病人到上海　　
　　这两天我就把我妈转到我们那的医院，好好度过剩下的日子　　
　　医生说了我妈这个病已经没办法了，我们也跑了很多医院，医生的说法都是一样的，我们不想放弃也没办法了　　
　　我的妈妈已经去了，就在中秋节的前一天，也是回家的第一天　　
　　就在回家的前天晚上，妈妈突然对我说，等我回家，你就可以上班了，我说你现在这种情况我怎么上班啊，我还得照顾你，之后凌晨2、3点的时候我妈妈休克了，然后打电话给爸爸尽早接妈妈，于是早上7、8点这样回家了　　
　　本以为回家之后至少可以在住几天，没想到就在回家那天凌晨5：15就走了，还记得回家那天我妈妈一直在流血，出院前已打过止血盐水，原来那时候我妈就已经快不行了，连盐水都没用了　　
　　需要印度版靶向药的，可以来找我，全力帮助需要的人　　
　　今年春节真好是我妈的生日，好不容易可以凑到这么好的日子，可是妈妈却不在了　　
　　距离我妈妈去世已经半年多了，我经常会想起她，每次想起她我都很后悔，后悔她在的时候没有好好跟她聊天，没有陪她去逛街，没有给她买衣服，没有跟她学烧菜，没有把自己做的难吃的菜跟她一起分享，很多很多，以前我很讨厌妈妈，因为她很唠叨，很小气，很爱计较，是典型的刀子嘴豆腐心，她经常跟你说了没几句就跟你吵了起来，其实也不是吵，我妈说话比较大声，她一大声说话就好像跟别人吵架似的，因为我妈这一点，我很不喜欢跟她聊天，经常她问我话我是爱理不理的，我很讨厌跟她解释，总觉得跟她讲不清楚，，久而久之，我不止是讨厌跟她讲话了，还有点嫌弃，不喜欢跟她一块看电视，因为她总跟我说话，害我不能认真看电视，我是一看电视就不喜欢被人打扰的，我就转身离开，我感觉妈妈有那么一点失落，但我还是回到我房间里去了，没有理她，现在想想真的很后悔，为什么当时没有跟妈妈好好的聊天
　　这两天我爸爸每天上山采茶叶，每天早上登完山然后去采茶叶，采到下午五点，接着在回家炒茶叶，接着在做饭等我回家，晚上我一到家，爸爸就跟我说今天采了茶叶，给我看他做好茶叶泡的茶，还让我闻闻香不香，我说很香，我还问他了怎么也去采茶叶，以前妈妈去采茶叶他还说妈妈呢，说有什么用，爸爸说以前你妈妈会采啊，现在就我自己采了，还说今天登山的时候看到好多茶叶，就想去采，原来我爸爸也习惯泡我妈妈采茶叶炒的泡的茶了，他每天都在喝我妈妈以前自己摘来炒的茶叶，但是我都没在喝，我一直想喝一下妈妈炒的茶叶，但一直都没去喝，今天晚上我就回家泡茶喝
　　我的帖子都没人看了啊，只能我自己抒发下情感了　　
　　@听见下雨的声音28
11:34:00　　我的帖子都没人看了啊，只能我自己抒发下情感了　　-----------------------------　　我在看。望你节哀。
　　@听见下雨的声音28
11:34:00 　　我的帖子都没人看了啊，只能我自己抒发下情感了 　　-----------------------------　　@正直良心-22 20:39:00 　　我在看。望你节哀。　　-----------------------------　　????　　
　　今天我果然又没有泡茶叶喝，今天一下班就回家吃了个饭然后就去朋友家了，哎，我每次都说话不算话诶　　
　　@听见下雨的声音28
22:53:00　　今天我果然又没有泡茶叶喝，今天一下班就回家吃了个饭然后就去朋友家了，哎，我每次都说话不算话诶　　-----------------------------人往往是拥有的时候不珍惜，等失去了才知道可贵，不过你还有个老父亲呢，你还是很幸福的多陪你老爸说说话，
　　是啊，所以现在我很珍惜跟我爸爸在一起的时间，虽然有时候跟他说话还是会不耐烦　　
　　朋友节哀，一切都会好的！一切都是缘
　　记得我妈在杭州动完手术之后，医生说我妈的病没办法了，动了手术也没用，后来我和姐姐就想各种办法来缓解我妈的病，就跑中医院找专家看病，专家给开了中药，说是可以抗癌的，我们就拿给妈妈喝了，我妈那时候只能喝流质的东西，我们就把药捣碎碾成粉，一天给她喝三次，再给她喝那种熬好的中药，我妈愣是一口气的全喝了，那要非常非常难喝，但是喝好多天了，一点效果都没有，病情还是越来越严重，我们那时候真的很无助，我就想到我朋友她们家是信佛的，她姑姑是住在寺庙里的，她以前跟我说好多人得了重病都是找她姑姑看好的，包括她身边的亲戚也是，得了癌症都治好了，我想着要不要去找她姑姑试一试，我就跟姐姐说了，姐姐说可以啊，也想试试，但是后来一想到老爸肯定不会同意的，他不信的，而且我奶奶是基督教的，更不会同意　　
　　后来有一天我中午在外面买饭的时候碰到一个尼姑她给了我一想护身符，说是开过光的，我就接过来看了我一下，她接着跟我说这个符可以保你平安，身体健康的，然后就拿出一张纸给我看，说是功德簿，上面都写了谁谁谁捐了多少钱，我一听是要钱的，就觉得是骗子，我就不想要了，我就打算把那护身符还给她，她说送出去的就不能拿回来否则不吉利的，要是以前我肯定不会要的，但是万一我妈真能好呢，就拿了10块钱给她，当时身上只有那么多钱了，然后在她那个功德簿上写了我妈的名字，到了病房以后，我就偷偷的把她塞在我妈的枕头里，我妈要是知道了肯定不要，因为我奶奶是信耶稣的，虽然我妈不是很信耶稣，但是也受我奶奶的影响，就不信佛的　　
　　我想问下万能的网友，我想学吉他，初学者买怎样的吉他好啊，要性价比高的，实惠的　　
　　今天是母亲节，祝我在天堂的妈妈节日快乐，昨天下班之后去花店买了一束花，准备今天去山上送给妈妈，结果，今天一早就被我爸拆了放在花瓶里，不过是放在妈妈照片前面的，就算了，也没有说爸爸，今天只能空手去看我妈妈啦，妈妈你一定知道我的心意的吧，爱你哟，妈妈　　
　　上寺庙。请一本21度母赞。小声念。大人虔诚念诵度母心咒。忌五辛。忌烟酒肉。莫心外求法。莫向外求。莫攀缘。破魔恼。这是禁忌。咒不离口。信心。信念。/不要相信任何人。千万别犯禁忌　　
　　@刘与利
17:35:00　　上寺庙。请一本21度母赞。小声念。大人虔诚念诵度母心咒。忌五辛。忌烟酒肉。莫心外求法。莫向外求。莫攀缘。破魔恼。这是禁忌。咒不离口。信心。信念。/不要相信任何人。千万别犯禁忌　　-----------------------------　　我的妈妈信耶稣，不信佛喔　　
　　妈妈，今天想起了你，去拿出了以前的老照片和你住院之后的照片来看，感叹时间过得好快啊，年轻的你多么漂亮，虽然那时候只有黑白照，看着你的照片我突然好想知道你离开了我们之后是以什么样的方式存在在这个世界上，还是你不在这个世界了，还是你真的去天堂了，如果可以，我希望你是以另一个方式去享福了，去享受你以前没有感受到过的快乐　　
　　妈妈，明天是端午节，姐姐和姐夫还有右右要回来了，到时候去看你哦　　
　　妈妈，端午节快乐，吃粽子呦，现在坐等姐姐、姐夫还有右右回来　　　　
　　祝我的爸爸父亲节快乐，天天开开心心的！！！　　
　　妈妈，现在爸爸每天礼拜天晚上都会去教堂，每次去手上都拿个小包，好像要去上学一样。　　
　　妈妈，我有车了，我终于有了一辆自己的车，虽然是辆二手车，但我觉得挺好的，爸爸跟我一起去看的车，他给我付的钱，他比我还兴奋，他说以后有空了就可以去奶奶家了，还可以去看姐姐了，还说以后自己要开车去钓鱼呢，妈妈，以前我常想要是我有车了，我就带你到处去兜风，你一定会跟街坊邻居到处炫耀的，我总能想到那个画面，白天你很开心的坐着我的车到处兜风，晚上出去跳广场舞的时候，去跟你的同伴炫耀，妈妈，我记得以前还有人在家门口等你，跟你一起去跳广场舞的，这些记忆好像跟昨天发生过一样，可转眼已经1年多了，原来你离开我们已经好久了，时间过的好快啊　　
　　有时候我真的挺没心没肺的，一点都不想你，可有时候一想你，就忍不住红了眼睛，无论在什么场合，搞得自己怪尴尬的，有时候，又觉得现在的生活也挺好的，爸爸过的比以前自在，洒脱，姐姐有了自己的家庭，我过的也很知足，可有时候，又觉得对不起你，我们幸福了，可你不在了，我们过上好日子了，可你不在了，虽然不是什么大富大贵的日子，但也不愁吃喝，以前，你总要为柴米油盐这些而烦恼，为我们省下这些钱，还总是不理解你，跟你吵架，我很后悔始终没有让你过上好日子　　
　　妈妈，我虽然有车了，可我的车技很差，我倒车停车怎么都挺不好，总是停的歪歪扭扭的，一点方向感都没有，每次开回家，都会觉得好幸运没出什么事　　
　　妈妈，前段时间，爸爸和姐姐都跟我说晚上梦到了你，可是我没有诶，爸爸还说我没良心的，都说日有所思，夜有所梦，说我一点也不想你，那时候我觉得好委屈，我怎么没想你啊，可是那段时间我真的没怎么想你，我也在心里想，为什么爸爸和姐姐都梦见你了，我就没有呢，我是不是真的没良心，一点也不想你，所以你不来我的梦里，我也想见见你啊　　
　　妈妈，一想你真的是停不下来了，一直回忆以前，好有感触，眼睛越来越红，可是我现在还在上班呢，不能太明显，一直用各种动作来掩盖，想想又觉得好搞笑　　
　　有时候，人真的是很奇怪的动物，这些话我可以在这里畅所欲言，也可以跟大家分享，但是我却不会在我的家人、朋友面前透露半句，也不喜欢他们看到我这里的留言，这是为什么呢　　
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　　刚刚真的忍不住了，去厕所发泄了一通，思念如泉水般涌来怎么也止不住，可是发泄完了，我整个人也好多了，那一瞬间我的烦恼都没有了　　
　　妈妈，青青快要生了，她昨天开始有阵痛了，预产期也是这几天了，在你走的这一年里，她都结婚生子了，是不是很快，你要是还在的话，一定也很开心吧，然后催着我找对象，给我介绍对象，可惜你以后参加不了我的婚礼了，也看不到我生孩子了……对了，姐姐已经怀二胎了，也有4个多月了，你猜这胎是男是女呢……　　
　　妈妈，青青今天凌晨三点多生了个女儿，6.9斤，很健康，姐姐说她以后一定很白，我也觉得……　　
请遵守言论规则，不得违反国家法律法规回复(Ctrl+Enter)刘晓飞, 刘娟, 田蕾, 陈芳敏, 杨雅琳, 张小平
LIU Xiao-Fei, LIU Juan, TIAN Lei, CHEN Fang-Min, YANG Ya-Lin, ZHANG Xiao-Ping
美洲大蠊成虫肠道可培养细菌多样性研究
Diversity of culturable bacteria isolated from Periplaneta americana adult gut
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刘晓飞, 刘娟, 田蕾, 陈芳敏, 杨雅琳, 张小平. 美洲大蠊成虫肠道可培养细菌多样性研究[J]. 微生物学通报, ): .
LIU Xiao-Fei, LIU Juan, TIAN Lei, CHEN Fang-Min, YANG Ya-Lin, ZHANG Xiao-Ping. Diversity of culturable bacteria isolated from Periplaneta americana adult gut[J]. Microbiology China, ): .
美洲大蠊成虫肠道可培养细菌多样性研究
刘晓飞, 刘娟, 田蕾, 陈芳敏, 杨雅琳, 张小平
四川农业大学 资源环境学院 微生物系　四川 成都　611130
基金项目: 国家863 计划项目(No. -05).
通讯作者: 张小平, E-mail:
摘要: 【目的】了解美洲大蠊成虫肠道可培养细菌的多样性。【方法】运用纯培养法、数值分类和16S rRNA基因序列的系统发育分析对样品中可培养细菌多样性进行研究。【结果】从NA培养基中分离得到54株细菌，根据形态观察和部分生理生化特性，选取32个代表性菌株进行16S rRNA基因序列的系统发育多样性分析。结果表明，数值分类中的代表菌株在82%相似水平上可分为12个表观群；这些分离菌株代表 20个物种，属于4个大的系统发育类群(Proteobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes，Actinobacteria)的10个科、15个属。多数菌株属于Proteobacteria门(15株，占46.9%)和Bacteroidetes门(10株，占31.3%)。【结论】美洲大蠊成虫肠道内存在较为丰富的细菌多样性。
美洲大蠊成虫&&&&可培养细菌&&&&系统发育分析&&&&多样性&&&&
Diversity of culturable bacteria isolated from Periplaneta americana adult gut
LIU Xiao-Fei,
CHEN Fang-Min,
YANG Ya-Lin,
ZHANG Xiao-Ping
Department of Microbiology, Collegeof Resource and Environment, SichuanAgricultural University, Chengdu, Sichuan611130, China
Abstract: [Objective] To understand the diversity of culturable bacteria isolated from Periplaneta americana adult gut. [Methods] Bacteria were isolated from the sample by using conventional culture-dependent method and then investigated by using numerical taxonomy and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences. [Results] Totally 54 bacteria strains were selected on nutrient agar plate. On the basis of morphological, physiological and biochemical characteristics, we selected 32 strains to perform a phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences. The results showed that the strains can be divided into 12 apparent groups on the 82% similarity level b 32 isolates represented 20 species, belonging to 15 genera of 10 families in four phylogenetic groups (Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, and Actinobacteria). The most abundant and diverse isolates were within the Proteobacteria (15 strains, 46.9%) and the Bacteroidetes (10 strains, 31.3%). [Conclusion] Overall, the study results presented above demonstrated that there are abundant bacteria diversity in the Periplaneta americana adult gut.
Key words: Periplaneta americana adult&&&&Culturable bacteria&&&&Phylogenetic analysis&&&&Bacterial diversity&&&&
昆虫是动物界中最大的类群，现存种类已超过100万种，并以每年7 000种的速度递增[]。我国昆虫资源相当丰富，约占世界昆虫总数的10%[]。肠道是特殊的生活环境，昆虫食性的多样性和肠道结构的多样性决定肠道微生物种类的多样性[]。昆虫共生菌可能是新型天然产物的广泛来源[]和新活性天然产物的重要来源[]，但是昆虫肠道微生物的研究尚欠系统和深入，所涵盖的昆虫种类仅零星少数，如蝎子[]、蜜蜂[]等。较为详细的研究主要集中在白蚁[]，还有松毛虫[]等农作物害虫，而美洲大蠊肠道微生物的研究鲜有报道。
美洲大蠊(Periplaneta americana)属节肢动物门，昆虫纲，蜚蠊目。在地球上已经生存了3.5亿年，是世界上生命力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。它食性广泛，喜食糖和淀粉，污染食物、传播病菌和寄生虫，是世界性卫生害虫，但其药用价值早已引起人们的重视。李时珍的《本草纲目》中记载：“蜚蠊主治淤血、寒热，破集聚，通利血脉”，并明确提到“此物乃血药”。云南大理医学院研制的肝龙胶囊(国药准字Z)，其主要成分为美洲大蠊提取物，具有抗乙型肝炎的功效[]。他们还从美洲大蠊提取出氨基酸和粘多糖，这些化学物具有治疗各种创伤、溃疡、结肠炎、较强的抗艾滋病病毒等作用。这些药用价值与肠道内共生菌可能存在密切关系。为此，本文以分离于美洲大蠊的内生细菌为对象，通过表型性状测定和16S rRNA基因序列分析对它们的表型、系统发育和多样性进行研究，以期发现有药用价值的菌种或新菌种，扩大药用菌种的来源，也可为相关微生物资源的研究和利用提供一定的理论基础。
材料与方法
1.1.1 供试材料：美洲大蠊成虫，购于四川荣县某养殖场，以饲料、秸秆为食。
1.1.2 主要仪器与试剂：Tgradient PCR扩增仪，德国Biometra公司；Gel-Doc2000凝胶成像分析仪，Bio-Rad中国公司；GXZ型智能光照培养箱，宁波东南仪器有限公司；YQX型厌氧培养箱，上海跃进医疗器械厂。
细菌DNA提取纯化和16S rRNA基因片段PCR扩增所用酶、引物和试剂参照Cui等[]。NA培养基[]，TSA培养基[]。
1.2.1 样品的采集和处理：选取健康成虫60只，随机均分成3组，饥饿24 h排空体内食物残渣，具体消毒方法参照刘玉升等[]的报道。取最后一次漂洗无菌水300 μL涂布在TSA固体培养基上，37 °C培养24−72 h，进行表面消毒检测。若无菌株生长，说明表面消毒彻底，否则不可用。
1.2.2 细菌的分离和纯化：将肠道研磨液稀释至10−1−10−8，吸取0.1 mL 10−6、10−7和10−8三个稀释度的稀释液涂于NA平板上，重复3次。放在37 °C培养箱中培养24−72 h，挑取表征各异的菌落于NA培养基上划线培养，同时镜检其纯度，直至获得纯的微生物菌株。
1.2.3 生理生化特性测定：生理生化试验均设3个平行及阳性和阴性对照。对供试菌株进行生理生化特性测定，包括接触酶、苯丙氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶等7个酶，硝酸盐、甲基红等6种含氮化合物，山梨醇、肌醇、半乳糖等21种糖醇及其他含碳化合物，具体方法参照东秀珠等[]。将测定的生理生化特性阳性结果记为“1”，阴性记为“0”，不能确定记为“N”进行编码，采用平均连锁法进行聚类分析。
1.2.4 16S rRNA基因的系统发育分析：基因组DNA提取参照Cui等[]的方法进行。室温干燥后溶于50 μL TE缓冲液中，1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量。引物为细菌通用引物[]8-27F和R。PCR扩增体系：DNA模板(70 mg/l) 1 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 12.5 μL，8-27F (20 μmol/L) 1.0 μL，R (20 μmol/L) 1.0 μL，补足ddH2O到25 μL。PCR扩增条件：94 °C 5 min；94 °C 1 min，52 °C 1 min，72 °C 5 min，30个循环；72 °C 10 min。采用PCR产物直接测序，由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。所得序列提交GenBank注册，获取序列号。根据测序结果，利用BLAST软件与GenBank数据库中的序列进行比对分析，获得相似性较高的相关菌株的16S rRNA基因序列，再用Clustsl X进行多序列比对[]，系统进化距离矩阵根据Kimura模型估算，用MEGA 5.0 (Molecular evolutionary genetics analysis)软件包采用邻接法构建系统进化树[]，重复取样1 000次进行自展值分析来评估系统进化树的拓扑结构的稳定性[]。
1.2.5 物种多样性分析：定义16S rRNA基因序列相似性大于97%作为同一种[]，采用Shannon-Wiener指数(H′)和均匀度指数(E)计算多样性[]。$H'=-\sum\nolimits_{i}^{s}{{{P}_{\mathrm{ }\!\!\iota\!\!\text{ }}}}\cdot \ln {{P}_{i}},E=H'lnS$。式中S为菌种数，Pi为第i种的多度比例，可以用Pi=ni/N求出，ni是第i种的菌株数，N为所有菌株数总和。
结果与分析
分离细菌表型特征多样性
根据菌落大小、形态、颜色等特征，挑取分离平板上的单菌落进行划线纯化，最终从本次采集的3组样品中共分离到54株细菌。再通过菌落形态、细胞显微形态和部分生理生化等去冗余，选取32个代表菌株，采用平均链锁法对其进行聚类分析。参与数值分类的代表菌株在82%相似水平上可分为12个表观群，聚类结果如图 1所示，具体分类组成和典型生理生化特征如表 1所示。
　数值分类聚类图
　Dendrogram generated from numerical taxonom
表 1　表观群组成和典型生理生化特征
Table 1　Apparent group of typical composition and physiological and biochemical characteristics
表观群名称 Apparent group name
包含菌株 Contains strains
典型特征 Typical characteristics
SCAU1，2，16，25
接触酶阳性，不能利用苯丙氨酸脱羧酶和脲酶，硝酸盐还原阳性，可利用葡糖糖产酸产气，但不能水解淀粉
氧化酶阴性，可利用麦芽糖、甘露醇和海藻糖作为唯一碳源，葡萄糖产酸
能以硝酸盐和葡萄糖作为唯一的碳氮源，但不能产生H
可液化明胶，能利用甘露醇和肌醇，但不产生吲哚
接触酶呈阳性，可以分解鸟氨酸、懒氨酸和精氨酸，还可以还原硝酸盐，但是不能分解尿素
氧化酶、接触酶阳性，可利用蔗糖、麦芽糖、甜醇和肌醇等，可水解淀粉和七叶灵，但不能利用柠檬酸钠
革兰氏阴性，可利用苯丙氨酸和尿素，还可还原硝酸盐，产生H
2S和吲哚，液化明胶较慢，山梨醇和甘露醇中不产酸
甲基红试验呈阴性，但可液化明胶，葡萄糖发酵产酸，还原硝酸盐
革兰氏阴性，不运动，可产生接触酶和氧化酶，甲基红和V-P呈阴性，可还原硝酸盐，可利用麦芽糖和纤维二糖作为唯一碳源
氧化酶阳性，不能产生H
2S和吲哚，不能利用葡萄糖、蔗糖等产酸，但是能水解淀粉
SCAU13-5，21-24，26-32
最大的一个群，该菌群接触酶呈阳性，鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶呈阴性，不能利用半乳糖、甘露醇和山梨醇等作为唯一碳氮源
V-P试验呈阴性，明胶不液化，吲哚阳性，可利用柠檬酸盐和酒石酸盐，能在肌醇和甘露醇中产酸，葡萄糖产酸但是不产气
分离细菌16S rRNA基因序列类群多样性
对32株代表性菌株进行16S rRNA基因序列测定，将获得的序列通过在线比对引擎BLAST与GenBank数据库中已报道的16S rRNA基因序列进行相似性比对分析。相似性比对分析表明(表 2)，32个分离菌株属于细菌域4个大的系统发育类(Proteobacteria，Bacteroidetes，Firmicutes，Actinobacteria)的10个科、15个属。多数菌株属于变形菌门(Proteobacteria，15株，占46.9%)和拟杆菌门(Bacteroidetes，10株，占31.3%)，其次属于厚壁菌门(Firmicutes，6株，占18.8%)。
表 2　美洲大蠊可培养细菌与其系统发育关系最密切的典型菌株间的16S rRNA系统发育关系
Table 2　Phylogenetic closest neighbors of strains isolated from Periplaneta americana based on the 16S rRNA gene sequence
Phylogenetic groups/Family
Strain (Accession number)
Closest type strain (Accession number)
Similarity
Proteobacteria (15/32)
SCAU1 (KP125977)
Enterobacter hormaechei (KC634321)
Enterobacteriaceae (8)
SCAU2 (KP125978)
Citrobacter sp. (KJ726569)
SCAU4 (KP125980)
Serratia marcescens (JQ308606)
SCAU18 (KP125994)
Serratia marcescens (AM691030)
SCAU10 (KP125986)
Providencia vermicola (KF886279)
SCAU6 (KP125982)
Proteus vulgaris (X07652)
SCAU25 (KP126001)
Enterobacter sp. (JQ781590)
SCAU16 (KP125992)
Enterobacteraer aerogenes (AM992182)
SCAU7 (KP125983)
Pseudomonas putida (HG416957)
Pseudomonadaceae (2)
SCAU19 (KP125995)
Pseudomonas sp. (KJ939322)
Sphingomonadaceae (1)
SCAU12 (KP125988)
Novosphingobiumpanipatense (NR-044210)
SCAU14 (KP125990)
Alcaligenes faecalis (KF535149)
Alcaligenaceae (2)
SCAU23 (KP125999)
Alcaligenes faecalis (KC414681)
SCAU3 (KP125979)
Acinetobacter sp. (EF412969)
Moraxellaceae (2)
SCAU17 (KP125993)
Acinetobacter sp. (JX286668)
SCAU11 (KP125987)
Flavobacterium sp. (DQ778318)
Bacteroidetes (10/32)
SCAU13 (KP125989)
Myroides odoratimimus (EU660317)
Flavobacteriaceae (10)
SCAU22 (KP125998)
Myroides odoratimimus (EU373431)
SCAU26 (KP126002)
Myroides profundi (KF730743)
SCAU27 (KP126003)
Myroides odoratimimus (EU373415)
SCAU28 (KP126004)
Myroides odoratimimus (EU660317)
SCAU29 (KP126005)
Myroides odoratimimus (GU549435)
SCAU30 (KP126006)
Myroides sp. (JF766694)
SCAU31 (KP126007)
Myroides sp. (KJ000848)
SCAU32 (KP126008)
Myroides odoratimimus (EU331413)
Firmicutes (6/32)
SCAU8 (KP125984)
Bacillus subtilis (JQ308573)
Bacillaceae (2)
SCAU20 (KP125996)
Bacillus subtilis (KJ469796)
Micrococcacea (1)
SCAU5 (KP125981)
Staphylococcus sp. (AB689746)
KIneococcaceae (3)
SCAU15 (KP125991)
Kurthia gibsonii (JN600482)
SCAU21 (KP125997)
Kurthia gibsonii (AM184261)
SCAU24 (KP126000)
Kurthia gibsonii (EF032677)
Actinobacteria(1/32) Coryneform of bacteria (1)
SCAU9 (KP125985)
Kocuria salsicia (HG934379)
物种与遗传多样性
按16S rRNA基因序列相似性大于97%作为同一种的归类原则[]，32个分类菌株可以归为20个物种(表 1和图 2)。Shannon-Wiener多样性指数(H′)为4.87，均匀度指数(E)为1.62，表明美洲大蠊相关可培养细菌具有较高的物种多样性和均匀度。除了9株(SCAU2、3、4、5、9、17、18、20和25)分别与其相关的已知物种的典型菌株的16S rRNA基因序列相似性为100%外(表 1)，其他分离菌株与其相关的已知物种的典型菌株的16S rRNA基因序列相似性为99%，说明大部分菌株与其系统发育关系最密切的相关菌株之间存在着一定的遗传差异。
　纯培养方法法分离到的美洲大蠊肠道细菌16S rRNA基因系统发育分析
　Phylogenetic tree analysis of 16S rRNA genes of bacteria community in periplaneta americana gut using culture-dependent method
近年来，多相分类的应用使细菌的分类得到了巨大的发展。其中数值分类是细菌分类研究中传统的方法，能揭示菌株的具体表型特征，并能对大量菌株进行初步分群。本文首次采用纯培养法，表型特征鉴定和基于16S rRNA基因序列的系统发育分析对美洲大蠊肠道可培养细菌的多样性进行了研究。结果表明，数值分类中的实验菌株在82%相似性水平上被划分为12个群，所选菌株基本上按种群分开；用于系统发育分析的32株菌分别归属于4个大的系统发育群，10个科，15个属，可以分为20个物种。系统发育分类与表型特征分类基本吻合，但略有差异。如在系统发育Bacteroidetes门中，表现为2个表观群，其中菌株SCAU11独立为一个表观群，其余菌株为另一个群；而在Firmicutes门中，表现为3个表观群；在Proteobacteria门中，表现为9个群。特别是表观群11，包含上述3个门中的某些菌。菌株在系统发育分类中，大部分菌株与
其系统发育的关系最密切的已知物种典型菌株之间的16S rRNA基因序列间都有一定差异，这些结果揭示了美洲大蠊相关可培养细菌较丰富的系统发育多样性、遗传多样性和物种多样性。
本研究表明，Proteobacteria (15株，占46.9%)和Bacteroidetes (10株，占31.3%)在美洲大蠊肠道菌群结构中占绝对优势，这与房伟等[]的研究结果基本吻合，该文献指出美洲大蠊肠道微生物主要包括变形杆菌门(Proteobacteria，占66.4%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，占17.8%)、厚壁菌门(Firmicutes，占14.5%)和梭杆菌门(Fusobacteria，占0.6%)。Bertino-Grimaldi等[]实验表明，美洲大蠊肠道优势菌群为Proteobacteria和Bacteroidetes。Bagde等[]在研究美洲大蠊成虫肠道时发现，可培养细菌不仅包含肠杆菌属、芽孢杆菌等，而且还含有伤寒沙门氏菌、志贺氏杆菌等。一些属于易于培养的微生物在本次实验中未分离出，可能原因如下：(1) 生活环境和食物来源不同，本次实验用的是人工养殖的美洲大蠊，以饲料、秸秆为食；(2) 培养条件和肠道环境不一致；(3) 将肠道微生物限定在营养基质简单、pH等参数恒定的NA平板上培养，使许多微生物丧失了自由生长的必要条件，从而表现为不可培养[]；(4) 在常规培养中，忽视某些群体效应，使美洲大蠊肠道环境的生态依存关系遭到破坏，菌群间的生物信息交流体系也会发生根本性的改变，适应性强的物种生长迅速，而生长缓慢的微生物类型则因营养物的匮乏以及种群信息流通的障碍而受到抑制[]。但是，通过实验，我们对于美洲大蠊肠道可培养细菌有了一定的初步了解，为相关微生物资源的研究、保护、开发和利用提供了一定的理论基础和实践指导。
在实验中分离到相当数量的假单胞菌属和芽孢杆菌属菌种，可以作为产生河豚毒素(TTX)的来源[]。本研究只分离得到20种不同的可培养细菌样本，不同种类的部分细菌可能未被分离出，还需通过更广泛的采样才能分离到更多的种类。鉴于传统培养方法具有一定的局限性，后续工作将运用分
子生物学技术进一步判别未培养细菌的种类，并根据其所属种类的营养需求和生理生化特点，设计选择性培养基进行分离培养。因此，有效地结合传统培养方法与DGGE、荧光原位杂交和样品宏基因组等分子生物学技术将有助于阐明美洲大蠊肠道可培养细菌多样性。
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