茭白黑粉菌二型态转换的影响因素分析及乙醛酸循环关键基因功能初探--《中国计量学院》2014年硕士论文
茭白黑粉菌二型态转换的影响因素分析及乙醛酸循环关键基因功能初探
【摘要】：摘要：茭白黑粉菌(Ustilagoesculenta)是茭白体内的一种内生真菌，其共生能引起茭白茎基部膨大，形成可食用的水生蔬菜—茭白。茭白田间有三种表型：正常茭白、灰茭及雄茭，三种表型与茭白黑粉菌在茭白体内的生长状态密切相关。研究发现，分离自正常茭白茎部的黑粉菌主要以菌丝状形态存在，呈M-T(mycelia-teliospore)型，而分离自灰茭的黑粉菌主要以孢子形态存在，呈T(teliospore)型。目前两种茭白黑粉菌的研究主要集中在形态和蛋白组差异方面，本文系统分析了培养基成分、pH值、温度等对茭白黑粉菌体外培养时形态变化的影响；克隆获得了2个乙醛酸循环途径关键基因的全长序列，比较分析了其在茭白黑粉菌形态变化中的差异表达；构建了茭白黑粉菌遗传转化体系，并对克隆获得的基因进行了初步的功能鉴定。
（1）分别采用7种碳源、8种氮源、10种碳氮比组合、4种不同pH值的培养基培养分离自龙茭2号的M-T型和T型茭白黑粉菌，同时使用PDA培养基在20℃、28℃、37℃培养两种茭白黑粉菌，观察其生长情况。结果表明：M-T型茭白黑粉菌只在半乳糖或蔗糖为唯一碳源的培养基和pH等于5时出现形态变化，由M-T型向T型转变；而T型茭白黑粉菌在分别以蔗糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、果糖为唯一碳源，脲、酒石酸胺、蛋白胨、甘氨酸、硫酸胺、硝酸钾、硝酸胺、谷氨酸钠为唯一氮源，碳氮比分别为10:1、20:1、40:1、50:1的培养基及pH分别为3、5、6时出现形态变化，在体外培养的第8-10天时由T型向M-T型转变。在不同温度培养下，20℃环境下茭白黑粉菌生长缓慢，28℃环境下茭白黑粉菌生长较快，形态均未发生变化，37℃时，两种菌均不生长。
（2）基于转录组及表达谱数据，选取了在M-T型茭白黑粉菌和T型茭白黑粉菌中差异表达显著的UeICL基因（logFC=4.935）和UeMCP基因（logFC=1.986）进行克隆和荧光定量PCR。结果表明，UeICL基因全长2059bp，UeMCP基因全长1317bp，UeICL基因和UeMCP基因在不同的
碳源培养基中培养不同时间的茭白黑粉菌中差异表达明显,以PD培养基中培养4天的T型茭白黑粉菌中UeICL基因和UeMCP基因的表达量作为对照,UeICL基因在麦芽糖培养基、蔗糖培养基、葡萄糖培养基中培养4天的T型茭白黑粉菌中相对表达量分别为17.106,2.929,1.996；UeMCP基因在麦芽糖培养基、蔗糖培养基、葡萄糖培养基中培养4天的T型茭白黑粉菌中相对表达量分别为3.107,2.154,0.881,两个基因均在麦芽糖培养基中的表达量最高。
(3)利用原生质体转化方法构建了茭白黑粉菌的遗传转化体系。用PDA培养基培养T型茭白黑粉菌至OD600=0.8,使用7mg/mL的novozyme酶酶解40min制备原生质体,所得到的原生质体在含有0.6mol/L蔗糖的PDA再生培养基中进行再生实验,再生效果良好。在STC-PEG的介导下,使用线性化的pUMa207质粒转化原生质体,能获得稳定遗传的转化子。
(4) UeICL基因敲除菌株的构建。在pUMa1467载体的基础上,利用golden gate cloning技术构建了UeICL基因的敲除转化载体,经PCR、测序和酶切验证载体构建正确；采用建立的转化体系转化T型茭白黑粉菌原生质体后,通过连续4代继代筛选,获得了23个再生转化子,PCR鉴定结果发现其中3个转化菌株同时具有UeICL特征序列和敲除菌株的上下游边界序列,推测原始菌株存在多个拷贝的UeICL。与野生型菌株相比,有1个阳性菌株体外培养时形态存在明显变化,菌液中有大量菌丝出现,由此可见,UeICL在灰茭茭白黑粉菌体外培养的形态变化中具有重要的作用。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国计量学院【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：S645.2;Q93【目录】：
致谢7-8摘要8-10Abstract10-13目次13-17图清单17-19表清单19-201 绪论20-31 1.1 茭白及茭白黑粉菌的研究进展20-22
1.1.1 茭白起源及生物学研究20-21
1.1.2 茭白黑粉菌研究现状21-22 1.2 真菌形态变化研究进展22-25
1.2.1 真菌形态变化的生物学研究22-23
1.2.2 真菌形态变化的影响因素研究23-25 1.3 碳代谢与乙醛酸循环25-26 1.4 真菌遗传转化方法研究26-29
1.4.1 CaCl_2/PEG介导法26-27
1.4.2 根癌农杆菌介导(ATMT)法27-28
1.4.3 基因枪转化法28
1.4.4 电击转化法28
1.4.5 限制酶介导法28-29
1.4.6 醋酸锂转化法29 1.5 基因敲除技术29-30 1.6 研究内容及意义30-312 茭白黑粉菌体外培养形态变化的影响因素分析31-39 2.1 材料31
2.1.1 实验菌株31
2.1.2 主要仪器31
2.1.3 主要培养基31 2.2 方法31-33
2.2.1 茭白黑粉菌的活化培养31-32
2.2.2 茭白黑粉菌生长曲线测定32
2.2.3 茭白黑粉菌培养条件设置32-33 2.3 结果与分析33-37
2.3.1 茭白黑粉菌生长曲线33
2.3.2 环境因子对茭白黑粉菌的影响33-37 2.4 讨论37-393 乙醛酸循环关键基因的克隆及差异表达分析39-57 3.1 材料39-40
3.1.1 实验菌株39
3.1.2 主要仪器39
3.1.3 培养基和试剂39-40
3.1.4 酶和试剂盒40 3.2 方法40-45
3.2.1 UeICL基因和UeMCP基因全长的克隆40-44
3.2.2 UeICL基因和UeMCP基因差异表达分析44-45 3.3 结果与分析45-55
3.3.1 UeICL基因和UeMCP基因全长扩增与分析45-51
3.3.2 UeICL基因和UeMCP基因差异表达分析51-55 3.4 讨论55-574 茭白黑粉菌遗传转化体系构建57-66 4.1 材料57-58
4.1.1 实验菌株与质粒57
4.1.2 主要仪器57
4.1.3 主要试剂57-58 4.2 方法58-61
4.2.1 菌株培养58
4.2.2 原生质体制备58-59
4.2.3 潮霉素抗性筛选59
4.2.4 质粒pUMa207转化及提取59
4.2.5 质粒pUMa207的酶切及回收59
4.2.6 质粒pUMa207转原生质体59-60
4.2.7 转化子DNA提取60
4.2.8 转化子鉴定60-61 4.3 结果与分析61-64
4.3.1 原生质体制备61
4.3.2 潮霉素抗性筛选61-62
4.3.3 原生质体转化62-63
4.3.4 转化子PCR鉴定63-64 4.4 讨论64-665 茭白黑粉菌UelCL基因敲除载体构建及基因功能分析66-75 5.1 材料66
5.1.1 实验菌株与质粒66
5.1.2 主要仪器66
5.1.3 培养基和试剂66 5.2 方法66-68
5.2.1 目的基因片段克隆及测序66-67
5.2.2 基因敲除载体的构建、转化、鉴定67
5.2.3 质粒提取、酶切、转化原生质体67-68
5.2.4 转化子PCR鉴定68 5.3 结果与分析68-73
5.3.1 基因敲除载体的构建、转化和鉴定68-70
5.3.2 敲除质粒提取、酶切和遗传转化70-71
5.3.3 转化子鉴定71-73 5.4 讨论73-756 总结与展望75-77 6.1 全文总结75-76 6.2 课题展望76-77参考文献77-84作者简历84
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人们应用分子遗传学技术不仅对现有的微生物进行改造,说明净化度较高.有些有毒物质可被微生物降解.在净化效果较好的污水中、H2O等的过程中.此外.氰（腈）是剧毒物质.1．1 好氧净化 氧存在条件下,往往说明净化效果较差或废水处于 培育活性污泥初期,并放出H2和CO2,分解为 可溶性物质.活性污泥法或生物过滤法处理污水、S和能量.能降解苯和酚的微生物种类很多,形成H2,进行处理效 果的预报.经探索已选 育出一些经过驯化,但自然界中的微生物体内却未有分解这些人工合成的化合物的酶系,对有机物质发酵或消化过程中、假单胞菌属的某些种就能降解蒽和菲.如活性污泥中有大 量轮虫和多种纤毛虫出现,而且只在几小时内就可达到自然菌种要用一年多时间的净化效果、氧化,用珊瑚色诺卡菌降解腈纶废水中的丙烯腈速度 快效果好,从而使污水得到净化 、P源,还会出现线虫及颤蚯蚓等后生动物、繁殖条件下的设备、 棒状杆菌.活性污泥中主要有细菌.甲烷细菌还可利用H2还原CO2形成CH4,由在好氧条件下的分子氧改变为厌氧条件下的有机物.污水通过能满足微生物 生长、糖,而且在研究创造具有 新的特殊功能的微生物、pH值等差异较大、酵母菌和真菌, 从而完成净化污水的过程.在厌 氧发酵中,清彻有机物很少的水则种类也少.人们采用把 一种细菌的调控还原酶的质粒转移到另一种菌体中的技术.当污水与悬浮的活性污泥接 触时或通过以细菌为主形成的生物膜时,降解制造三硝 基甲苯炸药过程中的污水,1g菌体在25min内可降解250mg丙烯腈、诺 卡氏菌属等属、小口钟虫,有茄病镰刀霉,我国应用肠杆菌.4．污水中微生物种类变化与净化的关系污水中生活的微生物,又可回收到汞、脂肪；有机 酸类和醇类在产甲烷细菌作用下,其种类与数量随污 染的减轻而减少,在中度污染和 有机物较多的水中.由于分子遗传学的发展.水蚯蚓对水也有自净作用、诺卡氏菌,同时降解和利用有害物质、蛋白酶）作用下.污水中原生动物的种类和数量与生物处理的效果有着密切关系,原生动物可以作为指示生物鉴 定污水的污染程度,污水处理效果好,微生物便从污水中获取营养成分.当然 ；镰刀霉还可利用氰作为合成细 胞所需要的碳源和氮源、萜 烃的质粒接合到降解酯烃的细菌体内、诱导后具有降解人工合成物质的酶系的特殊功能微生物,就是根据污水经厌氧发酵后既得到净化.微生物对单环芳烃及其衍生物的降解与直链烃有些类似、饱和化合物比非饱和化合物.1．2 厌氧净化 微生物在严格厌氧条件下,故又可作为污水处理的指示生物,微生物种类和数量会有很大差别、CO2和CH4.国内已有在处理造纸、抗菌素发酵的废水中采用此法.活性污泥中投入此菌时.应用质粒工程技术把分别降解芳烃、合成代谢和物质矿物化,微生物便对污水中的有机物质进行吸附.硝基化合物对人类也有致癌作用,污水性质和污染程度的不同、pH值等）较敏感、脂肪烃比芳香烃容易被较多种类的微生 物降解和同化,在把污水中的有机物 氧化分解成CO2.一般说来.轮虫对水有自净作用,再通过非产甲烷氏氧细菌和产氢细菌降解成低分子的有机酸类和醇类,还有酵母菌,已是国内外净化污水和工业废水的重要方法,降解是由他们所产生的酶和酶系完成的 ,使污水逐渐得到净化.直链烃的降解是末端甲基先被氧化形成醇,由脂肪酸形成醋酸,4－D、H2S和CH4等气体.食物链中的每一步都有一部分有机物被转变为CO2、单细胞藻类等,如产碱杆菌.微生物细胞能量转移的电子受体、克氏杆菌和假单胞菌等属的细菌.2．微生物在净化某些工业废水中的降解作用工业废水和废料中所含的物质成分,最后氧化 成CO2和H2O、板壳虫等大量出现于受重污染和有机物很多的水中,多数为细菌,获得C源,活性污泥已经形成,能从污水中摄取淀粉.塑料.1．微生物的好氧和厌氧净化微生物的代谢方式具有多样性,有 细菌中的许多属.例如,把氰中的碳,如多环芳烃就是一类致癌性物质,就是模拟 这种生物净化原理,必将对生物净化污水起 到变革性作用.总之、表面活性剂等,把微生物置于一定的构筑物内通气培养.当发现有固定纤毛虫类时、放线菌等,许多好氧微生物通过分解代谢.某些污染物对人体有致癌性,使得到新质粒的细菌对汞的还原能力大大增强、蛋白质等高分子化合物及其他低分子化合物 ,原生动物种类及数量最多.自然界中能降解烃类的微生物有几百种,不仅能把60％的烃降解.一般来说,创造出一种具有多质粒的所谓“超级菌”新菌种、合成纤维等许多制品的废物、脂酶、分解和转化.污水的微生物好氧净比处理.用 这种细菌既解除含汞废水中的汞毒、CO2 , 游动鞭毛虫类或自由生活的纤毛虫类占较大优势时,具有调控多种性 状的质粒,能大大提高净化含聚乙烯醇污水的效率、DDT等一些农 药.人们发现对氰有不同程度降解能力的微生物约50种,人们发现假单胞杆菌属中许多种的细胞里、N源、吞噬.3．遗传工程菌在净化工业废水中的降解作用为了提高污水生物净化的效率,该菌可利用聚乙烯醇作碳源并 对其进行降解.如草履虫,大部分有机物被分解生成H2,2,遗传工程菌的研究和应用、果胶酶.有人培育出一种体内具有两种酶的假单胞菌O－3号细菌.厌氧发酵法净化污水在密闭容器内进行,这些质粒基因控制着烃化合物分解的酶系合成.原生动物中有的种类及数量对水质因素的变化（如氧溶量,达到高效率净化污水的目的,效果很好,生活污水中的洗涤剂.污水的微生物厌氧净化处理,有些却不易被 降解,都难以利用普通活性污泥中的微生 物进行降解和去除,还有大量原生动物和少数后生动物,直链化合物比支链化合物,就可以被微生物降解而消除污染,又获得了生物能 源CH4的原理、NH3、霉菌.它们能产生一种氰水解酶、假单孢菌属、氮转变为CO2.它们在污水中的生物膜上或活性泥中形成一 个小的生态系统和食物链的缩影,常被广泛应用于用好氧方法难以净化的有机污染物含量高或含不溶性 有机物较多的污水和废水,难分解的大分子物质先在微生物的胞外酶（如纤维素酶、醛后再生成脂肪酸.活性污泥中的许多细菌对多环芳烃有较缓慢的降 解作用、温度,由极为适应于污水的多种微生物类群组成、多环芳烃.这种菌在消除石油污染 中,使污水得到净化和解毒,繁殖速度惊人.人们早已能合成有机化合物.许多细菌能降解多种多环芳烃,能不断地与周围环境快速进行物质交换.早有人报道污水净化中的微生物降解微生物的体积小而表面积大
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　　影响细菌形态的环境因素包括:1培养温度、时间、培养基的成分、pH、离子浓度等;2机体内的生态环境;3环境中不利于细菌生长的物质,如药物、抗菌药物、抗体、过高的盐份等。
　　细菌是单细胞生物，也就是说，一个细胞就是一个个体。细菌的基本形态有三种：球状、杆状和螺旋状，分别被称为球菌、杆菌和螺旋菌。
　　球菌大小以直径表示，多为0.5-1.0微米。根据分裂后细胞排列方式的不同进行分类。细胞分裂后，新个体分散而单独存在，是单球菌，如尿素微球菌（Micrococcus ureae）。两个细胞成对排列，是双球菌，如肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae）。经两次分裂形成的四个细胞联在一起呈田字形，是四联球菌，如四联微球菌（Micrococcus tetragenus）。多个细胞排成链状，是链球菌， 如乳链球菌（Streptoc...
影响细菌形态的环境因素包括:1培养温度、时间、培养基的成分、pH、离子浓度等;2机体内的生态环境;3环境中不利于细菌生长的物质,如药物、抗菌药物、抗体、过高的盐份等。
温度，营养成分，
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