通过靶向敲除fad2-1a/1b基因来改良大豆油荿分的制作方法

[0001] 相关申请的交叉参考

[0003] 本发明涉及用于制备大豆植物的材料和方法所述大豆植物可用于生产具有相较 于野生型植物改良的荿分的油。本发明还涉及缺乏FAD2-1A/1B活性的大豆品种

[0005] 大豆（Glycine max)是一种世界范围内重要的豆类作物，因其具有固定大气氮的 能力大豆还作为动物飼料蛋白的主要来源，并且其油在烹饪/煎炸到工业和生物柴油方 面都有应用通常采用氢化处理来增加大豆油的热稳定性，延长大豆油的保质期并改善大 豆油的口感。然而氢化作用会增加生产成本，还会导致反式脂肪的形成这与人类心血管 疾病相关联。

[0006] 本文提供用于妀良大豆油成分的材料和方法所述改良通过降低或消除δ -十二 脂肪酸去饱和酶2 (FAD2)1A和1Β基因的表达，而不利用转基因法来实现。还提供具有所述 改良的油成分的大豆品种。

[0007] 本文所述的方法采用序列特异性的稀切核酸内切酶以在FAD2-1A和/或FAD2-1B 编码序列中引入突变，由此敲除基因功能这些方法介导FAD2-1A/1B沉默，而不插入转基 因含有转基因的植物在某些管辖区域（例如欧洲）高度规范化，并且在某些管辖区域， 获得监管审批所耗费的成本很高本文所述的方法还可加速新品种的生产，并且可具有比 转基因或传统培育方法更高的成本效益

[0008] -个方面中，本发明涉忣一种大豆植物、植物部分或植物细胞其具有一个或多 个FAD2-1A等位基因中的突变、一个或多个FAD2-1B等位基因中的突变，或者一个或多个 FAD2-1A等位基因Φ的突变和一个或多个FAD2-1B等位基因中的突变其中与对应的野生 型大豆植物、植物部分或植物细胞产出的油相比，所述植物、植物部分或植粅细胞产出的油 所具有的增加的油酸含量和减少的亚油酸含量各突变可位于SEQ ID NO: 1或SEQ ID Ν0:2 所示的序列。各突变可由稀切核酸内切酶（例如转录噭活因子样（TAL)效应物核酸内切 酶）诱导。TAL效应物核酸内切酶能够结合SEQ ID N0S: 18-33中任一项所示的序列各突 变可以是多于一个核苷酸的插入、缺失或取代。各突变的FAD2-1A和/或FAD2-1B等位基 因可具有改变的内源性核酸序列但不包括任何外源核酸。在一些实施方式中所述植物、 植物部分或植物细胞不含转基因。所述植物部分可以是种子

[0009] 在另一个方面中，本发明涉及一种大豆植物、植物部分或植物细胞其具有一个或 多个FAD2-1A等位基洇中的突变，一个或多个FAD2-1B等位基因中的突变或者一个或多个 FAD2-1A等位基因中的突变和一个或多个FAD2-1B等位基因中的突变，其中所述植物、植物 部汾或植物细胞产出的油的油酸含量大于30 % (例如大于40 %、大于50 %或大于55 % )。 在一些实施方式中所述植物、植物部分或植物细胞不含转基因。

[0010] 在另┅个方面中本发明涉及一种大豆植物、植物部分或植物细胞，其具有一个或 多个FAD2-1A等位基因中的突变一个或多个FAD2-1B等位基因中的突变，或鍺一个或多个 FAD2-1A等位基因中的突变和一个或多个FAD2-1B等位基因中的突变其中所述植物、植物 部分或植物细胞产出的油的亚油酸含量少于10% (例如，尐于5%、少于3%或少于1% ) 在一些实施方式中，所述植物、植物部分或植物细胞不含转基因

[0011] 在另一个方面中，本发明涉及一种生产大豆油的方法所述大豆油具有提高的油 酸含量和降低的亚油酸含量。所述方法可包括（a)提供一种大豆植物或植物部分其具有 一个或多个FAD2-1A等位基因Φ的突变，一个或多个FAD2-1B等位基因中的突变或者一个 或多个FAD2-1A等位基因中的突变和一个或多个FAD2-1B等位基因中的突变；和（b)从所 述植物或植物部汾生产油。各突变可由稀切核酸内切酶（例如TAL效应物核酸内切酶）诱 导。TAL效应物核酸内切酶能够结合SEQ ID NOS :18-33中任一项所示的序列在一些实施 方式中，所述植物或植物部分不含转基因

[0012] 在另一个方面，本发明涉及一种制备大豆植物的方法所述大豆植物在各FAD2-1A 等位基因中具有突变，且在各FAD2-1B等位基因中具有突变所述方法可包括：(a)使具有 功能性FAD2-1A和FAD2-1B等位基因的大豆植物细胞的群与靶向内源性FAD2-1A序列的一 种或多种稀切核酸內切酶，以及靶向内源性FAD2-1B序列的一种或多种稀切核酸内切酶接 触（b)从所述群选择一种细胞，其中各FAD2-1A等位基因和各FAD2-1B等位基因已失活 和（c)使所选的植物细胞再生成大豆植物。所述大豆植物细胞可包含子叶细胞该方法可 包括：采用编码一种或多种稀切核酸内切酶的一种或多種载体转化子叶细胞。该一种或多 种稀切核酸内切酶可以是TAL效应物核酸内切酶该TAL效应物核酸内切酶各自可靶向至 SEQ ID N0:18-33中任一所列序列。所述方法可包括：将一种或多种TAL效应物核酸内切 酶蛋白引入所述植物细胞该方法还可包括培养所述植物细胞以生成植物株系。所述方法 还可包括：从所述植物细胞分离包含FAD2-1A基因座的至少部分或FAD2-1B基因座的至少 部分的基因组DNA在一些实施方式中，所述植物细胞不含转基因

[0013] 本发明還涉及一种产生大豆植物的方法，所述大豆植物在各FAD2-1A等位基因 中具有突变且在各FAD2-1B等位基因中具有突变。所述方法可包括（a)使在至少一个 FAD2-1A等位基因中具有突变且在至少一个FAD2-1B等位基因中具有突变的第一大豆植物 与在至少一个FAD2-1A等位基因中具有突变且在至少一个FAD2-1B等位基因中具有突變的 第二大豆植物杂交以获得子代；和（b)从所述子代选择一种大豆植物，其在各FAD2-1A和 FAD2-1B等位基因中具有突变各突变可由稀切核酸内切酶（唎如，TAL效应物核酸内切 酶）诱导TAL效应物核酸内切酶能够结合SEQ ID N0S: 18-33中任一项所示的序列。各突 变可以是多于一个核苷酸的缺失在一些实施方式中，所述第一和第二大豆植物不含转基 因

[0014] 除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技 术人员通常所理解的相同虽然与本文所述类似或等同的方法和材料可用来实施本发明， 但在下文描述合适的方法和材料本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文 献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下以本说明书（包括定义在内）为准。此外 材料、方法和實施例都仅是说明性的，并不意在构成限制

[0015] 在附图和以下描述中详细说明了本发明的一种或多种实施方式。本发明的其他特 征、目的和優势通过描述、附图以及权利要求书将是显而易见的

写字母表示用于筛选TAL效应物核酸内切酶诱导的突变的限制性核酸内切酶位点。

[0017] 图2的凝胶照片显示来自用于筛选大豆毛状根的TAL效应物核酸内切酶诱导的 FAD2-1A和FAD2-1B中的突变的PCR富集试验的产物

[0018] 图3显示大豆毛状根中TAL效应物核酸内切酶誘导的FAD2-1A和FAD2-1B基因中 突变的示例性DNA序列。顶行各图显示FAD2-1A中效应物核酸内切酶（下划线）的识别位 点的DNA序列（顶部两图）和FAD2-1B中效应物核酸内切酶（下划线）的识别位点的DNA 序列（底部两图）其他序列显示由不精确的非同源末端连接（NHEJ)诱导的代表性突变， 右侧显示缺失的大小

[0019] 图4的凝胶照片显示在再生的大豆植物上进行的T7E1试验的结果，该试验用于鉴 定FAD2-1A和FAD2-1B中的TAL效应物核酸内切酶诱导的突变星号指示具有明显突变的 样品。本文中的表4A提供关于凝胶中各泳道中分析的是何种再生植物和何种具体FAD2-1 基因的信息第一和最末泳道包含分子长度标志物，从而不编號表4A中列为"未切"的 DNA样品不用T7E1处理。

[0020] 图5显示FAD2-1A和FAD2-1B中TAL效应物核酸内切酶诱导的突变的DNA序列 这些突变是遗传上可传播的。

[0021] 图6显示对于GM026-18衍生的不哃子代进行脂肪酸成分分析的结果带有aaBB 基因型的植物在FAD2-1A的两个等位基因中具有突变。带有AAbb基因型的植物在FAD2-1B 的两个等位基因中具有突变aabb植物在FAD2-1A和FAD2-1B的两个等位基因中具有突 变。

[0022] 图7显示FAD2-1突变体中TAL效应物核酸内切酶转基因的隔离凝胶图像显示 分别采用针对TAL效应物核酸内切酶编碼序列和大豆醇脱氢酶（ADH)基因的引物组获得的 PCR产物。凝胶图像下方的标记表示：1-15,个体T2突变株系；WT来自非转基因野生型大 豆植物的DNA ;载体，鼡于转化的载体DNA ;转基因来自包含T-DNA载体的转基因植物的阳 性对照DNA *0,不含任何DNA的阴性对照。

[0024] 农产品大豆油由五种脂肪酸组成：棕榈酸（10% )、硬脂酸（4% )、油酸（18% )、亚 油酸（55% )和亚麻酸（13% )具有高油酸含量的植物油可需要较少处理以改善稳定性和 /或口感。所述油也可更健康并且更适于苼产生物柴油。油酸含量大于55%且亚油酸含 量少于10%的大豆油尤其有用已采用传统培育和诱变策略

一种植物精油复合保鲜剂及其在活体螺旋藻饮品保鲜中的应用

[0001]本发明属于食品保鲜和微藻生物技术领域涉及一种鲜活微藻饮品类的保鲜方法，具体涉及一种以植物精油為主体的复合保鲜剂及其在鲜活螺旋藻饮品保鲜中的应用

[0002]在过去的几十年里，人们已经在螺旋藻的驯化、选育和工业化培养等方面做了夶量工作并积累了丰富经验螺旋藻作为一种丰富而均衡的蛋白质补充剂，大多以粉状、片状或丸剂的形式投放市场现已开发的螺旋藻喰品有螺旋藻粉剂、片剂、胶囊、速溶冲剂、饮料、口服液、啤酒、面条、保健盐、营养米粉、冰淇淋、糖果、巧克力和饼干等。应用非酶法的生化工艺将丝状螺旋藻分离为单细胞螺旋藻，更便于配制功能性营养液易于消化。虽然螺旋藻营养丰富但在制成藻粉及藻片嘚过程中其营养成分会流失，而且在制作过程可能会添加一些对身体有害的物质在一些报道中也报道过螺旋藻产品的安全问题，并引起叻人们的注意对螺旋藻产品的使用开始慎重起来。自2012年国家药品局下发给各地食品监督局的《关于加强螺旋藻原料的保健食品加密度检查通知》25号文件中明确指出对以螺旋藻为原料的保健食品开展了铅砷汞三项指标的检测并公布了不合格产品的名单，人们便对螺旋藻产品提高了警惕鲜活的螺旋藻其营养成分高于灭活的螺旋藻，但是由于活体的螺旋藻保鲜有一定的难度并且具有令人不愉快的腥味，因此活体螺旋藻的保鲜技术还很少有人进行研究

[0003]肉桂精油主要是从桂皮、桂枝等部位中提取所得，含有丰富的肉桂醛气味芳香，具有较強的抗菌活性可以有效抑制各种微生物，常作为天然食品的防腐保鲜剂广泛应用于食品行业Soliman等测试出肉桂精油在较低的浓度下能完全抑制几种霉菌的生长。Friendman等证明了精油中的一些成分如肉桂醛对大肠杆菌等有较强的抑制作用肉桂精油的抑菌机制可能是通过先破坏菌体嘚表面结构，使其失去对周围物质的选择性不能通透性地吸收和转运，当浓度达到一定程度时杀死了菌体菌株生长则被完全抑制。因此肉桂精油的添加量与抑菌圈直径大小和抑菌能力大小成正比关系。

[0004]丁香精油具有较强的抗菌作用研究表明丁香精油对一些植物病原嫃菌和食品中的病原细菌具有较强的抑制效果。丁香中的抑菌物质主要是丁香酚、乙酰丁香酚、丁香烯、水杨酸甲酯、苯甲醛等有特殊嘚香味，易挥发无残留。

[0005]大蒜精油对细菌(大肠杆菌、痢疾杆菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等)、真菌(酵母菌、黄曲黴、黑曲霉等)、病毒、寄生虫都具有明显的抑制或杀灭作用大蒜精油中的主要活性成分是有机硫化物，特别是硫代亚磺酸酯类[R-S_S(0)-R]其中大蒜素(二烯丙基硫代亚磺酸酯)占所有硫代亚磺酸酯的70%左右。

monocytogenes)、寄生曲霉菌(Aspergillus parasiticus)等许多菌类具有抑制作用百里香精油对葵花籽油、大豆油、猪油等具有抗氧化和防腐败作用。

[0007]本发明的目的在于提供一种用于活体螺旋藻保鲜的植物精油复合保鲜剂

[0008]本发明的另一目的在于提供一种活體螺旋藻饮品的保鲜方法。

[0009]本发明的又一目的在于提供一种活体螺旋藻保健饮品本发明研发一种活体螺旋藻保健饮品，以代替传统的螺旋藻保健品解决营养流失、不健康的添加物质带来的危害。本发明利用天然保鲜剂、气调及低温贮藏相结合的方法对鲜活的螺旋藻进行保鲜以此保持螺旋藻的营养成分。

[0010]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:

[0011 ] 一种用于活体螺旋藻保鲜的植物精油复合保鲜剂它包括植粅精油混合物、抗坏血酸、蜂蜜和氯化钠，所述的植物精油混合物为包含肉桂精油、丁香精油、大蒜精油和百里香精油中至少两种的混合粅

[0012]所述的植物精油复合保鲜剂中抗坏血酸的浓度为0.2?0.3g/L，蜂蜜的浓度为0.5?1.0g/L氯化钠浓度为0.7?lg/L，植物精油混合物的浓度为30?60yL/L

[0013]上述植物精油混合物中嘚各组分等比例混合。

[0014]上述的用于活体螺旋藻保鲜的植物精油复合保鲜剂采用以下步骤制备:(1)按比例配制植物精油混合物；(2)按比例向植物精油混合物中添加抗坏血酸、蜂蜜、氯化钠形成植物精油复合保鲜剂。

[0015]一种活体螺旋藻饮品的保鲜方法包括以下步骤:

[0016](1)收集培养至对数生長中期的螺旋藻细胞，清洗后得到藻泥；

[0017](2)制备权利要求1?3中任意一项所述的植物精油复合保鲜剂并过滤后注入保鲜容器中；

[0018](3)将步骤(1)所得的藻苨注入保鲜容器内与所述的植物精油复合保鲜剂混匀制成活体螺旋藻饮品；

[0019](4)封闭保鲜容器，并充入含氮气、二氧化碳和氧气的混合气体後置于低温度环境下保存

[0020]所述的混合气体中按体积比氮气占25%，二氧化碳占25%氧气占50%。

[0021]所述的藻泥在活体螺旋藻饮品中的浓度为1?6g/L

[0022]上述方法制备的活体螺旋藻保健饮品。

[0023]上述的植物精油复合保鲜剂在活体螺旋藻保健饮品保鲜中的应用

[0024]采用上述植物精油复合保鲜剂的制备活體螺旋藻饮品的详细步骤:

[0025](1)用400目的滤网收集培养至对数生长中期的螺旋藻细胞，并用生理盐水荡洗三遍得到清洗过的藻泥。

[0026](2)按照一定配比調配好植物精油混合物植物精油混合物的浓度为30?60yL/L。按比例向植物精油混合物中添加抗坏血酸、蜂蜜、氯化钠形成复合保鲜剂与精油混匼的抗坏血酸浓度为0.2?0.3g/L，蜂蜜浓度为0.5?1.0g/LNaCl浓度为0.7?lg/L。用0.22μηι的针头滤器将调配好的复合保鲜剂过滤并注入厌氧瓶中。

[0027](3)第(1)步所得的藻泥注入灭菌嘚厌氧瓶中用移液枪吸取藻泥注入厌氧瓶内，与厌氧瓶保鲜液混匀藻泥浓度为1?6g/L。

[0028](4)封闭厌氧瓶并按体积比充入氮气25%、二氧化碳25%、氧气50%。

[0029](5)将进行完以上操作的厌氧瓶置于4°C的环境中保存

[0030]本发明选择一些天然植物精油类保鲜剂对鲜活藻体进行保鲜，并添加一些天然调味剂來调理饮料的口味使其满足消费者对健康和口味的要求;迎合了人们对原生态食品的追求，具有良好的市场前景

[0031]本发明的有益效果:

[0032]本发奣利用植物保鲜剂、气调及低温等方法，延长了螺旋藻的成活期使其在没有培养基的条件下保持一定时间的活性。

[0033]本发明可避免常规方法制备螺旋藻饮品时除菌所采用的杀死有害细菌的高温或破碎细胞的方法但同时亦杀灭了螺旋藻细胞，并破坏了活体螺旋藻的营养成份降低其营养价值。

[0034]本发明为制作活体螺旋藻保健饮料奠定了基础提供了思路;避免了做成藻粉、藻片导致的营养成分的流失，还可以减尐一些不健康的添加剂的加入使得螺旋藻保健品的品质进一步提尚。

[0035]图1为实施例1中不同浓度精油处理的螺旋藻中细菌数目的变化

[0036]图2为實施例1中不同浓度精油处理后螺旋藻中蛋白浓度的变化。

[0037]图3为实施例1中不同浓度精油处理后螺旋藻细胞中叶绿素含量的变化

[0038]图4为实施例2Φ不同浓度精油处理的螺旋藻中细菌数目的变化。

[0039]图5为实施例2中不同浓度精油处理后螺旋藻中蛋白浓度的变化

[0040]图6为实施例2中不同浓度精油处理后螺旋藻细胞中叶绿素含量的变化。