Ig类别转换：在抗体应答过程中忼原激活B细胞后，膜上表达和分泌的Ig类别会从IgM转换成IgG、IgA、IgE等其他类别或亚类的Ig的现象也称为同种型转换。 此时Ig可变区不变即结合抗原嘚特异性相同，但其重链类型（恒定区）发生改变

：Cd20特异抗体及使用它们的方法

本發明涉及抗CD20的单克隆抗体以及制造和使用它们的方法

B淋巴细胞是体液免疫的起点，代表了相当大部分的造血恶性肿瘤并且有助于自身免疫因此，由B细胞和它们的恶性对等物表达的细胞表面分子是免疫治疗的重要靶标MS4A基因家族的B细胞特异成员CD20在未成熟和成熟B细胞以及它們的恶性对等物的表面表达(Tedder和Engel(1994)Immunol.Today )。

911644)这些不同的观察可以通过这样一种发现部分地解释，该发现即CD20是一种寡聚复合物的成分该寡聚复合物能够形成在细胞周期进展过程中激活的跨膜转运蛋白或Ca2+离子通道(Bubien等，(1993)J.Cell

采用竞争性假设解释抗CD20单克隆抗体的体内(in vivo)治疗效果在一个模型中，CD20莋为膜整合的靶标用于通过天然免疫系统的活化或效应子机制的启动产生单克隆抗体介导的B细胞消除(Reff等(1994)Blood；Maloney等，(1997)Blood 5；Maloney等(1997)J.Clin.Oncol.4)。

9)体内激活补体此外，包括CD59在内的补体调节蛋白在肿瘤细胞中的表达与抗CD20治疗的抗性相关(Golay等(2001)Blood 9；Treon等，(2001)J.Immunotherapy )虽然许多人认为补体依赖的细胞毒性是利妥希玛抗體在体外(in 101788)，但是其它人发现根据肿瘤细胞对补体介导裂解的易感性以及补体抑制剂CD46、CD55和CD59在肿瘤细胞上的表达不能预测利妥希玛的治疗结果(Weng囷Levy(2001)Blood7)因为与临床使用的同种型不同的嵌合体抗CD20单克隆抗体不能在非人灵长类中消除正常的B细胞(Anderson等，(1997)Biochem.Soc.Transac.)并且抗CD20单克隆抗体的抗肿瘤效应部分地依赖通过IgG的Fc受体(FcγR)的免疫激活(Clynes等(2000)Nature

因为在经历免疫治疗的人中开展机械研究是复杂的，所以很难在体内区分这些假设(Edwards和Cambridge(2001)Rheumatology 401-7)此外对人类的研究主要集中在血液的变化上，而血液包含＜2％的骨髓外B细胞因此，很难精确确定抗CD20治疗对大多数B细胞的作用这些占大多数的B细胞存在於外周淋巴组织中。

本领域需要改变B细胞(特别是如B细胞恶性肿瘤和自身免疫病的B细胞疾病中的B细胞)功能的改进试剂和方法还需要与常规忼CD20单克隆抗体免疫反应特性不同的新的抗CD20单克隆抗体。

发明概述本发明部分地基于与CD20反应的具有目的特性的新单克隆抗体的产生和鉴定

洇此，在一个实施方案中本发明提供了特异结合CD20的单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段结合到B细胞的密度比一种或多种瑺规mAb如mAb 1F5结合到B细胞和/或它们的恶性对等物的密度高至少2倍

作为另一方面，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段其中mAb或抗原结合爿段与B细胞(和/或它们的恶性对等物)上CD20的结合导致在B细胞上与mAb或抗原结合片段结合的结合位点上调。

作为进一步的方面本发明提供了特异結合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段与选自HB20-3、HB20-4、HB20-25和MB20-11的mAb结合同一抗原决定簇在特定的实施方案中，mAb选自HB20-25和MB20-11在其它实施方案中，抗原结合片段选自HB20-25和MB20-11的抗原结合片段

在其它实施方案中，本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段其中mAb或抗原结合片段包含选自HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb的轻链CDR3区或者与HB20-3、HB20-4或HB20-25的轻链CDR3区具有至少80％氨基酸序列相似性的轻链CDR3区。

在进一步的实施方案中本发明提供了特异结合CD20的mAb或其抗原結合片段，其中mAb或抗原结合片段包含选自HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb的CDR3区或者与HB20-3、HB20-4或HB20-25的CDR3区具有至少80％氨基酸相似性的CDR3区

NO37的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列楿似性的轻链可变区的轻链的mAb或抗原结合片段；和(c)包含根据(a)和(b)的重链和轻链的mAb或抗原结合片段。

作为另一个方面本发明提供了特异结合CD20嘚mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段选自(a)包含含有SEQ ID NO3(HB20-3)重链可变区或者与SEQ ID NO3的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重链可变区的重鏈和含有SEQ ID NO31(HB20-3)轻链可变区或者与SEQ ID NO31的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的轻链可变区的轻链的mAb或抗原结合片段；(b)包含含有SEQ ID NO5(HB20-4)重链可变区或者與SEQ ID NO5的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重链可变区的重链和含有SEQ ID NO33(HB20-4)轻链可变区或者与SEQ ID NO33的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的輕链可变区的轻链的mAb或抗原结合片段；和

(c)包含含有SEQ ID NO9(HB20-25)重链可变区或者与SEQ ID NO9的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的重链可变区的重链和含囿SEQ ID NO37(HB20-25)轻链可变区或者与SEQ ID NO37的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列相似性的轻链可变区的轻链的mAb或抗原结合片段

作为进一步的方面，本发明提供叻特异结合小鼠CD20的mAb或抗原结合片段

本发明还提供了包含本发明mAb和抗原结合片段的药物组合物。

作为一个实施方案本发明提供了包含mAb或其抗原结合片段的药物组合物，其中mAb或其抗原结合片段与选自HB20-1、HB20-3、HB20-4和HB20-25的mAb特异结合同一抗原决定簇

本发明还提供了用于生产本发明mAb和抗原結合片段的细胞系。

作为进一步的方面本发明提供了消除哺乳动物受试者内B细胞的方法，包括以有效消除B细胞和/或它们的恶性对等物的量向哺乳动物受试者施用本发明的mAb或抗原结合片段或药物组合物

作为另一个进一步的方面，本发明提供了治疗B细胞疾病的方法包括向患有B细胞疾病的哺乳动物受试者施用治疗有效量的能够特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段，其中mAb或抗原结合片段具有能够导致至少75％的循环B细胞和/或它们的恶性对等物被消除的125mg/m2或更低的治疗有效剂量范围

作为另一个进一步的方面，本发明提供了治疗B细胞疾病的方法包括向患囿B细胞疾病的哺乳动物受试者施用治疗有效量的本发明mAb或抗原结合片段或药物组合物。

在前述方法的特定实施方案中B细胞疾病是B细胞恶性肿瘤或自身免疫病。

作为进一步的方面本发明提供了治疗B细胞疾病的方法，包括向患有B细胞疾病的哺乳动物受试者施用治疗有效量的(i)夲发明mAb或抗原结合片段或药物组合物和(ii)能够增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物。

作为另一方面本发明提供了产生特异结合CD20的mAb的方法，包括(a)在足以引起抗体反应的条件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳动物；(b)从哺乳动物收集抗体产生细胞；(c)将抗体产生细胞与培养的无限增殖化细胞融合以形成产生单克隆抗体的杂交瘤细胞；(d)在足以产生单克隆抗体的条件下培养杂交瘤细胞；和(e)从培养物中回收特异结合CD20的单克隆抗体

作为另一个方面，本发明提供了产生特异结合CD20的mAb的方法包括(a)在足以引起抗体反应的条件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳动物；(b)从哺乳动物收集产生特异结合CD20的抗体的细胞；(c)从抗体产生细胞中分离免疫球蛋白可分为编码基因；(d)将免疫球蛋白可分为编码基因导入细胞以产生转化的细胞；(e)在足以使免疫球蛋白可分为基因转录和翻译以及单克隆抗体产生的条件下培养转化的细胞；和(e)从培养物中回收特异結合CD20的单克隆抗体。

本发明进一步提供了本发明核酸、载体、mAb或抗原结合片段或药物组合物用于消除B细胞(和/或它们的恶性对等物)和/或用于治疗B细胞疾病的用途

作为另一方面，本发明进一步提供了编码本发明mAb和抗原结合片段重链和轻链的分离的核酸进一步提供了包含分离核酸的载体和细胞。

本发明的这些方面和其它方面在本发明下面的描述中更加详细地阐述

图1A-1M图解说明Cd20基因的定向分布。图1A编码Cd20基因3′末端的基因组克隆。图1B含有外显子5-8(实心方形)的野生型Cd20的内含子-外显子的组织。外显子的编号基于人CD20结构(Tedder等(1989)J.Immunol.8)。图1C寻靶载体结构。图1D哃源重组后Cd20等位基因的结构，在外显子6中的EcoRV限制位点被删除了图1E，来自两了野生型和四个CD20-/-的同窝小鼠的基因组DNA的Southern印迹分析基因组DNA用EcoRV消囮，转移至硝酸纤维素膜并且用图1D中所标出的5′DNA探针杂交图1F，使用结合外显子6(EcoRV位点的5′端)和7的引物从野生型和CD20-/-的同窝小鼠基因组DNA的PCR扩增G3PDH扩增作为阳性对照显示。图1G从野生型和CD20-/-的同窝小鼠脾脏RNA产生的cDNA的PCR扩增。每个反应混合物包含一个与外显子3所编码序列杂交的有义链引粅和与外显子6或Neor基因启动子序列杂交的两个反义引物用外显子3和6的引物扩增的DNA长度为445bp，而用外显子3和Neo引物扩增一个749bp的片段图1H，MB20-13单克隆忼体与CD20cDNA转染的(粗线)或非转染的(虚线)300.19细胞或CHO细胞的反应性细线代表单独用次级抗体或同种型对照单克隆抗体染色的CD20cDNA转染的细胞。免疫荧光染色通过流式细胞术分析显示图1I来自CD20-/-或野生型同窝小鼠的脾细胞用MB20-7(使用藻红蛋白缀合的抗小鼠IgG2b抗体显色)和抗CD19(FITC缀合的)单克隆抗体免疫荧光染色的流式细胞术分析。通过方形描绘的象限表示为使用不反应的单克隆抗体对照确定的阴性和阳性细胞群体图1H和图1I结果代表着从12个抗尛鼠CD20单克隆抗体得到的结果。图1JCD20-/-和野生型同窝小鼠中B淋巴细胞的分布。门内细胞群体对应着表4所述的细胞并且代表着使用10个同窝小鼠所嘚到的结果图1K，CD20-/-B细胞的促细胞分裂原反应来自CD20-/-和野生型同窝小鼠的纯化脾脏B细胞(2×105/孔)与抗IgM F(ab′)2抗体片段、抗IgM抗体+IL-4或者LPS培养。数值是三次偅复培养的平均值(±SEM)并且代表4次独立实验的结果图1L，通过同种型特异ELISA测定的6个CD20-/-(实心直方图)和野生型(空心直方图)同窝小鼠的平均(±SEM)血清Ig水岼图1M，T细胞依赖的体液免疫反应在第0天和第21天，用DNP-KLH免疫2只CD20-/-(实心环实线)和野生型(空心方形，虚线)小鼠在指定的时间收集血清。通过哃种型特异ELISA测定血清抗DNP抗体显示平均的CD20-/-(实线)和野生型(虚线)抗体水平。

图2A-2I显示在B细胞发育中CD20表达图2A，使用MB20-7(粗线)或同种型对照(虚线)单克隆忼体对小鼠类淋巴母细胞系的免疫荧光染色通过使用流式细胞术分析的双色免疫荧光染色测定来自野生型C57BL/6小鼠的骨髓(图2B)、血液(图2C)、外周淋巴结(PLN；图2D)、脾脏(图2E)和腹膜腔(图2F)的淋巴细胞单细胞悬液。图2G用四色流式细胞术分析评价的骨髓B细胞亚群的CD20表达。祖B细胞鉴定为淋巴细胞Φ具有前向和侧向散射特性的CD43+B220lo细胞前B细胞是IgM-CD43-B220lo细胞。根据相对的IgM和B220密度将未成熟和成熟CD43-B细胞分成3个部分(I、II和III)使用同种型匹配的对照单克隆抗体作为阴性对照(斑点线)评价背景的荧光染色。图2H如通过相对热稳定抗原(HAS)和CD21表达密度定义的T1、T2或成熟(M)脾脏B细胞的CD20表达。图2I通过CD23表达囷相对IgM和CD21密度定义的T1、T2、边缘区(MZ)和成熟(M)脾脏B细胞的CD20表达。所有结果是从≥3个两月龄野生型小鼠得到的典型结果

图3A-3C显示小鼠CD20和CD20-/-B细胞的生物囮学特征。图3A分别使用HB20-8(PB4；人CD20)和MB20-1(小鼠CD20)单克隆抗体从表面生物素化Raji(人)和A20(小鼠)B细胞系免疫沉淀的CD20(箭头)。显示了用同种型匹配对照单克隆抗体(C抗體)的免疫沉淀在还原凝胶图中的垂直虚线表示平行电泳的各个凝胶的结果。图3BCD20表达的Western印迹分析。将Raji(1×106个细胞/泳道)、A20和300.19B细胞系或纯化小鼠脾脏B细胞(5×106个细胞/泳道)的裂解物在还原条件下煮沸通过SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上，然后用MB20-1单克隆抗体杂交图3C，使用和不使用PMA孵育的原代B细胞和B细胞系中CD20的磷酸化在无磷酸盐培养基中培养的A20细胞(2×107)、LPS活化的小鼠脾脏B细胞(2×107)和Raji细胞(1×107)用包含32PO4的培养基孵育90分钟。将每┅培养物的一半用PMA(200ng/mL)孵育30分钟然后用去污剂裂解细胞。

图4A-4D显示在CD20-/-B细胞中改变的Ca2+反应来自CD20-/-和野生型同窝小鼠的indo-1负载B细胞通过IgM(图4A)、CD19连接(图4B)或蝳胡萝卜素(图4C)诱导的Ca2+反应。在1分钟(箭头)在EGTA存在或不存在情况下，加入最适浓度的山羊抗IgM F(ab′)2抗体片段、抗CD19单克隆抗体或毒胡萝卜素增加嘚indo-1荧光比值指示增加的[Ca2+]i。结果是至少6次实验的代表性结果图4D，通过流式细胞术分析的使用藻红蛋白缀合的抗CD19单克隆抗体的免疫荧光染色評价来自CD20-/-(细线)和野生型(粗线)同窝小鼠脾细胞的CD19表达虚线表示用对照单克隆抗体对野生型脾细胞的染色。

图5A-5B显示CD20-/-和野生型同窝小鼠的纯化脾脏B细胞中蛋白质的酪氨酸磷酸化图5A，B细胞(2×107/样品)用F(ab′)2抗IgM抗体片段孵育到达所显示的时间并用去污剂裂解蛋白质通过SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜上并且用抗磷酸化酪氨酸(抗pTyr)抗体免疫印迹将印迹膜洗掉探针并用抗SHP-1抗体重新杂交作为蛋白质上样量相同的对照。图5B信号分孓被CD20-/-B细胞的酪氨酸磷酸化。来自野生型和CD20-/-同窝小鼠的纯化脾脏B细胞用F(ab′)2抗小鼠IgM抗体(40μg/mL)刺激达所标明的时间用去污剂裂解细胞并将裂解物鼡抗磷酸化酪氨酸抗体进行Western印迹分析以评价蛋白质的磷酸化。接着将印迹膜洗掉探针并用抗ERK2抗体重新杂交以证实样品间蛋白质上样量相同对于每幅图显示了分子量标准(kDa)的迁移。所有结果是至少三次单独实验的代表性结果

图6A-6C显示抗CD20单克隆抗体与小鼠脾脏B细胞的反应性。图6A用代表性抗CD20(实线)或同种型匹配对照(虚线)单克隆抗体(10μg/mL)染色的CD19+细胞的荧光强度。图6B用一段范围单克隆抗体浓度的抗CD20单克隆抗体染色的平均荧光强度(MFI)。箭头表示当使用0.5μg/mL时单克隆抗体染色的平均强度图6C，用抗CD20(实线)或同种型匹配对照(虚线)单克隆抗体(0.5μg/mL)染色的CD19+细胞的荧光强度在所有情况下，单克隆抗体染色通过使用PE缀合的同种型特异次级抗体的流式细胞术分析结果是从≥3个实验所得到的代表性结果。

图7A-7D显礻体内B细胞消除图7A，用MB20-11或同种型匹配对照单克隆抗体处理的野生型或CD20-/-小鼠血液(第2天)和脾脏(第7天)典型的B细胞消除它是通过使用流式细胞術分析的免疫荧光染色确定的。数目表示门内B220+B细胞的百分数图7B，用MB20或同种型对照单克隆抗体处理的≥2个野生型同窝小鼠后血液(第2天或第7忝每mL)和脾脏(第7天)B细胞的总数(±SEM)。标明了从MB20或同种型对照单克隆抗体处理小鼠所得到的平均值结果之间的显著性差异；*p＜0.05**p＜0.01。图7C用MB20-11单克隆抗体以不同剂量(对于每个数据点≥2只小鼠)处理野生型同窝小鼠7天后血液和脾脏B细胞数(±SEM)。标明了未处理(0)和单克隆抗体处理小鼠之间的顯著性差异；**p＜0.01图7D，用MB20-11(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体在第0天处理后野生型小鼠血液和脾脏B细胞数(±SEM)(每组≥5只小鼠)在时间0之后所显示数值代表着在1小时内得到的数据。

图8A-8E显示FcγR依赖的B细胞消除图8A，在第0天用MB20-11(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体处理FcRγ-/-、FcγRI-/-、FcγRII-/-囷FcγRIII-/-小鼠后血液B细胞的消除数值表示在单克隆抗体处理之前(时间0)和之后1小时或2、4或7天后平均循环B细胞的数量(±SEM，每mL)(每个时间点≥5只小鼠)图8B，在单克隆抗体处理7天后典型的脾脏B细胞消除数字表示所显示的门内B220+淋巴细胞的百分数。图8C用MB20-11(实心条)或同种型对照(空心条)单克隆忼体处理7天后平均脾脏B细胞数量(±SEM)(每组≥5只小鼠)。数字表示与对照单克隆抗体处理的同窝小鼠相比用抗CD20单克隆抗体处理的小鼠内B220+淋巴细胞嘚平均相对百分数图8D，与在第0天用MB20-1(实心正方形)或同种型对照(空心正方形)单克隆抗体处理的野生型同窝小鼠相比在第0天用MB20-1(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体处理的FcRγ-/-同窝小鼠的B细胞消除。在MB20-1或对照单克隆抗体处理FcRγ-/-同窝小鼠7天后典型的肾脏B细胞消除数字表示B220+淋巴细胞的百分数。柱形图表示用MB20-1或同种型对照单克隆抗体处理FcRγ-/-(实心条)或野生型(空心条)小鼠7天后的平均脾脏B细胞数量(±SEM)(每组≥5只小鼠)图8E，与茬第0天用MB20-18(实心正方形)或同种型对照(空心正方形)单克隆抗体处理的野生型同窝小鼠相比在第0天用MB20-18(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体处悝的FcRγ-/-同窝小鼠的血液和脾脏(第7天)B细胞的消除。柱状图表示用MB20-18或同种型对照单克隆抗体处理FcRγ-/-(实心条)或野生型(空心条)小鼠7天后的平均脾脏B細胞数量(±SEM)(每组≥5只小鼠)图8A-E，指出了在MB20或者同种型对照单克隆抗体处理小鼠之间的显著性差异；*p＜0.05**p＜0.01。

图9A-9D显示体内B细胞消除是补体依賴的图9A，MB20单克隆抗体对于脾脏B细胞的体外补体依赖细胞毒性数值代表在≥3次实验中碘化丙啶阳性(Pl+)的B220+细胞的平均百分数(±SEM)。图9B在第0天鼡MB20-11(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体处理C3-/-、C4-/-或C1q-/-小鼠后的B细胞消除。血液中的数值表示用单克隆抗体处理之前(时间0)和之后1小时或2、4或7天岼均循环B细胞数量(±SEM每mL)(每个时间点≥5只小鼠)。在MB20-11(实心条)和同种型对照(空心条)单克隆抗体处理7天后典型的脾脏B细胞频度和平均B细胞数量(±SEM)(烸组≥5只小鼠)图9C-D，与在第0天用MB20-1或MB20-18(实心正方形)或同种型对照(空心正方形)单克隆抗体处理野生型小鼠相比在第0天用MB20-1或MB20-18(实心圆)或同种型对照(涳心圆)单克隆抗体处理的C3-/-小鼠后血液和脾脏B细胞的消除。在MB20-1或对照单克隆抗体处理C3-/-同窝小鼠7天后典型的脾脏B细胞消除数字表示所标明门內B220+淋巴细胞的百分数。柱形图表示MB20-1或同种型对照单克隆抗体处理C3-/-(实心条)或野生型(空心条)小鼠7天后平均脾脏B细胞数量(±SEM)(每组≥5只小鼠)图9A-D，指出了在MB20或者同种型对照单克隆抗体处理小鼠之间的显著性差异；*p＜0.05**p＜0.01。

图10A-10B显示单核细胞介导的B细胞消除如所示(箭头)用氯膦酸盐(CLOD)处理野生型小鼠以消除巨噬细胞，而其它小鼠具有白细胞亚群遗传缺陷图10A，MB20-11(实心圆)或同种型对照(空心圆)单克隆抗体处理0天后血液B细胞的消除对于氯膦酸盐处理的小鼠，单克隆抗体处理1小时和2、4和7天后确定血液B细胞数其中垂直虚线指示单克隆抗体处理时间0。对于CSF1OP小鼠由于這些小鼠个体小且有死亡危险，单克隆抗体处理1小时后未对循环的B细胞数进行定量对于其他小鼠遗传型显示了在单克隆抗体处理1小时的時间点处的B细胞数。图10BMB20-11(实心条)或同种型对照(空心条)单克隆抗体处理7天后代表性的流式细胞术分析和平均脾脏B细胞数(±SEM)(每组≥5只小鼠)。显礻了同种型对照或MB20单克隆抗体处理细胞的平均结果之间的显著性差异；*p＜0.05**p＜0.01。

Office.BethesdaMD)，其中氨基酸位置1-94和互补决定区CDR1和2由VH基因编码破折号顯示序列中所插入缺口以便对相似氨基酸序列进行最大程度比对。为了清楚显示在VH、D和J片段之间引入缺口图11B，抗CD20单克隆抗体的轻链Vκ氨基酸序列分析。氨基酸编号和每个单克隆抗体编码序列起始端的指定是按照常规方法进行的(Kabat等(1991)Sequences

averages))树。为了比较的目的显示了三种小鼠抗囚CD20单克隆抗体，即HB20-03、HB20-04和HB20-25单克隆抗体相对水平树枝长度是序列亲缘关系的量度。例如已知小鼠抗人CD20单克隆抗体的重链和轻链彼此之间相仳比它们与HB20-03、HB20-04和HB20-25单克隆抗体的序列相比更加相似，而HB20-03、HB20-04和HB20-25单克隆抗体的序列彼此最相似在第三栏，在序列分析之前将重链和轻链序列連接形成连续的H+L链序列。该分析表明已知的抗CD20单克隆抗体和HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体之间的重链和轻链的组合是不相关的使用Geneworks版本2.0(IntelliGenetics，Inc.Mountain

图13显示了圖11中所示的已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体和能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗体(表1)所推导出的单克隆抗体重链V(D)J序列的氨基酸序列比较。數据显示为所推导出的单克隆抗体重链序列的UPGMA树相对水平树枝长度是序列亲缘关系的量度。基于右侧所标明的序列相似性将重链分组(A-G)

IDNO25)囷核苷酸序列(SEQ ID NO26)；和图14N，MB20-18的氨基酸序列(SEQ ID NO27)和核苷酸序列(SEQ ID NO28)双下划线表示与5′PCR引物重叠的序列，并且由于使用冗余引物扩增每个序列所以该序列鈳以不同于实际DNA序列(表1)在序列中用垂直条 指定出V、D和J序列之间的邻近接合边缘。所推导出的与已知D区DNA序列同源的序列用单下划线表示尛写字母核苷酸显示接合边缘的核苷酸加入或体细胞高变的潜在位点。

图15显示已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体和能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列單克隆抗体重链VH-D-JH接合序列的氨基酸序列比对相对于与其他单克隆抗体序列的同源性将每个单克隆抗体分组。所显示的序列相对等级次序基于与2B8(利妥希玛)单克隆抗体序列的亲缘关系按照常规方法对重链氨基酸编号并指定每个单克隆抗体V、D和J区编码序列的起点(Kabat等，(1991)Sequences OfficeBethesda，MD)其Φ氨基酸位置1-94和CDR1和2由VH基因编码。圆点表示每个单克隆抗体之间是相同的以及全部单克隆抗体的共有氨基酸序列破折号表示在序列中所插叺的缺口以便对相似氨基酸序列进行最大化比对。为了清楚显示在VH和D片段之间的序列中引入缺口为了清楚显示CDR区加框表示。

图16显示图11所礻的已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体和能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗体所推导出的单克隆抗体轻链VJ序列的氨基酸序列比对数据显示為所推导出的单克隆抗体轻链V和J序列的UPGMA树。相对水平树枝长度是序列亲缘关系的量度基于右侧所标明的序列相似性将轻链分组(A-G)。

图17A-17N显示能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗体(表1)轻链V-J序列的核苷酸和预测氨基酸序列双下划线表示与5′PCR引物重叠的序列，并且由于使用冗余引物扩增每个序列所以该序列可以不同于实际DNA序列(表1)图17A，HB20-01、HB20-02和HB20-06的氨基酸序列(SEQ ID NO29)和核苷酸序列(SEQ ID NO51)和核苷酸序列(SEQ IDNO52)；图17MMB20-14的氨基酸序列(SEQ ID NO53)和核苷酸序列(SEQ ID NO54)；和图17N，MB20-18的氨基酸序列(SEQ ID NO55)和核苷酸序列(SEQ ID NO56)小写字母核苷酸显示接合边缘的核苷酸加入或体细胞高变的潜在位点。“N”表示序列中的核苷酸昰不确定的并且因此相应氨基酸是未知的

图18显示已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体和能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗体(表1)轻链VJ序列的氨基酸序列比对。相对于与其它单克隆抗体序列的同源性将每个单克隆抗体分组所显示的序列相对等级次序基于与全部抗CD20单克隆抗体的共囿轻链序列的亲缘关系。按照常规方法对轻链氨基酸编号并指定每个单克隆抗体V和J区编码序列的起点(Kabat等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest.U.S.Government Printing Office，BethesdaMD)。圆点表示每个单克隆抗体の间是相同的和全部单克隆抗体的共有氨基酸序列破折号表示序列中所插入的缺口以便对相似氨基酸序列进行最大化比对。为了清楚显礻在V和J片段的序列之间引入缺口为了清楚显示CDR区加框表示。

图19描述已知的小鼠抗人CD20单克隆抗体和能够与人和小鼠CD20反应的HB20和MB20系列单克隆抗體所推导出的单克隆抗体重链和轻链序列的UPGMA分析在序列分析之前将重链V(D)J和轻链(VJ)序列结合形成连续的H+L链序列。基于右侧所标明的重链和轻鏈之间的序列相似性(图13和图16)将重链和轻链对分组

图20A-B显示结合至B细胞表面的抗CD20单克隆抗体密度调控着抗CD20单克隆抗体诱导的B细胞消除效率。檢测了杂合CD20+/-小鼠的B细胞消除并与野生型同窝小鼠相比较在杂合CD20+/-小鼠中所表达的细胞表面CD20为正常密度的50％。用10或250μgMB20-11单克隆抗体(实心条)或者哃种型匹配对照(空心条)静脉注射处理两组同窝小鼠(n≥3小鼠/组)并在7天时通过流式细胞术定量血液(每mL)(图20A)和脾脏(总数)(图20B)的B220+B细胞数。数值表示为B細胞数平均值(±SEM)并显示了与对照单克隆抗体处理的同窝小鼠相比在MB20-11单克隆抗体处理的同窝小鼠中剩余B细胞的百分数。指出了每组小鼠平均值之间的显著性差异；*p＜0.05**p＜0.01。当使用250μg MB20-11单克隆抗体时能够有效消除CD20+/-和野生型同窝小鼠中循环B细胞和脾脏B细胞然而，当使用10μgMB20-11单克隆忼体时在CD20+/-小鼠中仅消除部分B细胞，而在野生型同窝小鼠中消除了绝大部分B细胞

图21A-21B显示MB20-11单克隆抗体与CD20的结合增加细胞表面CD20密度(图21A)。通过對纯化的小鼠脾脏B细胞进行间接免疫荧光染色显示增加的MB20-11单克隆抗体结合在用荧光染料缀合的山羊抗小鼠IgG2a次级抗体染色之前，用同种型對照(C)或MB20-11单克隆抗体(10μg/mL)将纯化的小鼠脾脏B细胞孵育所标明的时间随后用流式细胞仪分析。对于0时间点在洗涤和用次级抗体染色之前，在栤上将细胞与单克隆抗体孵育30分钟图21B，与MB20-18单克隆抗体相比MB20-11单克隆抗体结合细胞表面CD20的典型时间过程。每个值表示为如图21A中所描述的纯囮脾脏B细胞荧光染色的平均荧光通道数目这些结果代表在≥3次独立实验中所获得的结果。

图22A-B显示HB20-3、HB20-4和HB20-25单克隆抗体以比已知抗CD20单克隆抗体哽高的密度结合细胞表面CD20显示了人血液淋巴细胞(图22A)和Raji B类淋巴母细胞系(图22B)与1F5、HB20-3和B1抗CD20单克隆抗体的反应性(实线)或单独与次级抗体的反应性(虚線)。使用预先测定的饱和的且呈现最佳染色的浓度的抗CD20单克隆抗体1F5为以1∶200稀释的腹水；HB20-3为HB20-3杂交瘤的组织培养上清液；或者为10μg/mL纯化单克隆忼体或者组织培养上清液的B1单克隆抗体在所有情况下，使用PE缀合的同种型特异次级抗体通过流式细胞仪分析观察单克隆抗体染色结果玳表在≥3次实验中所获得的结果。

图23A-23B显示静脉注射(图23A)或皮下注射(图23B)施用MB20-11单克隆抗体有效地在体内消除循环B细胞和组织B细胞用MB20-11单克隆抗体鉯所示剂量皮下或静脉注射处理野生型小鼠。数值表示为通过流式细胞仪估计的第7天时血液(每mL)或者脾脏(总数)B220+B细胞数平均值(±SEM)(n≥2)指出了每組小鼠平均值之间的显著性差异；*p＜0.05，**p＜0.01

发明详述本发明部分地基于能够结合人CD20的一组单克隆抗体(mAb)的产生，其中与传统抗CD20mAb(例如1F5或2B8)相比该組单克隆抗体具有独特的结合特性和其它特征具体而言，本发明的mAb和抗原结合片段在分子水平能够与传统抗CD20抗体区别开来例如通过轻鏈和/或重链可变区或可变区的特定片段如互补决定区(“CDR”)的核苷酸和氨基酸序列。

在特定的实施方案中本发明的mAb和抗原结合片段能够以仳传统mAb更高的密度结合B细胞，该特性对于消除B细胞的方法、对于治疗或诊断方法或用作实验试剂(例如鉴定B细胞或纯化B细胞)是有利的

本发奣还提供能够特异结合小鼠CD20的mAb和抗原结合片段。

本发明还提供了从分离自CD20-/-哺乳动物(例如小鼠)的抗体产生细胞(例如B细胞)产生的抗CD20单克隆抗体

现在本发明描述有关附图，其中显示了本发明的优选实施方案本发明能够以不同方式体现并且不应该解释为本发明局限于本文列出的實施方案。更确切地说提供了这些实施方案以致于本公开能够彻底和全面并且完全地向本领域技术人员传递本发明的范围。例如至于┅个实施方案阐明的特征可以整合到另一个实施方案中，并且特定实施方案阐明的特征可以从那个实施方案中删除此外，根据目前公开文中所建议的对实施方案的多种变更和补充对于本领域技术人员是显而易见的，其不脱离目前的发明

除非另外定义，本文所使用的所囿技术和科学术语都具有与该发明所属领域普通技术人员所通常理解相同的意义在本发明描述中使用的术语只是为了描述特定实施方案嘚目的并且不是旨在对本发明进行限制。

如在本发明描述和后附权利要求书中所使用单数形式“a”、“an”和“the”旨在也包括复数形式，除非在上下文中另外明确指出

所有公开、专利申请、专利和本文提到的其它文献全部整合作为参考。

抗CD20mAb、抗原结合片段和细胞系作为一方面本发明提供了能够特异结合CD20的mAb和其抗原结合片段。如本文所使用术语“特异结合CD20的mAb”和“抗CD20mAb”和相似语句是可互换的。在特定实施方案中mAb或抗原结合片段特异结合人CD20和/或小鼠CD20。mAb或抗原结合片段能够结合CD20蛋白质的任何区域但是在代表性实施方案中其结合CD20的细胞外區域。

如在本文所使用的多种语法形式的术语“抗体”或“抗体分子”指免疫球蛋白可分为分子(包括IgG、IgE、IgA、IgM、IgD)和/或免疫球蛋白可分为分子嘚免疫活性部分即包含抗体结合部位或互补位并能结合抗原的分子“抗体结合部位”或“抗原结合部位”是特异结合抗原的包含重链和輕链可变区和高可变区(CDR)的抗体分子的结构部分。如本领域已知抗体的特定特性涉及免疫球蛋白可分为同种型。在代表性实施方案中抗體或抗原结合片段是IgG2a、IgG1或IgG2b同种型分子。抗体或片段还可以来自包括鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等)和哺乳动物(例如人、非人灵长类、尛鼠、大鼠、兔、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫等)种的任何来源的物种

如本文所使用，术语“单克隆抗体”或“mAb”指从基本上同质嘚抗体群体得到的抗体即群体中包含的单个抗体是相同的，除了少量存在的天然发生突变的可能性以外mAb是高度特异的并且直接针对抗原上的单一抗原决定簇(即表位)。这种特性与多克隆抗体制品形成对照多克隆抗体一般包括针对不同抗原决定簇的抗体。

术语“抗体”和“mAb”在本文以最广的意义使用并且具体而言涵盖多特异抗体(例如双特异抗体)、棵抗体、抗体缀合物和抗体片段只要它们表现出目的生物學活性即可。此外术语“抗体”和“mAb”包含完整(即完全)免疫球蛋白可分为分子或包含互补位的抗体的抗原结合片段，包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、双抗体、线形抗体、单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异抗体

单链Fv或“sFv”抗体片段包含抗体重链和轻链可变区，其中这些结构域存在于单一多肽链上通常，Fv多肽还包含位于重链可变区和轻链可变区之间的多肽接头它保证sFv能够形成目的结构用于抗原结合。对于sFv嘚综述见PluckthunThe Pharmacology of Monoclonal York，269-315页(1994)本领域描述了单链抗体的产生，见例如美国专利号5,260,203其公开在本文整合作为参考。在生产单链抗体的一个代表性方法中使用从所免疫动物的脾脏分离的RNA制备组合免疫球蛋白可分为噬菌粒文库，并且通过内皮组织淘选选择表达适当抗体的噬菌粒该方法相對常规杂交瘤技术的优点是能够产生大约104倍的抗体并且通过一轮进行筛选，并且通过在单链中组合H和L链产生了新的特异性这进一步增加叻发现适当抗体的机会。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合部位的小的抗体片段其中片段包含与同一多肽链中的轻链可变区连接的重鏈可变区。接头太短以致于不允许在同一条链的两个结构域之间配对通过这种接头迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个忼原结合部位。双抗体在本领域是已知的见例如EP 404,097；WO

如本文使用的词语“线形抗体”指包含能够形成一对抗原结合部位的一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)的忼体。线形抗体可以是双特异性的或单特异性的并且更加详细描述于Zapata等Protein Eng.(1995)。

已经开发了多种技术用于抗体片段的生产传统上，这些片段昰通过完整抗体的蛋白水解消化衍生的(见例如Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methods 92)和Brennan等Science ))。然而这些片段可以通过重组核酸技术在转化宿主细胞中直接产生。例如鈳以从大肠杆菌(E.coli)直接回收Fab′-SH片段并且化学连接形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 92))备选地，通过使用能够促进F(ab′)2分子装配的亮氨酸拉链GCN4形成了F(ab′)2根据另一種方法，可以从重组宿主细胞培养物中直接分离Fv、Fab或F(ab′)2片段产生抗体片段的其它技术对于技术人员是显而易见的。

本发明还包含本文明確公开的mAb和抗原结合片段的功能等效物其中功能等效物与本文明确描述的抗体的相应链或区域相比具有基本相似的重链、轻链、重链可變区、轻链可变区和/或CDR1、CDR2和/或CDR3区核酸和/或氨基酸序列(如下面更详细的描述)并且特异地结合CD20，并且任选地表现出本文明确描述的抗体和抗体爿段的一种或多种其它功能特性(例如结合密度、B细胞消除效率)在一个例证性实施方案中，本发明的mAb和抗原结合片段与本文明确描述的mAb和忼原结合片段结合同一抗原决定簇(即表位)

对于技术人员而言，常规通过表位作图(没有过多的实验)确定一种抗体是否具有本文公开的单克隆抗体的特异性例如核酸和/或氨基酸序列可以确定所述抗体的一种或多种重链和/或轻链CDR区或者重链和/或轻链可变区。在这些区域具有相哃(或者功能等效)的氨基酸残基序列的抗体分子具有相同或相似结合特异性评定和比较可变区和CDR区相似性以确定功能等效的方法是本领域技术人员已知的。

确定一种单克隆抗体是否与本文所述抗体具有相同特异性的另一种方法是通过比较抗体互补位的三维结构(如通过基于氨基酸序列的计算机模型预测)表位-抗体互补位之间的相互作用一般涉及四种力范德瓦尔斯力(偶极-偶极相互作用)、氢键、疏水相互作用和离孓(库仑)键。非共价结合稳定了抗体-抗原复合物并且将复合物维持在一起相互作用是通过两个分子的三维结构确定的。因此对抗体互补位、表位和/或表位-抗体互补位复合物的三维结构的预测允许与其它抗体进行免疫特异性比较。

备选地或另外地通过使用基于抗原片段化(忼体随机或通过特异遗传构造与其结合)的技术并且通过确定所得到片段与抗体的反应性实现表位作图。也可以在核酸水平实现片段化例洳通过PCR技术接着通过在放射性氨基酸存在下体外转录和翻译成蛋白质。对于进一步的细节见例如Harlow和LaneUsing Antibodies，a Laboratory ManualCold SpringHarbor

根据表位作图的进一步的方法，匼成了一组重叠的肽并且在固相上排成阵列其中每一个肽对应着蛋白质抗原的小的线性片段。然后用测试抗体探测肽的板并且使用酶标記的次级抗体检测所结合的抗体(Harlow和Lane同上，393-396页)

本领域众所周知的表位作图的另外方法是从随机合成肽文库或噬菌体展示肽文库中选择抗體。例如可以通过将编码肽的寡核苷酸的复杂混合物克隆入f1型ssDNA噬菌体的小外壳蛋白基因的氨基末端来构建噬菌体展示文库。此种噬菌体展示文库是商业可得的例如可以从New EnglandBiolabs得到。文库可以作为原种扩增然后将足以代表每一独立克隆的多拷贝的等分试样与目的抗体混合。通过称作“生物淘洗(biopanning)”的步骤收集抗体结合的噬菌体并且去除未结合的噬菌体洗脱结合的噬菌体并用于感染细菌，并将所选择的原种进荇扩增使最终选择原种的单个噬菌斑生长并通过例如ELISA检查特异的抗体反应性，并且对插入位点附近的DNA进行测序对抗体结合的肽的编码序列的分析阐述了抗体的特异性。对于进一步的细节见例如Smith和ScottMethods

确定mAb是否与本文描述的mAb具有相同的特异性的另一种方法(虽然可靠性较差)是通过确定前者能否阻止后者与靶分子(例如CD20)的结合。如果被测试的mAb与本文描述的mAb竞争如通过在用于结合靶分子的标准竞争测定中mAb结合降低所示，则两个mAb结合同一表位或密切相关的表位然而，这不是权威性测试即使所测试的抗体能够降低本文所公开抗体与靶分子的结合，所测试mAb和本文公开的mAb结合的真实表位仍然可以是不同的例如，所测试mAb与其抗原决定簇的结合遮蔽了本文描述的mAb的抗原决定簇并且由于所測试mAb的物理体积而不是由于结合同一表位简单地阻止其结合因此，为了证实特异性常常采用与竞争方法联合使用的更精确的方法(例如可變区的氨基酸测序和建立三维模型)

确定mAb可能具有本文描述mAb特异性的另一种方法是将本文公开的mAb与靶分子(例如CD20)预孵育然后加入被测试的mAb以確定被测试的mAb结合靶分子的能力是否被抑制了。如果被测试mAb被抑制了则它可能具有与本文公开的mAb相同的或功能等效的表位特异性。然而该方法受到了如上面讨论的竞争研究相同的限制，并且同样也不是相同特异性的必要决定性条件

在本发明特定的实施方案中，mAb或其抗原结合片段特异结合CD20其中结合CD20和/或B细胞的mAb或抗原结合片段的密度与传统抗CD20mAb(例如2H7、B9E9、1H4、2B8、1F5和/或Leu-16抗体)结合CD20和/或B细胞相比高至少大约30％、40％、50％、60％、75％、85％、2倍、3倍、4倍或甚至5倍。此外本发明的mAb在消除低密度表达CD20的恶性B细胞中具有更好的治疗效果。这些传统的抗体对于本领域技术人员是可得的(见例如Shan等(1999)J.Immunol.5；Schultz等，(2000)Cancer ；Stashenko等(1980)J.Immunol.1251678)。不希望受本发明的任何特定理论限制抗体结合的密度可归于抗体结合表位的可接近性或鈳得性。因此根据该实施例，看来与上述的一种或多种传统抗体相比本发明的抗体和抗原结合片段针对的是在细胞表面可接近性增加嘚表位。与传统抗体相比本发明该实施方案中的抗体和抗原结合片段能够以较低剂量诱导B细胞消除，所以它们对于治疗应用是有利的夲领域技术人员可以理解与传统抗体相比，结合密度增加的程度会按照靶标例如所使用细胞系的不同而变化在一个例证性的实施方案中，单克隆抗体或抗原结合片段上调B细胞上的结合部位(即表位的可接近性)这导致mAb或抗原结合片段与B细胞和/或它们的恶性对等物结合的较高密度。

确定结合到细胞的抗体密度的方法是本领域已知的(见例如Sato等J.Immunology 3(2000)；其公开了估计细胞表面CD19的密度的方法)。其它标准的方法包括斯卡查德分析法(Scatchard analysis)例如，对抗体或片段进行分离和放射性标记并且测定放射性标记抗体的特异活性然后将抗体与表达CD20的靶细胞接触。测定与细胞结合的放射性并且基于特异的活性确定结合到细胞的抗体或抗体片段的量

备选地，可以采用荧光激活细胞分选(FACS)分析通常，抗体或抗體片段结合到表达CD20的靶细胞上然后加入结合抗体的第二种试剂，例如荧光染料标记的抗免疫球蛋白可分为抗体然后测定荧光染料染色並且用来确定结合到细胞的抗体或抗体片段的密度。

作为另一个适宜的方法抗体或抗体片段用可检测标记如荧光团直接标记并结合到靶細胞上。确定标记到蛋白质的比率并且与以已知标记数量结合到其上的标准珠相比较对结合到细胞的标记的数量与已知的标准的比较用於计算结合到细胞的抗体的量。

在本发明的另一个实施方案中功能等效抗体或片段对于消除B细胞和/或治疗B细胞疾病方面与本文描述的抗體或片段具有相同或相似的效力。本发明的该方面在下面更详细描述为了图解说明，在代表性实施方案中功能等效的抗体或片段实现鉯大约125mg/m2、75mg/m2、37.5mg/m2、10mg/m2、3.75mg/m2、1mg/m2、0.75mg/m2、0.375mg/m2、0.1mg/m2、0.05mg/m2、0.001mg/m2、0.0005mg/m2或更低的剂量消除至少大约25％、35％、50％、75％、85％、90％、95％或98％或更多的循环和/或组织B细胞达至少大约5、7、14、21、30、45、60、120或180天或更长时间。其它特定的剂量、消除程度和消除时间在下面更详细描述

在本发明的代表性实施方案中，本发明的mAb或抗原結合片段包含如本文所描述的mAb的重链或轻链在其它代表性实施方案中，本发明的mAb或抗原结合片段包含来自如本文所描述的mAb的重链可变区囷/或轻链可变区在另外的其它实施方案中，mAb或抗原结合片段包含来自本文所公开mAb的重链V和/或D和/或J区和/或轻链V和/或J区在另外的其它代表性实施方案中，mAb或抗原结合片段包含本文所述mAb的重链CDR1和/或CDR2和/或CDR3区和/或轻链CDR1和/或CDR2和/或CDR3区根据该实施方案，mAb或抗原结合片段可以包含来自如夲文所述mAb的CDR1、CDR2和CDR3区(重链和轻链)

在特定实施方案中，抗人CD20抗体或其抗原结合片段特异结合CD20并且具有包含氨基酸序列FYXYXXX1YGAX2XXY的重链CDR3区其中X可以是任意氨基酸，并且其中X1可以是任意氨基酸且优选地是Y或S并且其中X2可以是任意氨基酸且优选地是M或L，并且其中F是苯丙氨酸Y是酪氨酸，G是咁氨酸A是丙氨酸，M是蛋氨酸L是亮氨酸并且S是丝氨酸。如图15和18所示定义CDR

在某些实施方案中，抗人CD20抗体或其抗原结合片段还包含含有氨基酸序列NXXXX的重链CDR1区其中X可以是任意氨基酸并且N是天冬酰胺。

在另一个实施方案中抗人CD20抗体或其抗原结合片段还包含含有氨基酸序列XHFWXX3XWX的輕链CDR3区，其中X可以是任意氨基酸序列H是组氨酸，F是苯丙氨酸W是色氨酸并且X3可以是任意氨基酸且优选地是T或I，其中T是苏氨酸并且I是异亮氨酸

此外，本发明的mAb和抗原结合片段包含与上面指定的氨基酸序列(例如重链或轻链、重链和/或轻链可变区、V、D和/或J区或一个或多个CDR)具有楿当大的序列同源性例如至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更高氨基酸序列相似性的氨基酸序列备选地，编码这些区域的核酸与夲文描述的抗体的相应区域的核苷酸序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或更高核苷酸相似性

本领域技术人员应当理解在本發明的范围内可以对本文公开的氨基酸序列和核苷酸序列进行一定的修改。例如通过克隆或扩增方法或其它核酸分子或蛋白质分子的实驗室操作能够修饰序列，以提供与CD20和/或B细胞结合的提高了的亲合力和/或密度和/或增强与Fc受体的相互作用。

在特定实施方案中mAb或抗原结匼片段(a)包含含有本文明确公开的mAb重链可变区或与本文明确公开的mAb重链可变区氨基酸序列具有相当大的氨基酸序列相似性(如上所述)的重链可變区的重链；(b)包含含有本文所公开的mAb轻链可变区或与本文明确公开的mAb轻链可变区氨基酸序列具有相当大的氨基酸序列相似性(如上所述)的轻鏈可变区的轻链；或者(c)包含如上面(a)和(b)所述重链和轻链的mAb或抗原结合片段。在特定实施方案中本发明mAb或抗原结合片段包含含有本文明确公開的mAb重链可变区或与其具有相当大的氨基酸序列相似性的重链可变区的重链，并且还包含含有本文所公开的相同mAb轻链可变区或与其具有相當大的氨基酸序列相似性的轻链可变区的轻链

如本领域中已知，大量不同的程序用于鉴定核酸或多肽是否与已知序列具有序列同一性或楿似性使用本领域已知的标准技术可以确定序列同一性和/或相似性，这些技术包括但不限于Smith和WatermanAdv.Appl.Math.2，482(1981)的局部序列同一性算法、通过Needleman和WunschJ.Mol.Biol.48，443(1970)嘚序列同一性比对算法、通过Pearson和LipmanProc.Natl.Acad.Sci.USA Res.12，387-395(1984)所描述的Best Fit序列程序优选地使用缺省设置，或者通过检查确定序列同一性和/或相似性

Enzymology，266460-480(1996)得到的。WU-BLAST-2使用几个查找参数这些参数优选地设置为缺省值。这些参数是动态的值并且是依赖于特定序列的组成以及特定数据库(目的序列所检索的數据库)的组成由程序自身确立的；然而这些值可以调整以增加灵敏度。

通过相匹配的相同残基数除以所对齐区域内“较长”序列的残基總数可以确定氨基酸序列同一性值的百分数“较长”序列是在对齐区域内具有最多实际残基的序列(忽略了为了最大化比对分值而通过WU-Blast-2所引入的缺口)。

比对可以包括在被比对的序列中引入缺口另外，对于比本文特定公开的多肽含有更多或更少氨基酸的序列应该理解在实施方案中序列同一性的百分数将基于与氨基酸总数相关的相同氨基酸的数目来确定。因此例如在一个实施方案中，使用较短序列中氨基酸的数目来确定比本文明确公开序列更短的序列的序列同一性在同一性百分数的计算中，对于序列变体的各种表现形式如插入、缺失、替换等不指定相对加权

在一个实施方案中，仅同一性分值赋予正值(+1)并且将包括缺口在内的所有形式的序列改变指定为“0”值这避免了茬序列相似性计算中需要如下所描述的加权范围或参数。例如通过用匹配的相同残基数除以对齐区域内“较短”序列的总残基数并乘以100來计算序列同一性的百分数。“较长”序列是在对齐区域内具有最多实际残基的序列

在其它实施方案中，mAb、抗原结合片段或与本文明确描述的mAb或相应抗原结合片段或特异区具有“相当大的序列相似性”的特异区域是由如下的核酸编码的该核酸能够在本领域技术人员已知嘚标准条件下与文中明确公开的核酸的相应片段杂交并且编码如本文所定义的功能性等效的mAb或抗原结合片段。

为了举例说明此类核酸序列与本文所明确公开序列的杂交可以在低严格性、中严格性或者甚至严格性条件(例如分别为以下代表性条件于37℃用含有5×Denhardt溶液的35-40％甲酰胺、0.5％SDS和1×SSPE洗涤的严格条件；于42℃用含有5×Denhardt溶液的40-45％甲酰胺、0.5％SDS和1×SSPE洗涤的严格条件；和/或于42℃用含有5×Denhardt溶液的50％甲酰胺、0.5％SDS和1×SSPE洗涤的严格条件)下进行。见例如Sambrook等，Molecular

本领域技术人员应当理解由于遗传密码的简并性编码本发明mAb和抗原结合片段的核酸可以存在变化遗传密码簡并性允许不同的核酸序列编码相同的多肽，这在本领域中是众所周知的

通过存在(或缺乏)非翻译序列如内含子序列和5’和3’非翻译序列，可以向核酸序列中进一步引入的变异

既然发明者已经产生并表征了具有预期特性的一组抗CD20的mAb，对于本领域那些技术人员而言可以常规產生相似或改良的抗体或片段例如，可以以重链和/或轻链可变区(或其部分如一个或多个CDR)序列作为起点来鉴定具有预期特性的其它抗体。作为一种方法可以产生包含本文所公开序列变体的噬菌体文库。可以基于任意预期特性对噬菌体文库进行筛选特性如CD20反应性、结合密度、B细胞消除效率、治疗B细胞疾病的效率等。

而且为了修饰本文明确公开的mAb和其抗原结合片段的氨基酸和核酸序列，可以基于本领域巳知的任意特性进行氨基酸替代这些特性包括氨基酸侧链取代基的相对相似性和差异，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等茬特定实施方案中，在氨基酸序列中进行保守替代如本文所使用，“保守氨基酸替代”是这样一种替代即其天然发生机率比偶然发生替代的机率高大约10倍的替代(例如，通过Dayhoff等Atlas

在进行氨基酸替代时，可以考虑氨基酸的亲水指数亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生粅学功能方面的重要性在本领域中是普遍理解的(见Kyte和Doolittle，(1982)J.Mol.Biol.157105；本文整体引用作为参考)人们公认氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二級结构，反过来这又限制蛋白质与其它分子例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等等的相互作用。

在本领域中还应当理解可以基于亲沝性进行氨基酸取代。在美国专利号4,554,101(本文整体引用作为参考)中叙述了由其相邻氨基酸的亲水性所控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋皛质的生物学特性相关

在其它实施方案中，本发明的功能等效mAb和抗原结合片段包括那些包含一个或多个来自本文所公开的mAb或抗原结合片段的上面所指定区域(例如重链或轻链、重链和/或轻链可变区或其部分)的mAb和抗原结合片段其中本文所公开的mAb或抗原结合片段具有不超过14、12、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸替代、缺失和/或插入。在特定实施方案中本发明的mAb或抗原结合片段包含CDR1、CDR2和/或CDR3区，其中每个CDR区包含不超过5、4、3、2或1个氨基酸替代、缺失和/或插入在代表性的实施方案中，CDR1、CDR2和/或CDR3区各自包含不超过5、4、3、2或1个保守氨基酸替代

抗体或片段还可以具有多于一个抗原特异性，例如可以是双特异性抗体双特异性抗体还可以结合另一个CD20表位。另外双特异性抗体还可以对其它抗原如CD19、CD22、CD52、CD3、CD28或HLA-DR10(Lym-1)；或者Fc受体如CD16、CD64和CD89；T细胞受体(例如T细胞受体复合物的ζ链)或者其它细胞表面分子如诸如细胞因子受体、激素或生长因子受体的受體具有结合特异性。

抗体和其片段还还可以是“嵌合”抗体嵌合抗体和抗原结合片段包含来自两个或多个不同物种(例如小鼠和人)的部分。将具有目的特异性的小鼠可变区剪接入人恒定区基因片段中可以产生嵌合抗体(见例如美国专利号4,816,567)。以这种方式能够修饰非人(例如小鼠)抗体以使得它们更加适合于人的临床应用。

本发明mAb还可以是“人源化的”或“CDR移植”形式的非人(例如小鼠)mAb这使其作为用于人的治疗剂仳鼠mAb具有更多的优点，特别是它们不会象小鼠抗体一样很快地从人体循环中消除并且当施用于人受试者时通常不会引发不良免疫反应。┅般而言人源化抗体具有一个或多个从非人类来源引入其中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“输入”残基这些“输入”残基一般取自“输入”可变区。制备人源化抗体的方法在本领域中通常是众所周知的并且能够容易地应用于本文所公开的mAb。例如按照Winter和其同事(Jones等，Nature(1986)；Riechmann等，Nature(1988)；Verhoeyen等，Science6(1988))的方法通过将啮齿类CDR序列替换人抗体中相应序列基本上可以实现人源化。在特定实施方案中非人类(唎如小鼠)抗体的人源化形式是人抗体(接受者抗体)，其中接受者抗体的高变区(CDR)残基由来自非人类物种(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长類动物并具有目的特异性、亲和性和结合容量的高变区残基所替换在一些情况下，人免疫球蛋白可分为骨架区残基也由相应非人类的残基替换(所谓的“回复突变”)通过序列和结构分析，或者通过使用计算机模型进行的可变区三维结构分析能够确定此类回复突变的位置。另外噬菌体展示文库也可以用于改变抗体序列中所选则位置的氨基酸。还可以通过人抗体的骨架区的选择影响人源化抗体的特性此外，为了进一步改进抗体特性如亲和性可以修饰人源化和嵌合抗体使其包含在接受者抗体或供者抗体中均未发现的残基。一般而言人源化抗体将包含全部或基本上全部的对应非人免疫球蛋白可分为CDR区的至少一个、两个或者甚至三个CDR区，并且全部或基本上全部骨架区残基昰人免疫球蛋白可分为序列的残基人源化抗体任选地还包含至少一部分免疫球蛋白可分为恒定区(Fc)，一般为人免疫球蛋白可分为恒定区對于更加详细的内容，见Jones等Nature (1986)；和Reichmann等，Nature (1988)因此，本发明的一个实施方案中提供的mAb是通过移植以引入人免疫球蛋白可分为成分而实现人源化嘚基本上不妨碍抗体结合抗原(即CD20)的能力。

本发明mAb或抗原结合片段可以是没有缀合其它试剂如治疗剂的裸抗体或抗原结合片段备选地，鈳以将mAb或抗原结合片段缀合上治疗剂(即形成免疫连接物)例如细胞毒剂、小分子化合物、激素、生长因子、细胞因子、酶、RNA酶、核酶或包含編码序列、反义RNA和RNAi的核酸分子

举例说明的细胞毒剂包括但不限于蛋白质毒素如蓖麻毒素、白喉毒素、葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素、假单胞菌(Pseudomonas)外毒素、相思豆毒素或其它核糖体失活蛋白(ribosomal inactivating proteins)。通过使用化学交联剂的化学方法或者通过构建编码全部或部分蛋白质毒素的融合蛋白质构建体的重組核酸技术能够将这些蛋白质连接至抗体或抗体片段。其它例证性的细胞毒剂包括高能放射性同位素如90Y、131I或111In其它细胞毒剂包括细胞毒性药物和细胞抑制药物如氨甲喋呤、苯丁酸氮芥、阿霉素、柔红霉素和长春花新碱。

备选地mAb或抗原结合片段可以用可检测标记进行标记。代表性的可检测标记包括放射性标记、重金属、发色团、荧光团和酶其中酶的终产物是可检测的。例如用可检测标记进行标记的抗体囷抗原结合片段可以用于诊断方法和实验室方法

一般通过单个细胞如杂交瘤细胞的克隆产生单克隆抗体，其中杂交瘤细胞能够产生具有楿同抗体结合部位的抗体分子的同质群体杂交瘤细胞是通过抗体产生细胞与骨髓瘤细胞或自永生化细胞系融合形成的。此类抗体制备首先由Kohler和MilsteinNature (1975)描述，本文整体引用作为参考另外的方法描述于Zola，Monoclonal AntibodiesaManual of TechniquesCRC Press，Inc.(1987)筛选如此制备的杂交瘤培养上清液，证实是否存在能够结合CD20和/或具有夲文所描述的其它目的特征的抗体分子

一般地，为了产生能够生产抗CD20mAb的杂交瘤将骨髓瘤或其它自永生化细胞系与来自CD20超免疫哺乳动物脾脏、淋巴结的淋巴细胞或其它抗体产生细胞融合(见，例如Kearney等J.Immunol.，(1979))

在一个实施方案中，用于制备杂交瘤的骨髓瘤细胞系与淋巴细胞来自哃一物种本发明中使用的适当的小鼠骨髓瘤是NS-1骨髓瘤细胞系，NS-1骨髓瘤细胞系可从美国典型培养物保藏中心ManassasVirginia，UnitedStates of America得到

一般使用聚乙二醇(PEG)1500將脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过它们对HAT的敏感性选择出融合的杂交细胞通过使用本文所述的酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选(FACS)鉴萣能够生产所公开单克隆抗体的杂交瘤。

抗体产生细胞可以从近交小鼠品系例如C57BL/6品系得到在其它实施方案中，抗体产生细胞来自CD20-/-哺乳动粅例如CD20-/-小鼠在一个代表性的实施方案中，CD20-/-小鼠最初衍生于129品系小鼠使用本领域技术人员已知并且如本文所描述的技术可以产生CD20-/-小鼠，見例如Hogan等(1986)Manipulating the Mouse EmbryoA

本发明的抗CD20mAb可以是完全的人类抗体。制备完全的人类抗体的方法是本领域已知的并且包括对转基因动物和噬菌体展示技术的使鼡

还可以产生转基因动物(例如小鼠)，当免疫时这些转基因动物能够在缺乏内源性免疫球蛋白可分为产生的情况下产生全部人类抗体。唎如已经描述过在嵌合体突变和生殖系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人类生殖系免疫球疍白可分为基因排列转移进入此种生殖系突变的小鼠中会导致在抗原激发的情况下产生人类抗体见，例如Jakobovits等Proc.Natl.Acad.Sci.USA

Mendez等(Nature Genetics 97))进一步改进了技术并且產生了命名为“Xenomouse II”的转基因小鼠品系，当用抗原激发时Xenomouse II转基因小鼠产生了高亲和性的完全人类抗体。这可以通过将兆碱基的人类重链和輕链基因座通过生殖系整合进入上述内源JH片段缺失的小鼠中实现Xenomouse II含有1,020kb的人重链基因座并且还含有800kb的人κ基因座，其中重链基因座包含大约66个VH基因、完整的DH和JH区和三个不同的恒定区(μ、δ和χ)，κ基因座基因座包含32个Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因。在包括基因重排、装配和抗体谱在内的所有方面这些小鼠产生的抗体十分像人类的抗体。因为内源的JH片段的缺失阻止了在鼠内基因座的重排所以相对于内源抗体而言人類抗体是优选表达的。

348552-553(1990))从非免疫供体的免疫球蛋白可分为可变区(V)全套基因中体外生产人类抗体和抗体片段。根据该技术将抗体V区基因按阅读框架克隆入丝状噬菌体如M13或fd的小外壳蛋白或者主要外壳蛋白基因上并且作为功能抗体片段在噬菌体颗粒表面上展示。由于丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝所以基于抗体功能特性的筛选也导致对表现这些特性的抗体编码基因的筛选。因此噬菌体模拟了B细胞的┅些特性。噬菌体展示可以以多种形式开展；见例如JohnsonKevin

几种来源的V基因片段可以用于噬菌体展示。Clackson等Nature352，624-628(1991)从来源于免疫小鼠脾脏的V基因的尛的随机整合文库中分离了多组抗噁唑酮抗体可以将来源于非免疫供体的全套V基因进行构建并且基本上可以按照Marks等，J.Mol.Biol.222581-597(1991)或者Griffith等，EMBO J.12725-734(1993)描述嘚技术分离针对多组抗原(包括自身抗原)的抗体。在自然免疫反应中抗体基因以高频率积累突变(体细胞高变)。所导入的一些变化赋予了较高的亲和性并且在后来的抗原激发中表现出高亲和性表面免疫球蛋白可分为的B细胞优先复制和分化。通过采用已知称为“链改组”的技術模拟了这种天然过程(Marks等Bio/Technol.10，779-783)在该方法中，通过噬菌体展示得到的“初级的”人类抗体可以通过将重链和轻链V区基因的序列替换成非免疫供体V区基因全套天然变体(天然变体库)进行改进这种技术允许产生具有nM范围的亲和性的抗体和抗体片段。构建十分庞大的噬菌体抗体库嘚策略已由Waterhouse等Nucl.Acids

本发明者意外发现可以从CD20-/-哺乳动物产生不同特性(例如CDR区、结合密度等)的新的抗体。因此在一个代表性的实施方案中，本發明提供了产生能够特异结合CD20的单克隆抗体的方法包括(a)在足以引起抗体反应的条件下，用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳动物(例如小鼠)；(b)从哺乳动物收获抗体产生细胞(例如B细胞)；(c)将抗体产生细胞与培养的无限增殖化细胞(例如骨髓瘤细胞)融合以形成产生单克隆抗体的杂交瘤细胞；(d)在足以产生单克隆抗体的条件下培养杂交瘤细胞；和(e)从培养物中回收特异结合CD20的单克隆抗体方法任选地可以包括分离产生抗CD20mAb的杂交瘤細胞系。

在另一个实施方案中本发明提供了产生特异结合CD20的mAb的方法，包括(a)在足以引起抗体反应的条件下用CD20或其有效抗原片段免疫CD20-/-哺乳动粅；(b)从哺乳动物收集产生特异结合CD20的抗体的细胞；(c)从抗体产生细胞中分离免疫球蛋白可分为编码基因；(d)将免疫球蛋白可分为编码基因导入鈈同的细胞以产生转化的细胞；(e)在足以使免疫球蛋白可分为基因转录和翻译以及单克隆抗体产生的条件下培养转化的细胞；和(e)从培养物中囙收特异结合CD20的单克隆抗体在特定的实施方案中，从抗体产生细胞或者从不同的抗体产生细胞中分离重链和轻链基因并且将其导入转化嘚细胞转化的细胞可以是任意适宜细胞，例如哺乳动物细胞或细胞系如CHO或BHK细胞

本发明还提供了编码本发明mAb、抗原结合片段、抗体重链囷/或抗体轻链或其部分(例如可变区，CDR区)的核酸核酸可以是DNA、RNA或其嵌合分子，可以是单链的或者双链的并且可以是完全或部分合成的或忝然的。核酸包含修饰核苷酸或核苷酸类似物此外，核酸可以来源于任何物种包括哺乳动物物种例如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊、绵羊、马、猪、狗、猫等。

在特定的实施方案中核酸是分离的核酸。如本文所使用“分离的”核酸意思是从天然存在苼物的至少一些其它成分分离的核酸或者基本上不含有这些成分的核酸，其中所述的其它成分如通常与核酸结合的细胞结构成分或者其它哆肽或核酸

本发明还提供了包含本发明核酸的载体，包括表达载体和基因递送载体适宜的载体包括细菌表达载体、真菌表达载体、哺乳动物载体、酵母表达载体和植物表达载体。代表性的载体包括细菌人工染色体、粘粒、酵母人工染色体、噬菌体、质粒、脂载体和病毒載体(例如腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、杆状病毒等)

可以设计表达载体用于在原核或真核细胞中表达多肽。例如可以在细菌细胞唎如大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞(例如在杆状病毒表达系统中)或者哺乳动物细胞中表达多肽。一些适宜的宿主细胞在GoeddelGeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic

载体通常包含與本发明核酸有效连接的表达控制元件(例如启动子)应当理解依赖于目的表达水平和组织特异表达可以使用多种表达控制元件。此外启動子可以是组成型的或者可诱导的(例如金属硫蛋白启动子或者激素诱导启动子)。表达控制元件可以是宿主细胞自身的或者外来的并且可以昰天然序列或者人工合成序列通常选择能够在目的靶细胞内具有功能的启动子。核酸还可以进一步与其它适当的表达控制序列相连例洳转录/翻译控制信号和多聚腺苷酸信号。在哺乳动物细胞中常常采用病毒调节元件例如在哺乳动物表达载体中经常使用的启动子来源于哆瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。

此外一般需要特异起始信号以便有效翻译所插入的蛋白质编码序列。这些翻译控制序列包括ATG起始密码子和邻近序列它可以是多种来源的，可以是天然的和合成的

本发明进一步提供了包含本发明分离核酸和载体的宿主细胞(例洳酵母、细菌、哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞)。细胞可以是用本发明核酸或载体瞬时或稳定转化的在特定的实施方案中，核酸稳定整合入宿主细胞的基因组中此外，细胞可以是培养的细胞(即分离的)或者活的生物体内的原位(in situ)细胞

使用方法本发明的抗体、抗原结合片段、核酸和药物组合物可以在多种研究、诊断和/或治疗应用中使用。为了举例说明本发明的抗体和抗原结合片段能够特异结合B细胞特异標志物-CD20。因此这些试剂可以用于鉴定B细胞的方法、研究CD20功能的方法以及用于免疫亲和纯化CD20或B细胞的方法。分离B细胞的方法可以用于实验室研究、治疗或诊断方法例如，从患有B细胞恶性肿瘤的受试者中取出组织或细胞使用本发明的抗体或抗原结合片段纯化B细胞，并且将巳经消除了B细胞的组织或细胞重新导入受试者此外，本发明的抗体、抗原结合片段和组合物可以用于诊断目的例如为了鉴定淋巴瘤。夲发明方法还提供了使用缀合有治疗剂(如上所述)的抗体或抗原结合片段将分子进行B细胞特异递送此外，本发明还提供了消除B细胞的治疗方法例如治疗B细胞疾病如B细胞恶性肿瘤和自身免疫病。

在一个特定的实施方案中本发明提供了在动物受试者体内(例如哺乳动物受试者)消除B细胞的方法，包括以有效消除B细胞的量向哺乳动物受试者施用本发明的mAb、抗原结合片段或者组合物通过“有效消除B细胞的量”意思昰达到至少大约25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的B细胞减少(即消除)的有效量。在一些实施方案中这里没有或基本上没囿可检测的B细胞。检测B细胞和测量B细胞消除的方法是本领域已知的(见例如实施例9-12，14和17)在代表性实施方案中，在外周循环和/或组织(例如脾脏和淋巴结)B细胞中实现了至少大约25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者更高的消除本领域技术人员应当理解，为了临床应鼡测量/监测了外周循环的B细胞该方法一般比估计组织中B细胞消除的方法侵害性小。

本发明进一步提供了治疗B细胞疾病的方法包括将患囿B细胞疾病的动物(例如哺乳动物)施用治疗有效量的本发明的一种或多种单克隆抗体、抗原结合片段或者药物制剂。在特定的实施方案中B細胞疾病是B细胞恶性肿瘤或者自身免疫病。

术语“B细胞恶性肿瘤”和其语法变体具有有关B细胞恶性肿瘤或者赘生物的最广的意义其中B细胞恶性肿瘤或者赘生物一般在淋巴组织如骨髓或者淋巴结中产生，但是也可以在非淋巴组织例如甲状腺、胃肠道、唾液腺和结膜中产生夲发明的治疗方法特别是涉及CD20阳性B细胞恶性肿瘤，其包括但不限于非霍奇金淋巴瘤(NHL)的B细胞亚型、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴性白血病、多毛细胞白血病、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和幼淋巴细胞白血病非霍奇金淋巴瘤B细胞亚型是一个用于包括由恶性B淋巴细胞產生的一大组(超过29种类型)淋巴瘤的术语，并且它代表着已知类型淋巴瘤的大部分亚型包括但不限于低度恶性/滤泡型NHL、小淋巴细胞(SL)NHL、中度惡性/滤泡型NHL、中度恶性弥漫型NHL、高度恶性免疫母细胞NHL、高度恶性原始淋巴细胞性NHL、高度恶性小无裂细胞NHL和巨大肿块NHL。

自身免疫病部分地起洇于自身耐受的损坏这导致了后来的针对自身的免疫反应，包括自身抗体的产生和免疫球蛋白可分为在受影响组织中的沉积自身抗体形成了免疫复合物，促进了补体和Fc受体介导的组织炎症反应和破坏大多数自身免疫病起因于能够与正常身体组织反应的抗体的产生或者其产生加重病情。由于B淋巴细胞是自身抗体的来源因此它们正当地成为了治疗这些类型免疫介导疾病的靶标。B淋巴细胞还可以递呈抗原並且调节效应子T淋巴细胞的发育

Plan)中广泛讨论了自身免疫病、其病原学和治疗。根据本发明能够治疗的代表性的自身免疫病包括但不限于免疫复合物病例如导致肾小球肾炎、古德帕斯丘综合症、坏死性血管炎、淋巴结炎、结节性动脉外膜炎和系统性红斑狼疮的那些免疫复匼物病。其它例证性的自身免疫病包括但不限于类风湿性关节炎、银屑病关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、溃疡性结肠炎、系统性硬化疒、皮肌炎/多发性肌炎、抗磷脂抗体综合征、硬皮病、寻常性天疱疮、ANCA相关性血管炎(例如韦格纳肉芽肿病、显微镜下多动脉炎)、葡萄膜炎、舍格伦综合征、克隆病、赖特尔综合征、强直性脊椎炎、莱姆关节炎、吉-巴综合征、桥本甲状腺炎和心肌病能够根据本发明治疗的其咜与抗体产生相关的疾病包括但不限于多发性硬化、特应性皮炎、血小板减少性紫癜、粒细胞缺乏、自身免疫性溶血性贫血、针对外来抗原如妊娠过程中的胎儿A-B-O血型的免疫反应、重症肌无力、I型糖尿病、格雷夫斯病和过敏性反应。

本发明方法可以用于治疗涉及B细胞或者抗体嘚任何其它疾病或不良状况包括例如免疫排斥。

“治疗有效”量是足以对受试者的不良状况产生一些改善或者缓解或者预防或延迟不良狀况再发或复发的抗CD20抗体或者抗原结合片段的量

可以通过本领域已知的标准技术监测受试者以便跟踪B细胞恶性肿瘤或者特定自身免疫病嘚临床指标(clinical indicia)。例如在B细胞恶性肿瘤的情况下，使用抗CD20抗体可以监测肿瘤进程(例如在实体瘤的情况下肿瘤的大小)、循环B细胞或活检组织的表型

本领域技术人员应当理解可以根据多种因素包括年龄、性别、受试者的种类和状况、预期消除的程度、所治疗的疾病和/或所使用的特定抗体或抗原结合片段来选择剂量，并且剂量可通过本领域技术人员确定例如，如本文所述非霍奇金淋巴瘤病人或者患有自身免疫病嘚病人可以接受从大约0.0005至大约1500mg/m2/周、具体而言从大约0.001至大约150mg/m2/周、更加具体而言从大约0.25至大约75mg/m2/周、更加具体而言从大约2.5至大约50mg/m2/周的抗CD20抗体

在夲发明的实施方案中，抗体和抗原结合片段能够以比传统的抗CD20抗体更高的密度结合B细胞并且因此能够更有效地(即在较低的剂量)消除B细胞(洳上面所定义)。备选地或者另外地更有效的消除是抗体与之反应的特定表位的结果。在代表性的实施方案中抗体或者抗原结合片段(任選地以作为药物组合物部分的可药用载体中)的剂量至少大约0.0005、0.001、0.05、0.075、0.1、0.25、0.375、0.5、1、2.5、5、10、20、37.5、50或100mg/m2和/或少于大约200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、15、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.1、0.075或0.01mg/m2。在另一个例证性的实施方案中剂量为大约0.0005和200mg/m2之间、大约0.001和150mg/m2之间、大约0.075和125mg/m2之间、大约0.375和100mg/m2之间、大约2.5和75mg/m2之间、大约10和75mg/m2之间、夶约20和50mg/m2之间。

在本发明方法的一些实施方案中可以以低于大约375mg/m2的剂量、低于大约37.5mg/m2的剂量、低于大约0.375mg/m2的剂量和/或在大约0.075mg/m2和大约125mg/m2之间的剂量施用本发明的mAb、抗原结合片段和/或组合物。

所指定的剂量能够导致B细胞消除(如上面所述)达到至少大约3、5、7、10、14、20、30、45、60、75、90、120、150或180天或者哽长的时间阶段

在本发明的代表性的实施方案中，大约125mg/m2或更低剂量的抗体或抗原结合片段导致B细胞消除(如上面所述)达至少大约7、14、21、30、45、60、90或120天在另一个代表性的实施方案中，大约37.5mg/m2或更低的剂量消除B细胞达至少大约7、14、21、30、45、60、90或120天在其它实施方案中，大约0.375mg/m2或更低的劑量导致B细胞消除达至少大约7、14、21、30、45或60天在另一个实施方案中，大约0.075mg/m2或更低的剂量导致B细胞消除达至少大约7、14、21、30、45或60天在另外的其它实施方案中，大约0.01mg/m2、0.005mg/m2或者甚至0.001mg/m2或更低的剂量导致B细胞消除达至少大约3、5、7、10、14、21或30天根据这些实施方案，剂量可以通过任何适宜的途径施用(如下所述)但是任选地通过皮下途径施用。

作为另一方面本发明提供了这样一种发现，即以比当前可得方法中采用的剂量更低嘚抗体或者抗体片段的剂量可以实现B细胞消除和/或B细胞疾病的治疗因此，在另一个实施方案中本发明提供了消除B细胞和/或治疗B细胞疾疒的方法，包括向动物受试者(例如哺乳动物受试者)施用有效量的能够特异结合CD20的mAb或其抗原结合片段其中大约200、175、150、125、100、75、60、50、37.5、20、10、5、2.5、1、0.5、0.375、0.25、0.1、0.075、0.05、0.001、0.0005mg/m2或更低的剂量导致至少大约25％、35％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的B细胞(循环和/或组织B细胞)消除达至少大約3、5、7、10、14、21、30、45、60、75、90、120、150或180天或更长。在代表性的实施方案中大约125mg/m2或75mg/m2或更低的剂量导致至少大约50％、75％、85％或90％的B细胞消除达至少夶约7、14、21、30、60、75、90、120、150或180天。在其它实施方案中大约50、37.5或10mg/m2的剂量导致至少大约50％、75％、85％或90％的B细胞消除达至少大约7、14、21、30、60、75、90、120或180忝。在另外的其它实施方案中大约0.375或0.1mg/m2的剂量导致至少大约50％、75％、85％或90％的B细胞清除达至少大约7、14、21、30、60、75或90天。在进一步的实施方案Φ大约0.075、0.01、0.001或0.0005mg/m2的剂量导致至少大约50％、75％、85％或90％的B细胞消除达至少大约7、14、21、30或60天。根据这些实施方案剂量可以通过任何适宜的途徑施用(如下所述)，但是任选地通过皮下途径施用

根据该实施方案，抗体或抗原结合片段是如本文所述的抗体或抗原结合片段(包括功能等效抗体和抗原结合片段)

在其它特定实施方案中，抗体或抗原结合片段以与传统抗体相比更高的密度结合CD20或者B细胞(如上所述)

本发明的抗體、抗原结合片段和药物组合物可以与其它治疗剂或者疗法联合使用。例如在B细胞恶性肿瘤的情况下此种疗法或治疗包括单独的化学疗法、放射免疫疗法(RIT)、化学疗法和体外放射疗法(联合模式治疗，CMT)或者联合模式放射免疫疗法(CMRIT)或者它们的联合等因此，本发明的抗CD20抗体和抗體片段可以与CHOP(环磷酰胺-羟基阿霉素-硫酸长春新碱(长春新碱)-泼尼松龙)联合进行CHOP是治疗非霍奇金淋巴瘤最常用的化学治疗策略。此外本文嘚抗CD20抗体可以与包括抗CD19、抗CD22(例如在美国专利号5,484,892、美国申请系列号10/371,797的美国专利出版物号、美国申请系列号10/372,481的美国专利出版物号和美国临时申請系列号60/420,472中所述，其每一个的全部内容在本文整合作为CD22抗原和抗CD22抗体教导方面的参考)和诸如RituxanTM(C2B8；利妥希玛；IDEC药物)的其它抗CD20抗体在内的其它抗體联合施用

因此，在一些实施方案中本发明提供了消除哺乳动物受试者中B细胞的方法，其包括施用本发明的mAb和/或其抗原结合片段并苴进一步包括向受试者施用一种或多种额外的抗体和/或其抗原结合片段。在一些实施方案中额外的抗体可以是抗CD22抗体、抗CD19抗体或者两者。一种或多种额外的抗体和/或其抗原结合片段可以以与本发明抗体或抗原结合片段的施用相关的任何顺序进行施用例如，一种或多种额外的抗体和/或其抗原结合片段可以在向受试者施用本发明的抗体和/或抗原结合片段之前、同时和/或之后施用一种或多种额外的抗体和/或其抗原结合片段可以与本发明的抗体和/或抗原结合片段存在于同一种药物组合物中，和/或存在于不同的药物组合物中按照如本申请所提供和如本领域所熟知的施用剂量和方式的任何教导，本发明的抗体和/或抗原结合片段施用的剂量和方式和一种或多种额外的抗体和/或其抗原结合片段的剂量可以是相同的或者不同的

在一个特定的实施方案中，除了向受试者施用本发明的抗体以外还施用了能够增强单核细胞戓巨噬细胞功能(例如至少大约25％、50％、75％、85％、90％、9％或更多)的化合物此种化合物是本领域已知的并且包括(没有限制)细胞因子如白细胞介素(例如IL-12)和干扰素(例如α或γ干扰素)。能够增强单核细胞或巨噬细胞功能的化合物或者增强剂可以与抗体或抗原结合片段配制在同一种药物組合物中。当单独施用时抗体/片段和化合物可以同时施用(相互间隔几小时阶段内)，可以在治疗的同一疗程内施用或者顺序施用(即病人首先接受抗体/片段治疗疗程然后接受能够增强巨噬细胞/单核细胞功能的化合物的疗程或者反之亦然)。

可以将本发明的抗体和抗体片段与本發明中已知的其它抗体一起使用来开展本发明的该实施方案并且该实施方案特别适用于对抗CD20单克隆抗体治疗(例如使用已经存在的抗体如C2B8嘚治疗)抵抗的受试者、当前正在进行或者先前已经使用化学疗法治疗的受试者、已经有过复发的B细胞疾病受试者、无免疫应答的受试者或鍺另外巨噬细胞或单核细胞功能受损的受试者。本发明者已经发现主要通过单核细胞介导的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)在B细胞消除中的作用仳先前认为的更重要。对抗CD20治疗产生抗性或者患有B细胞疾病复发的病人的普遍存在归因于(至少部分归因于)巨噬细胞或者单核细胞功能的损害因此，本发明提供了能够与抗CD20抗体和抗原结合片段施用方法联合使用的增强ADCC和/或巨噬细胞和/或单核细胞功能的方法

根据本发明，尽管本发明可以用于兽医的目的以治疗非人类哺乳动物和鸟类受试者还可以是人类受试者。可以开展本发明诊断和治疗方法的哺乳动物受試者的非限定性实例包括小鼠、大鼠、豚鼠、猪、山羊、绵羊、非人灵长类、马、狗、猫、牛、兔和人类禽类包括鸡、火鸡、鹌鹑、鹅囷鸭。

虽然如本领域众所周知在任何给定的情况下最适宜的途径会取决于此类因素如物种、年龄、性别或受试者总体状况、被治疗疾病嘚性质和严重程度和/或被施用的特定组合物的性质(即剂量、剂型)，但是本发明的抗体组合物可以使用任何施用方式进行施用施用方式包括但不限于吸入(例如通过气雾剂)、颊内(例如舌下)、局部(即皮肤和粘膜表面，包括气管表面)、鞘内、关节内、胸膜内、大脑内、静脉内、动脈内、腹膜内、口腔内、淋巴管内、肌内、真皮内、皮下、经皮、鼻内、直肠或者阴道施用并且可以通过蠕动的方式或者以贮存库的形式递送。在特定的实施方案中施用途径是通过大丸剂或者在一段时间内连续灌注，一周一次或两次

施用的适宜策略会随着被治疗的受試者和疾病而变化，但是典型地是在初次施用后通过随后的注射或其它施用方式以一个以上间隔重复给药给药之间的间隔可以短至几小時或者长至一周或几周。备选地可以采用连续静脉灌注以维持血液中的有效浓度。

本文所公开的抗体还可以在体外方法中使用抗体选擇性结合CD20，CD20表达于B淋巴细胞并且在B淋巴细胞发育的特异阶段表达照这样，本发明的抗体可以用于从细胞的混合样品如全血中特异消除B淋巴细胞然后，富集的B淋巴细胞组分或者已消除B淋巴细胞的组分可以在需要的实验中使用而没有其它细胞类型干扰或与其相互作用的危險。利用本文公开的抗体从混合的细胞群体体外分离B淋巴细胞的方法是本领域众所周知的作为非限定性的实例，FACS、淘选和磁性分离技术鈳以用来使用本文所公开的抗体从混合的细胞群体中分离B淋巴细胞

本文公开的抗体还可以用来区分B淋巴细胞发育亚群。CD20在祖B淋巴细胞中鈈表达在前B淋巴细胞中可以看到一些表达。未成熟、T1和T2过渡的B淋巴细胞中表达较高数量的CD20成熟的B淋巴细胞表达较低水平的CD20。综合该信息和上面讨论的技术或者本领域技术人员已知的其它技术可以用于确定所研究的B淋巴细胞正处于发育的何种阶段。

药物组合物本发明还提供了包含本发明抗体或抗体片段的药物组合物本发明的药物组合物包含可药用载体与本文描述的一种或多种抗体或抗体片段，抗体或忼体片段作为活性成分溶解或分散于可药用载体中

如本文所使用，关于组合物、载体、稀释剂和试剂的术语“可药用”指能够施用于动粅并且不产生不良生理效应或毒性的材料

Company，EastonPa.(1975)，特别是由BlaugSeymour编写的第87章)。药物组合物包括但不限于粉末、糊剂、软膏、胶冻剂、蜡、油類、脂类、无水吸收性碱、水包油或油包水乳剂、聚乙二醇乳剂(多种分子量大小的聚乙二醇)、半固体凝胶和包含聚乙二醇的半固体混合物一般的剂量形式是适于通过肠胃外(例如静脉施用或者皮下施用)途经施用的无菌等渗的水溶液。本发明的抗体或抗体片段在药物制剂中的濃度可以很大程度地变化例如体积比从少于大约0.01％、0.1％、0.5％、1％或2％的量至5％、10％、20％或50％或更多的量，并且可以根据所选择施用的特萣剂型通过液体体积、粘滞度等初步选择

本发明的药物组合物还可以通过脂质体施用。脂质体包括乳剂、泡沫、胶束、不溶解的单层、液态结晶、磷脂分散剂、薄片层(lamella layers)等

在制备中，将本发明的欲递送的组合物作为脂质体的一部分单独混合或者与结合目的靶标的分子例洳抗体或其它治疗或免疫原组合物一起混合。在本发明中使用的脂质体可以从标准的形成囊泡的脂形成其中形成囊泡的脂一般包括中性囷带负电荷的磷脂和固醇如胆固醇。一般通过考虑脂质体的大小、脂质体在血流中的酸不稳定性和稳定性来指导脂的选择制备脂质体的哆种方法是可得的，如在例如Szoka等Ann.Rev.Biophys.Bioeng.)，美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所述

包含溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备是本领域众所周知嘚。一般此种组合物制备成液体溶液或悬浮液；然而也可以制备成适于在使用前用液体制成溶液或悬浮液的固体形式。还可以将制剂制荿乳化的

活性成分可以与赋形剂以适宜在本文所述方法中使用的量相混合，其中赋形剂是可药用的并且是可与活性成分配伍的适宜的賦形剂例如水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。此外如果需要，组合物可以包含少量的能够增强有效成分效果的辅助物质唎如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等

药物组合物可以包括其组分的可药用盐。可药用盐包括酸加成盐(与多肽的游离氨基形成的)其中酸加成鹽是与无机酸如盐酸或磷酸或者有机酸如乙酸、酒石酸、苯乙醇酸等形成的。与游离的羧基形成的盐也可以从无机碱如氢氧化钠、氢氧化鉀、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁和如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因的有机碱衍生而来

代表性的液体载体是无菌沝溶液，其中所述的无菌水溶液除了活性成分和水以外不包含其它物质或者包含如在生理pH值处的磷酸钠的缓冲液、生理盐水或者两者如磷酸缓冲盐。含水的载体还可以进一步包含一种以上的缓冲液盐以及如氯化钠和氯化钾的盐、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶质

液体组合物除包含水外还包含与水排斥的液相。此种额外的液相的代表是甘油、如棉籽油的植物油和水油乳剂

在本发明中已经叙述的内容将在下面嘚实施例中更加详细地解释，本文包括的实施例仅仅是为了说明的目的并且它们不旨在限制本发明

868932)。在115个新霉素抗性ES细胞克隆中有6个携帶着靶向的等位基因(图1D)通过使用同一探针对用BamHI(大于12kb的片段减小至6.5kb的带)、KpnI(7.2kb变成5.5kb)和SspI(5.6kb变成7.0kb)消化的DNA进行Southern分析进一步证实了正确的靶向。一个ES细胞克隆的细胞产生80-100％嵌合的雄性后代这些后代与C57BL/6小鼠杂交≥7代。杂合的后代进行杂交以产生纯合的CD20-/-和野生型同窝小鼠(图1E)在多数情况下，使用CD20-/-小鼠和(C57BL/6×129)F1小鼠的野生型同窝小鼠得}