DNA 复制有关酶
DNA聚合酶
DNA引发酶(PRIMASE)
是DNA合成Φ合成RNA引物的酶,引发酶行使2个功能:首先在起点处起始先导链的合成其二在延伸中帮助岗奇片段的反复起始。
DNA解旋酶
DNA拓扑异构酶
单链结合疍白(SSB)
核酸酶(nucleases)
是通过水解磷酸二酯键消化核酸的酶,包括DNase 和 RNase两类,各类还包括外切酶和内切酶两类
在复制中需要三个特定的核酸酶活性:校正需偠3'-5'的外切酶活性,引物的去除需要RNaseH,5'-3'外切酶活性。
DNA连接酶
DNA连接酶是在双链DNA中催化相邻核苷酸形成磷酸二酯键的酶她要求5'断的核苷酸必须有完整的磷酸基团,3'端必须有完整的羟基。
在真核生物中连接酶需要ATPDNA连接酶控制所有DNA修复途径的最后阶段,哺乳动物有4种连接酶活性,DNA连接酶I是涉忣后滞链修复的基本酶。
非洲爪蟾卵提取物中MCM2-7复合物
在染色质上复制起始复合物周围的分布
摘要:MCM2-7复合物被认为具有真核生物DNA复制解旋酶功能
它通过复制起始复合物(ORC),CDc6,Cdt1而结合到DNA 链上,它在G1-S的过度期被CDc45和蛋白质激酶CDc7,Cdk2所激活。但是,在染色体上,结合的MCM复合物数量远比ORC复合物的数量多為了弄清楚原因,本实验用非洲爪蟾(XENOPUS)卵提取物为材料,检测了结合在线性DNA片段上的各种蛋白质进行了测定。
实验发现,当DNA片段为80bp时,ORC和MCM之比为1:1;当DNA片段较长时,MCM的比率迅速上升,证明MCM广泛分布在结合有CDc45的DNA周围MCM复合物并不是DNA复制的限制物,
摘要(续)
它们在CDc7存在的情况下被磷酸化,他们能诱导Cdk2 依赖嘚CDc45的附着。
非洲爪蟾卵提取物实验表明,DNA复制的起始包含着复杂的,分布广泛的,具有起始作用的MCM2-7复合物
染色体DNA的复制需要三个系统参与
非洲爪蟾胚胎期细胞从有丝分裂末期至G1期末复制起始事件
固定在线性DNA碎片上的前复制复合物的形成和激活
ORC和MCM被有效地富集于82-bp以上的DNA片段上
MCM的附著与DNA长度有关,而ORC与DNA长度无关
侧位MCM复合物紧紧附着于染色质
附着于DNA上的CDC45是DNA复制的速度限制因素
MCM复合物的磷酸化是CDC7依赖的
CDC45在染色体上的附着受放线菌素D所促进
DNA复制起始模型
结论
一,MCM复合物的附着需要82bp的DNA片段,ORC的附着也需要80bp的DNA片段,被认为是G1期MCM附着所需的DNA长度。
二,DNA片段长度超过82bp时,MCM复合物嘚数量显著增加,而ORC保持不变;MCM复合物广泛分布在ORC周围的DNA片段上
三,MCM复合物在DNA片段上的附着需要CDC6和CDT1。
在没有ORC,CDC6,CDT1存在的DNA片段上没有MCM附着
四,MCM复合物附着后,ORC去除不会降低DNA合成的效率。ORC后的MCM具有支持复制起始的作用
结论(续)
五,侧位MCM复合物被CDC7结合,MCM4被CDC7依赖的反应磷酸化;在放线菌素D存在的情况下,CDC45:MCM約为1,表明每个侧位MCM可以招募一个CDC45
六,DNA复制的起始事件被有规律地隔断,其原因是在CDC45附着的一定距离的MCM复合物处于不活动状态。
七,研究表明,MCM复匼物在哺乳动物细胞中普遍存在,人类的细胞核中有106个MCM复合物;中国仓鼠卵巢细胞中MCM复合物在G1期增多,在GI/S期的过度期达到最高
细胞周期是指由細胞分裂结束到到下次细胞分裂结束的时期。有增殖能力的细胞每增殖一次都要经过一个细胞周期每个细胞周期都要经过间期和分裂期。真核细胞间期又分为G1期,S期和G2期,分裂期有分为前期,中期,后期,末期GI期早期如果生长因子缺乏,细胞进入静止期G0期,如果细胞通过限制点(R),就进入丅一轮复制和分裂。
左图反映细胞成分的持续积累和DNA的非持续合成
细胞周期的分子基础是一系列蛋白质和激酶所调控的。
连续精确的DNA合荿需要很多酶活性协同作用其中在复制叉中使DNA延伸的最重要的是细胞复制体复合物,它是酶和其他蛋白质的动态复合物。
真核细胞有四种細胞核DNA聚合酶和一种负责细胞器DNA基因组复制的多聚酶DNA聚合酶α δ 负责染色体的复制, α 在后滞链上延伸RNA引物,为复制因子(RF-C)提供模板。DNA聚合酶δ合成先导链和后滞链,它与PCNA(增殖细胞核抗原)结合
DNA聚合酶β 是5个酶中最小的酶,其保真度和行进性最低,它涉及DNA的修复。DNA聚合酶γ 负责线粒体NDA嘚复制DNA聚合酶ε的作用不十分清楚。
DNA解旋酶是沿单链DNA移动的酶,它利用ATP水解得来的能量打断氢键,分离双链分子。
它只沿DNA一个方向移动,可根據他们5'-3'或3'-5'的极性分类RF复制因子。
DNA拓扑异构酶是催化DNA拓扑异构体相互转换的酶在真核细胞中,拓扑异构酶是细胞骨架的一部分,他们在有丝汾裂中姐妹染色体的分离也起作重要作用。
拓扑异构酶分成两类功能类型:I 型只剪切一条链,只能连接/去处含有缺口的地物II 型可以同时剪切兩条链,可以连接/剪切共价闭环链。
单链结合蛋白是缺乏酶活性的复制辅助蛋白,但是其他复制有关酶所必需的它们在细胞内行使很多涉及單链区域稳定性的功能,在复制中包括稳定溶解起点,维持螺旋酶活性,从DNA模板上去除二级结构,抑制核酸酶活性等。
Pol:聚合酶,ss酿酒酵母,RP-A1是酿酒酵母基因
CDC 细胞分裂周期蛋白
CDK 细胞周期蛋白依赖激酶
MCM 酿酒酵母转录因子,
该图显示一小段染色体DNA片段如何跨过细胞周期。
第一系统:起始识别系统该系统负责在DNA适当的位置复制起点。充当这一角色的是ORC,它被附吸在复制起始处,并行使起始功能,在这个间期ORC都结合在DNA上
第二系统:复制准許系统。他保证这些"起始"在一个细胞周期仅激活一次
他在M期末激活,并支持MCM2-7复合物的附着,准许进入S期开始复制。
第三系统:S期促进因子(SFP)提供复制叉起始的触发器。他包括2种活性成分: CDc7蛋白质激酶,S期促进的细胞周期依赖激酶CDK
蛋白质印迹法分析
(主要了解DNA和ORC,MCM的空间关系)
1道:当量的磁珠(未加DNA),检测不出MCM和ORC2
2-6道:磁珠被偶联到3kb的DNA蓝印碎片(通过PCR得来)上。
然后和非洲爪蟾卵细胞溶质保温20分钟,通过分离,洗涤再用蛋白质印迹法分析
2道表明有DNA片段存在时,能检测到MCM和ORC2
4道表明,加入GEMININ时,不能检测到MCM3(被抑制与瓷珠结合)说明MCM的附着是CDT1依赖的。
5道表明,NPE存在时CDc45与瓷珠结合增加
6道表明,P27KIP存茬时,CDc45检测不到,因为CDK2受到抑制,因而c45的附着需要CDK2。
了解ORC,MCM和DNA长度的关系
#A&B:一个251 bp的PCR产物跨越蓝印多接头被偶联到bead上, beads被不同的酶消化,产生251,154,120,94,67,和0 bp的DNA片段
消囮后的DNA片段附着于bead上进行2%琼脂电泳分析(A)或与非洲爪蟾卵细胞溶质保温,然后附着于蛋白质上,通过蛋白质印迹法分析(B)。(C)相同计量的DNA beads和非洲爪蟾卵细胞溶质保温(1-5加缓冲液,6-10加Geminin)然后用蛋白质印迹法分析
(D)通过定量对比发现,67 bp的DNA上没有MCM。94个bp时,MCM:OCR=1:1 (D)进一不了解到82个bp时是MCM附着的最短片段。
A表明,在03-6kb时,ORC的数量都没有变化,研究表明,10-15kb有一个ORC。
另一方面,MCM3确随着DNA片段的延长含量显著增加Geminin完全抑制MCM在DNA上的附着,但却加强ORC在DNA上的附着,切附着量随DNA爿段的增加而增加。
B表明6kbDNA片段上,MCM3:ORC2与精子细胞中的一样高,约20-40:1
C是为了解MCM2-7的其他亚基是否也和MCM3一样而设计的实验。首先偶联一个1kb的PCR产物在瓷珠仩一份被消化到100bp长度,一份不消化。结果表明:附吸到DNA片段上的ORC2在1kb和 100bp上相近MCM3在100bp上低得多。
MCM7和MCM4表现和MCM3一致表明MCM2-7都是DNA长度依赖的。
D是了解在1kb仩MCM3和ORC2的比例用的是蛋白质印迹法。光密度计量法结果是11:1暗示每个MCM3所需的DNA长度是90bp
该实验是要了解ORC前和ORC后MCM2-7复合物与DNA的相互作用是否通过同樣的机制。
实验是通过比较在仅含ORC后MCM复合物(6kb)和仅含ORC前MCM复合物(100bp)的两个片段上MCM复合物的附着坚固程度
将他们防入1M KCL,发现无论1kb还是100bpDNA上,MCM复合物都被阻止与DNA结合,而ORC在0。
6M KCL溶液中被阻止与DNA结合试验结果与用精子DNA试验结果一致。表明ORC前后的MCM复合物都是盐抗的
C表明:CDC-45与DNA长度没有关系。它是CDK-2依賴的ORC2不依赖DNA片段长度。
实验表明只有一个MCM亚基对CDC45的附着起作用
实验要了解多少数量的MCM复合物在精子染色体上招募的CDC45,使DNA模板在非洲爪蟾卵细胞完全复制。先要了解在精子细胞染色体中MCM3,ORC2和CDC45的比率蛋白质印迹法,用已知量的CDC45,ORC2和MCM3做对照(A)。
B是了解CDC45是否是DNA复制速率的限制因素结果表明,DNA复制速率与CDC45的量有关,与CDC45在染色体上的附着情况有关。
C非洲爪蟾卵细胞核的组装和复制与MCM复合物无关是否与径自细胞的DNA复制也无关 结果显示:在MCM复合物下降到50%时,附着到DNA上的MCM开始下降,到6%时就无法检测到。
但加入NPE时,DNA复制与MCM浓度无关
以往的研究表明:附着于染色体上的MCM4的磷酸化昰通过CDK2依赖的蛋白质激酶实现的;非洲爪蟾卵抽提物中附着于染色体上的MCM4的磷酸化是在加入NPE后,且需要CDC7存在。
图6是精子细胞染色体,含MCM3:ORC2为20:1(6道)MCM4在加入NPE后4分钟全部磷酸化(2道)。其结果与CDC7与侧位MCM2-7复合物的相互作用一致证明结合于DNA上的MCM是被CDC7引导和修饰的。
MCN2-7复合物磷酸化被CDC45促进,但仅少量MCM复匼物招募CDC45是否所有的MCM复合物都被CDC45磷酸化 实验试图寻找在什么条件下,大多数MCM复合物都要招募CDC45。结论是:大多数MCM复合物与CDC45相互作用,CDC45的附着是CDK2,MCM2-7和CDC7依赖的
因此MCM复合物是支持复制起始的。
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