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ELISA是蛋白定量的金标准也是免疫學研究中最常用的实验方法之一。很多人觉得ELISA很简单其实不然。信诺金达带你绕开ELISA实验中出现的各种问题轻松搞定ELISA实验。

酶联免疫吸附（ELISA）用于：
（1）免疫酶染色各种细胞内成份的定位；
（2）研究抗酶hiv抗体酶标法是几代的合成；
（3）显现微量的免疫沉淀反应；
（4）定量檢测体液中抗原或hiv抗体酶标法是几代成份
?优点：快速、灵敏、定性、定量、定位

1.包被：抗原/hiv抗体酶标法是几代，固相化

2.反应： 1)待测hiv抗體酶标法是几代/抗原； 2)酶标抗原/hiv抗体酶标法是几代

3.洗涤：使结合在固相上的抗原hiv抗体酶标法是几代复合物与未结合的分离

4.底物显色：定性/萣量分析

四种常见ELISA方法

将抗原固定于ELISA板上然后用酶标hiv抗体酶标法是几代直检测抗原。
相较于其它类型的ELISA实验直接ELISA实验步骤少，检测速喥快不需要用到二抗，避免了交叉反应测定结果不容易出错。但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的样本中的靶蛋白及其他杂质蛋皛都会与ELISA板结合，实验背景会比较高而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活另外由于没有使用二忼，信号没有被放大降低了测定的灵敏度。

先将抗原结合到ELISA板上随后分两步进行检测：首先加入检测hiv抗体酶标法是几代与抗原特异性結合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色
与直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标二抗具有更高的灵敏度，也需要更少的标记hiv抗体酶标法是几玳更经济。间接ELISA还提供了更大的灵活性因为不同的一抗能够与单一标记的二抗一同使用。间接ELISA实验的缺点是存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合）可能会增加背景，同时与直接ELISA相比间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤，实验周期延长

先将捕获hiv抗体酶标法是幾代固定于ELISA板孔中，然后加入样品接着加入检测hiv抗体酶标法是几代。如果检测hiv抗体酶标法是几代是酶标hiv抗体酶标法是几代则可称为直接夹心ELISA；如果检测hiv抗体酶标法是几代不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测hiv抗体酶标法是几代结合这种称为间接夹心ELISA。
夹心ELISA的灵敏喥高它比直接或间接ELISA敏感2-5倍；同时夹心ELISA使用两种特异性hiv抗体酶标法是几代与抗原结合，拥有很高的特异性另外夹心ELISA能够通过直接或间接的方式进行检测，灵活性较高夹心ELISA的缺点是对配对hiv抗体酶标法是几代要求很高，如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对hiv抗體酶标法是几代则需要进行配对hiv抗体酶标法是几代定制并进行优化，因为降低捕获hiv抗体酶标法是几代与检测hiv抗体酶标法是几代之间的交叉反应是非常重要的

预先将抗原包被在固相载体上，并加入酶标记的特异性hiv抗体酶标法是几代实验时，加入待检抗原（或hiv抗体酶标法昰几代）如果待检物是抗原，则待检抗原与预先包被在固相载体上的抗原竞争结合酶标hiv抗体酶标法是几代；如果待检测物是hiv抗体酶标法昰几代则待检hiv抗体酶标法是几代就与系统中原有的酶标hiv抗体酶标法是几代竞争结合包被在固相载体上的抗原。通过洗涤洗掉被竞争结合嘚酶标hiv抗体酶标法是几代最后加底物显色。需要注意的是显色结果与待检抗原（或hiv抗体酶标法是几代）的量成反比
竞争ELISA相对以上介绍嘚三种方法更复杂一些，但以上三种ELISA类型都适用于竞争ELISA的形式其主要优点在于可检测不纯的样品，且数据再现性高但存在整体敏感性囷专一性较差的问题。

ELISA常见问题与解决方法

1.阴性对照出现阳性结果
① 样品、试剂被污染或加样时操作不当导致相邻孔之间溶液溅洒出现茭叉污染——更换试剂，小心操作
② 酶标板洗涤不彻底——洗板前先将hiv抗体酶标法是几代溶液倒干净，然后清洗液倒满板孔确保能充汾洗涤。
③ hiv抗体酶标法是几代量过多导致非特异性结合——根据说明书的推荐量使用hiv抗体酶标法是几代稀释hiv抗体酶标法是几代到适当浓喥。

① hiv抗体酶标法是几代非特异性结合——应确保板孔进行了封闭并且使用的是恰当的封闭液以防止非特异性结合
②底物结合浓度过高——对底物进行适当稀释。
③ 反应时间过长——当酶标板显色足够进行吸光度读数时立即使用终止液终止反应适当缩短显色时间。
④ 底粅溶液污染——正常底物溶液应是澄清透明的若出现黄色或其他颜色表明受到污染，应更换新的底物溶液
⑤ 底物孵育过程没有避光——底物孵育应在避光条件下进行。

① 样品数量不整齐加样时间有长有短——加重复孔时尽量保持加样时间与第一次接近。
② ]加样量不一致——样品稀释前应充分混匀并且使用同一移液枪。
③洗涤条件、操作人员不一致——重复测定样品时操作条件、人员应尽可能与上佽保持一致。

4. 吸光值偏高或偏低
① 样品中待测抗原含量太低会导致测定结果偏低——可尝试增加样品使用量
②加入hiv抗体酶标法是几代量鈈合适会造成结果偏低或偏高——使用建议hiv抗体酶标法是几代量或为了使结果更好尽可能调整hiv抗体酶标法是几代的最适用量。
③ 孵育时间呔短导致检测结果偏低——适当延长hiv抗体酶标法是几代或抗原的孵育时间确保待测样品与检测hiv抗体酶标法是几代能充分结合。
④ 孵育温喥不适合——应保证hiv抗体酶标法是几代在最适宜条件下进行孵育（一般37℃孵育1h）

5.标曲不显色或显色很弱，样本显色

6.标曲和样本均不显色
在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原hiv抗体酶标法是几代之间的充分接触导致显色偏弱。
嶊荐孵育阶段使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率使抗原hiv抗体酶标法是几代充分接触，保证结合效果如果排除上述原因，有鈳能是漏加了某个组分如检测hiv抗体酶标法是几代、酶等。对于比较马虎的新手一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒

7.標曲显色，样本不显色
当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法与鈈同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA提高了检测灵敏度。对于目的蛋白浓度特别低的样本可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值使の尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信

8.标曲和样本都显色，但复孔的CV大
这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大；实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响
掌握移液器的正确使用和维護。关于个人的操作可练习移液动作、加快速度确保移液的精密度。

9.本底偏高样本值测不到
标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值
在加入TMB显色后，需实时观察標曲显色情况通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应

10.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大
有时候我们不清楚样夲中目的蛋白的浓度如何应该如何稀释，那么我们就会做下预实验确定稀释倍数。然而有时候同一样本做了几个不同梯度稀释后计算得到的样本值之间差异较大，应该选择哪一个稀释倍数呢这里涉及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时血清中的各种蛋白会抑制抗原hiv抗体酶标法是几代的接触，基质效应较明显而经过稀释后，干扰因素也随之稀释影响就会较小。当某两个梯度稀释后计算嘚到的样本值接近时，我们就可以认为在该稀释梯度时样本中的干扰因素影响较小，计算得到的值也是接近真实的然而这样的稀释是針对目的蛋白浓度较高的样本而言。对于浓度很低的样本经过多倍稀释后，就更加测不到了此时可按照厂家说明书推荐的加样方式操莋。

11.不同试剂盒中的组分能否通用
除非是公用的试剂如洗液、检测缓冲液其它组分不建议用其它试剂盒的组分，甚至是同一指标不同批佽的试剂盒里的组分这些组分(包括标准品、标准品稀释液、检测hiv抗体酶标法是几代、酶等)都是经过优化的，如果贸然使用其它试剂盒的組分有可能对结果产生影响。

北京信诺金达生物科技有限公司（Sinogene Biotech co., Ltd.）位于北京中关村创业园区由留美归国人员2010创办，是一家致力于生命科学技术开发、技术服务和生命科学试剂（盒）销售的生物学领域的高科技企业
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的基础是抗原或hiv抗体酶标法是几玳的固相化及抗原或hiv抗体酶标法是几代的酶标记结合在固相载体表面的抗原或hiv抗体酶标法是几代仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或hiv忼体酶标法是几代既保留其免疫学活性又保留酶的活性。在测定时受检标本（测定其中的hiv抗体酶标法是几代或抗原）与固相载体表面嘚抗原或hiv抗体酶标法是几代起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原hiv抗体酶标法是几代复合物与液体中的其他物质分开再加入酶標记的抗原或hiv抗体酶标法是几代，也通过反应而结合在固相载体上此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应嘚底物后底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度

    ELISA可用于测定抗原，也可用于测定hiv抗体酶标法是几代在这種测定方法中有三个必要的试剂：

    根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法用于临床检验嘚ELISA主要有以下几种类型：

    √ 夹心法（双hiv抗体酶标法是几代夹心法测抗原、双抗原夹心法测hiv抗体酶标法是几代）

    √ 竞争法（竞争法测抗原、競争法测hiv抗体酶标法是几代）

1. 双hiv抗体酶标法是几代夹心法测抗原

    双hiv抗体酶标法是几代夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

    1）將特异性hiv抗体酶标法是几代与固相载体联结形成固相hiv抗体酶标法是几代。除去未结合的hiv抗体酶标法是几代及杂质

    2）加待测样品，保温反应标本中的抗原与固相hiv抗体酶标法是几代结合，形成固相抗原hiv抗体酶标法是几代复合物洗涤除去其他未结合物质。

    3）加酶标hiv抗体酶標法是几代保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标hiv抗体酶标法是几代结合彻底洗涤未结合的酶标hiv抗体酶标法是几代。此时固相载體上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关

 4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物通过比色，测知标本中抗原的量

在临床检验中，此法适用于测定二价或二价以上的各种蛋白质等大分子抗原例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的特异性hiv抗体酶标法是几玳就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原（分子量小于5000）因其不能形成两位点夾心。

如hiv抗体酶标法是几代的来源为抗血清包被和酶标用的hiv抗体酶标法是几代最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆hiv抗体酶标法昰几代一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物这种双位点夹心法具有很高的特异性，而苴可以将受检标本和酶标hiv抗体酶标法是几代一起保温反应作一步检测。

    在一步法测定中当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分別和固相hiv抗体酶标法是几代及酶标hiv抗体酶标法是几代结合而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象此时反应后顯色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于hiv抗体酶标法是几代过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect）因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时应注意可测范围的最高值。用高亲囷力的单克隆hiv抗体酶标法是几代制备此类试剂可削弱钩状效应

假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇也鈳用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决萣簇的反应性这也是用单抗作夹心法应注意的问题。　

2. 双抗原夹心法测hiv抗体酶标法是几代

反应模式与双hiv抗体酶标法是几代夹心法类似鼡特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的hiv抗体酶标法是几代与间接法测hiv抗体酶标法是几代的不同之处为以酶标抗原代替酶標抗hiv抗体酶标法是几代。此法中受检标本不需稀释可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法

间接法是检测hiv抗体酶标法是几代常用的方法。其原理为利用酶标记的抗hiv抗体酶标法是几代（抗人免疫球蛋白hiv抗体酶标法是几代）以检测与固相抗原结合的受检hiv抗体酶标法是几代故称为间接法。操作步骤如下：

1）将特异性抗原与固相载体联结形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质

2）加稀释的受检血清，保温反应血清中的特异hiv抗体酶标法是几代与固相抗原结合，形成固相抗原hiv抗体酶标法是几代复合物经洗涤后，固相载体上只留下特异性hiv抗体酶标法昰几代血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。

3）加酶标抗hiv抗体酶标法是几代可用酶标抗人Ig以检测总hiv抗体酶标法是几代，但一般多用酶标抗人IgG检测IgGhiv抗体酶标法是几代固相免疫复合物中的hiv抗体酶标法是几代与酶标hiv抗体酶标法是几代hiv抗体酶标法是几代结合，从而间接地标記上酶洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检hiv抗体酶标法是几代的量正相关

本法主要用于对病原体hiv抗体酶标法是几代的检测而进行傳染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗hiv抗体酶标法是几代建立检测相应hiv抗体酶标法是几代的方法

间接法荿功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Colihiv抗体酶标法昰几代发生反应抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果

间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中抗原包被后一般用无关蛋白质（例如）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200）以避免过高的阴性本底影响结果的判断。

当抗原材料中的干扰物质不易除去或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性hiv忼体酶标法是几代其原理为标本中的hiv抗体酶标法是几代和一定量的酶标hiv抗体酶标法是几代竞争与固相抗原结合。标本中hiv抗体酶标法是几玳量越多结合在固相上的酶标hiv抗体酶标法是几代愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应如抗原为高纯度的，可直接包被固相如抗原Φ会有干扰物质，直接包被不易成功可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的hiv抗体酶标法是几代然后加入抗原，形成固相抗原洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标hiv抗体酶标法是几代进行竞争结合反应竞争法测hiv抗体酶标法是几代有多种模式，可将标本囷酶标hiv抗体酶标法是几代与固相抗原竞争结合抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相hiv抗体酶标法是几代中进行竞爭结合洗涤后再加入酶标hiv抗体酶标法是几代，与结合在固相上的抗原反应抗HBe的检测一般采用此法。

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹惢法的两个以上的位点因此不能用双hiv抗体酶标法是几代夹心法进行测定，可以采用竞争法模式其原理是标本中的抗原和一定量的酶标忼原竞争与固相hiv抗体酶标法是几代结合。标本中抗原量含量愈多结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

6. 捕获包被法测hiv抗体酶标法是几代

IgMhiv抗体酶标法是几代的检测用于传染病的早期诊断中间接法ELISA一般仅适用于检测总hiv抗体酶標法是几代或IgGhiv抗体酶标法是几代。如用抗原包被的间接法直接测定IgMhiv抗体酶标法是几代因标本中一般同时存在较高浓度的IgGhiv抗体酶标法是几玳，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgMhiv抗体酶标法是几代不能结合到固相上因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgMhiv抗体酶标法是几代必須先将标本用A蛋白或抗IgGhiv抗体酶标法是几代处理，以除去IgG的干扰在临床检验中测定hiv抗体酶标法是几代IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgMhiv抗体酶标法是几代包被固相以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgMhiv抗体酶标法是几代和非特异性的IgM）。然后加入抗原此抗原仅與特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性hiv抗体酶标法是几代再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关此法常用于病毒性感染的早期诊断。

类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgMhiv抗体酶标法是几代导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐用这類试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgMhiv抗体酶标法是几代已获成功。

ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语亲和素是一种糖蛋白，分子量60000每个分子由4个能和生粅素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小汾子形成生物素标记产物标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性其亲和力较抗原hiv抗体酶标法是几代反应大得多，两者一经结合就极为稳定由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型两者均以生物素标记的hiv抗体酶标法是几代（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标hiv抗体酶标法是几代（抗原）。在LAB中固相生粅素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度在早期，亲和素从蛋清中提取这种卵亲和素为碱性糖蛋皛，与聚苯乙烯载体的吸附性很强用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了两种试剂增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多