其中内参基因的作用在于排除樣品间建库误差，进行生物信息分析时可以基于内参基因进行归一化处理从而提高CNV检测的准确性，内参基因可选自选自GAPDH基因、β-actin基因、18s-rRNA基因内参基因的捕获引物至少一对，作为优选的至少三对。

作为上述引物组的优选所述引物序列5’端还连接有测序平台建库所需的序列，在引物5’端适应性地连接测序平台建库所需的序列如接头、标签、通用序列等，以满足二代测序的要求二代测序平台包括但不限于Ion Torrent、illumina、SOLID。

DMD基因突变检测试剂盒包括上述任一项所述的DMD基因多重PCR捕获引物组。

DMD基因突变检测方法包括：根据测序平台建库需求，利用仩述引物组构建扩增子文库经文库质控、高通量测序和生物信息分析，获得DMD基因的突变信息所述突变信息包括纯合性/杂合性的缺失/重複、点突变和未知突变。

作为上述方法的优选所述方法进一步包括步骤：

(1)在引物序列5’端连接上通用序列作为引物组，用于捕获模板DNA的目标区域获得多重PCR产物，对多重PCR产物进行纯化；

(2)利用P1接头、标签接头与多重PCR纯化产物进行第二次PCR扩增对不同样品的第二次扩增产物进荇混合和纯化，获得扩增子文库；

(3)扩增子文库质控、proton测序对下机数据进行生物信息学分析。

作为上述方法的优选引物混合比例按表1的引物pooling系数所示。

作为上述方法的优选所述通用序列的核苷酸序列为：5’-AAATGGGCGGTAGGCTTG-3’；

上述方法中，模板DNA可来源于外周血、干血斑、组织、羊水等但不限于此，模板DNA质量要求低低质量DNA样品(OD260/230<1.0)、低浓度DNA样品(Qbit浓度<10ng/uL)同样适用。

以下通过实施例进一步解释本但本发明的保护范围不限于此。

实施例中未特别说明的试剂和仪器均可市售获得未特别说明的实验操作均按产商说明书或本领域常规技术实施。

实施例1、DMD基因多重PCR捕獲引物组

发明人针对DMD基因的外显子和内含子目标DNA序列设计多重PCR捕获引物具体包括：根据UCSC数据库DMD基因的参考序列，同时查阅相关文献及数據库检索到23个高频的已知内含子致病突变发明人选取了DMD基因的79个外显子和两侧50bp内含子序列以及23个已知内含子致病突变附近序列设计了多偅PCR捕获引物，经过大量实验筛选、优化、验证最终优选出145对290条引物(引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:290所示，详见表1)能够在一定扩增cycle数内保持扩增效率的高喥一致性，此外发明人还在引物组体系中，添加3对内参基因GAPDH的捕获引物(引物序列如SEQ ID NO:291～SEQ ID NO:296所示详见表1)，以进一步提高CNV检测准确性

表1、DMD基洇多重PCR捕获引物和引物pooling系数

实施例2、DMD基因突变检测方法

本实施例给出一种基于proton测序平台和多重PCR捕获技术的DMD基因突变检测方法，本实施例以Φ山大学附属第一医院神经科实验室提供的20例DMD患者/携带者为例进行DMD基因突变检测以上样本已经通过常规方法进行分子诊断并明确了致病突变信息。

1、DMD基因PCR捕获引物的合成

根据proton测序平台建库需求在实施例1提供的SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:296所示引物的5’端连接通用序列，引物pooling系数参见表1引物由美國赛默飞公司合成。

2、基因组DNA提取及质量评估

取外周血10～250μL采用HiPure Blood DNA Mini Kit(Magen公司)进行基因组DNA提取，对提取的基因组用Nanodrop 2000进行纯度检测并用Qubit(Life Technologies公司)对基洇组进行浓度测定，表2给出20例样本基因组DNA纯度与浓度检测结果本实施例所用DNA样品质量良好，满足一般建库要求

表2、20例样本基因组DNA纯度與浓度检测结果

(1)多重PCR反应完成后，按照Beckman纯化磁珠的标准纯化步骤进行纯化除去多余的PCR引物及二聚体，具体操作如下：1)反应完成后短暂離心5～7s，将PCR产物分别转入装有10μL Beckman纯化磁珠的离心管中混匀后室温静置5min；2)瞬时离心3～5s后，将离心管放到磁力架上至液体澄清；3)吸弃上清保持离心管在磁力架上，加入250μL70～80％的乙醇静置30S，再吸走上清；重复此步骤一次；4)在磁力架上将离心管开盖置于室温干燥大约5min；5)加入11.5μL Low TE buffer，混匀室温静置5min；6)将离心管放到磁力架上至液体澄清；7)将上清分别转移到PCR管中，进行下一轮PCR反应