mmol·L-1-1),细胞中高的蔗糖浓度有利于反应向分解方向进行蔗糖合成酶活性测定既可在合成方向进行测定(外加底物UDPG和果糖,测产物蔗糖的量表示酶活性)也可以在分解方向进行测定(外加蔗糖和UDP,测定果糖含量表示酶活性)
(1).酶液制备:称取1g预先剥粒备用额小麦籽粒置于預冷的研钵中,分批加入5mL提取缓冲液冰浴研磨提取,2下10000g离心20 min上清液3 mL装入酶经透析后袋中,酶经透析后袋置于酶经透析后缓冲液中4酶经透析后过夜其间更换酶经透析后液3次,酶经透析后后酶液定容5mL备用
(2).:取3支10mL具塞试管,加入0.4mL酶反应液0.1mL UDPG和0.05mL酶经透析后后的酶液,补水至1mL于30水浴中反应10min后,沸水浴3min中止反应对照用蒸馏水代替UDPG。
(4).蔗糖磷酸合成酶反应:在酶反应液中用10mol·L-1果糖-6-磷酸代替果糖其余均按蔗糖合荿酶的方法测定。
(5).标准曲线制作:取7支10mL具塞试管并按下表加入各种试剂,按上述步骤3反应并测定其吸光度以吸光度值为纵坐标,蔗糖含量为横坐标绘制标准曲线,以计算反应中蔗糖形成的数量
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(6).结果计算:蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶活力单位均为mg蔗糖·g-1FW·h-1。
式中C:从标准曲线查得的蔗糖量(mg);FW:样品鲜重(g);t:反应时间(h):Vt:提取酶液总体积(mL);Vs:测定时取用酶液体积(mL);n:提取液测定Φ的稀释倍数。
酶经透析后袋不可装满以防止吸水胀破。
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