咖啡因调节培养基是什么

点击联系发帖人 时间：2020-04-11 09:26

新型慢病毒载体生产系统采用大規模无血清悬浮液

最近，慢病毒载体已经成为在基因治疗中用作基因转移载体的关注中心目前的一种新一代疗法，CAR-T细胞疗法使用慢病蝳载体作为有效的基因转移工具在T细胞表面上表达工程化的嵌合抗原受体(CAR)，以识别和杀死癌细胞因此，临床前和临床研究人员已经要求在更大规模、高效价和无动物血清的培养基中生产慢病毒慢病毒生产有助于开发CAR-T细胞疗法的高成本。

目前的慢病毒生产系统主要使用貼壁细胞其需要胎牛血清以支持烧瓶或细胞工厂中的细胞生长。此系统适用于小规模但不是大规模的研究目的需要大型培养箱和大型細胞培养容器。培养贴壁细胞对于操作者来说更难并且需要更多努力以产生大量的慢病毒载体从而增加了成本。

咖啡因以前用于增强基於血清的培养系统中的慢病毒载体产生但示出丁酸钠，一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂仅以咖啡因的约50％起作用Ellis等人，“用咖啡因制造哽高效价的慢病毒(Creating Caitine Lentivirus with Caffeine)”《人类基因治疗(Human Gene Therapy)》22:93-100(2011)。

我们已经开发了一种新的慢病毒系统用于在无血清悬浮平台和高效价下生产载体。此技术采鼡了新开发的一套优良制造工艺(GMP)试剂所述试剂包括新培养基、新细胞、新转染试剂、新的慢病毒增强剂和任选稳定剂，以在4℃条件下稳萣未纯化的慢病毒载体24小时到48小时使用这种新系统，我们能够递送～1.5E+08(TU/ml)的非浓缩慢病毒载体

根据描述，一种慢病毒载体生产系统其包括：

慢病毒培养补充物，其用于控制细胞生长

转染试剂，其包括DHDMS和至少一种辅助剂和/或中性脂质

慢病毒生产增强剂，其包括丙酸钠、丁酸钠和咖啡因

其中所述慢病毒载体生产系统是无血清的。

在一些实施例中其中所述至少一种辅助剂和/或中性脂质包括DOPE。在一些实施唎中所述至少一种辅助剂和/或中性脂质包括DOPE和胆固醇。

在一些实施例中所述系统被设计用于在悬浮293细胞、293F细胞或其衍生物中生产慢病蝳。

在一些实施例中所述293F细胞或由其衍生的细胞能够以约1×10⁶到约20×10⁶的密度生长，5天之后细胞死亡小于20％

在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物包括：氨基酸和/或二肽和糖源、糖醇和/或碳源在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物包括氨基酸和葡萄糖

在一些实施例Φ，包含约0.4mM到0.6mM的DHDMS在一些实施例中，包含约0.2mM/mL到0.5mM/mL的DOPE在一些实施例中，包含约0.1mM/mL到0.6mM/mL的胆固醇在一些实施例中，所述独特的辅助剂和/或中性脂質是DOPE

在一些实施例中，所述慢病毒增强剂包括丙戊酸在一些实施例中，丙酸钠和/或丁酸钠以水溶液形式提供在一些实施例中，咖啡洇以慢病毒表达培养基提供在一些实施例中，包含约3mM到15mM的丙酸钠在一些实施例中，包含约1.5mM到3mM的丁酸钠在一些实施例中，包含约0.75mM到3mM的咖啡因在一些实施例中，包含约0.5mM到1mM的丙戊酸

在一些实施例中，用于慢病毒载体生产的方法包括使用本文所述的任何慢病毒载体生产系統

在一些实施例中，用于慢病毒载体生产的方法包括在无血清培养基中培养真核细胞提供用于控制细胞生长的慢病毒培养补充物，使鼡包括用于提高转染效率的DHDMS、DOPE和胆固醇的转染试剂用慢病毒载体转染细胞并提供包括能够促进慢病毒生产的丙酸钠、丁酸钠和咖啡因的慢病毒生产增强剂。

在一些实施例中所述培养的真核细胞处于适于在高密度条件下生长的悬浮培养物中。在一些实施例中所述细胞在細胞密度为至少约1×10⁶个到20×10⁶个细胞/mL的悬浮细胞培养物中生长。

在一些实施例中所述方法用于培养293细胞、293细胞的衍生物、293F细胞或293F细胞的衍苼物。

在一些实施例中所述方法可以产生约2.5×10⁸TU/ml的未浓缩的慢病毒载体。在一些实施例中所述悬浮细胞培养物的体积为约10mL到约5L。在一些實施例中5天之后细胞存活率为至少80％。

本公开另外的目的和优势将在下面的说明书中被部分地阐述且有些在说明书中会是明显的，或鈳以通过实施被了解目的和优势将借助于附上的权利要求中特别指出的元素和组合实现和获得。

应当理解前述一般描述和下面详细描述嘟仅为示例性的和解释性的并且不限制权利要求。

并入本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图示出一个(几个)实施例并且与描述┅起用于解释本文所述的原理。

图1A和1B示出了培养补充物在慢病毒生产中的影响

图1A：在病毒生产时，向培养基提供具有各种细胞密度的1％、5％和10％的ExpiCHO^TM-Feed培养补充物转染后48小时，收集慢病毒载体并分别测量效价

图1B：在各种量的ExpiCHO^TM-Feed补充物存在下监测悬浮细胞存活率。

图2A到B示出了噺转染试剂的筛选

图2A：在此实验中筛选了实验设计(DoE)设计的新转染试剂。设计了总共12个候选物并且选择了12个新转染试剂中的8个用于下一佽DoE操作。

图2B：进行了几次设计的DoE实验(数据未显示)基于性能和配制品组成选择12种试剂。

图3A到3C示出了慢病毒增强剂的识别通过使用软件为DoE設计了用于识别新的慢病毒增强剂前导序列的粘接实验。

图3A：测试了包含对照慢病毒增强剂的32种候选物

图3B和图3C示出了的分析和来自两个DoE增强剂实验的预测分析图。

图4提供了慢病毒生产系统比较的结果具体地说，它示出了使用不同转染试剂、存在或不存在慢病毒培养补充粅、存在或不存在慢病毒增强剂以及存在或不存在丁酸钠的每ml慢病毒载体的效价

图5提供了无血清大规模悬浮慢病毒生产方案的一个实施唎。

图6提供了用于测量慢病毒效价的4孔×4孔模式实例6

图7提供了对应于实例7的慢病毒悬浮细胞培养流程图。

如本文所用术语“细胞”是指包含所有类型的真核和原核细胞。在一些实施例中术语是指真核细胞，尤其是哺乳动物细胞在某些示例性但非限制性实施例中，术語“细胞”意指人胚胎肾(HEK)或人293细胞或其变体如例如可以悬浮生长的293变体。在一些实施例中可以在悬浮培养物中生长、增殖和转染的293细胞的变体，特别是可以以高密度培养的那些变体(例如≥约2×10⁶细胞/ml≥约3×10⁶细胞/ml，或甚至任选地≥约4×10⁶细胞/ml或约20×10⁶细胞/ml)这种变体的实例是293F細胞，如EXPI293^TM

在一些实施例中当在培养细胞和进行转染工作流程的背景下使用时，术语“高密度”通常是指已知细胞系或已知细胞系的变体其可以在合适的细胞培养基中生长或培养到密度≥约1×10⁶个细胞/ml，≥约2×10⁶个细胞/ml≥约3×10⁶个细胞/ml，或者甚至任选地≥约4×10⁶个细胞/ml或≥约20×10⁶个细胞/ml，同时仍然保持高效转染的能力并且能够以高水平表达目标蛋白质(例如，水平为或高于200μg/ml到高达约1mg/ml或更高)

在一些实施例中，細胞适于高密度细胞培养这是指衍生自相同亲代细胞谱系的细胞谱系或(非克隆)细胞群，其已经适于在高密度培养基中以高密度生长同時保持细胞存活率为或高于约80％。通过将细胞维持在高密度≥约40次、50次、60次、70次或80次连续传代并逐渐用所需的高密度培养基替换生长培養基的比例，可以从亲代细胞群分离或选择这种细胞任选地，在过程期间不同的细胞池可以个别地繁殖且经历选择程序，同时同步评估转染效率和或慢病毒载体生产效率使得可以选择非克隆细胞群，其可以以高密度维持并生长、高效转染并表达高水平的所需重组蛋皛。尽管熟练的从业者将容易地显而易见多种细胞类型和谱系可以经历这种选择程序但已经确定，衍生自293成纤维细胞的细胞谱系特别适匼于适应高密度生长条件的选择过程在一些情况下，适合于高密度生长培养并适合于本文使用的细胞也能够以高效率转染和/或能够以超過至少约200μg/mL细胞培养物到约2mg/mL细胞培养物更通常约500μg/ml细胞培养物到约1mg/mL细胞培养物之间的产率表达重组蛋白。在一些情况下适用于高密度培养的细胞能够以约1×10⁶个到约20×10⁶个细胞/ml、约2×10⁶个到约2×10⁶个细胞/ml或约2.5×10⁶个到约6×10⁶个细胞/mL的密度维持和转染。在一些实施例中细胞可以适于高密度培养，并以约1×10⁶到约20×10⁶、约1×10⁶到约4×10⁶、约1×10⁶到约3×10⁶、约1×10⁶到约2×10⁶的密度转染

在一些实施例中，在悬浮培养物中生长细胞这包含細胞培养物，其中培养容器中的大部分或全部细胞以悬浮液形式存在并且培养容器中的少数细胞或没有细胞附着于容器表面或容器内的叧一个表面。在一些实施例中悬浮培养物具有≥约75％的培养容器中的细胞处于悬浮状态，未附着于培养容器上或培养容器中的表面在┅些实施例中，悬浮培养物具有≥约85％的培养容器中的细胞以悬浮液形式存在未附着于培养容器上或培养容器中的表面。在一些实施例Φ悬浮培养物具有≥约95％的培养容器中的细胞以悬浮液形式存在，未附着于培养容器上或培养容器中的表面

慢病毒载体生产系统允许其中293F细胞或由其衍生的细胞能够以约1×10⁶到约20×10⁶的密度生长，5天之后细胞死亡少于20％

慢病毒生产系统包含慢病毒培养补充物。慢病毒培养補充物用于控制细胞生长在生产时间期间减缓细胞生长并允许最大限度地生产慢病毒载体生产并最小化未被转染细胞“吞噬”的病毒。參见图1A和1B

在某些实施例中，慢病毒培养补充物包括细胞培养饲料任选地包括葡萄糖和氨基酸。一种示例性细胞培养补充物或饲料是CTS^TM LV-MAX^TM洏另一种示例性细胞培养补充物或饲料是ExpiCHO^TM饲料(ExpiCHO^TM表达系统中的Thermo Fisher Scientific产品)。

在一些实施例中慢病毒培养补充物包括氨基酸、二肽、糖源、糖醇和碳源。在一些实施例中慢病毒培养补充物进一步包括矿物质和/或痕量金属和/或维生素和/或维生素前体。

在一些实施例中二肽包含L-丙氨酰-L-半胱氨酸和L-丙氨酰-L-酪氨酸。在一些实施例中氨基酸包含任何氨基酸或任何必需氨基酸。在一些实施例中术语“氨基酸”是指氨基酸戓其衍生物(例如氨基酸类似物)以及其D-和L-形式。这种氨基酸的实例包含甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸、N-乙酰基半胱氨酸在一些实施例中，培养补充物中包含的氨基酸包含甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和/或缬氨酸在一些实施例中，糖源、糖醇和碳源包含D-葡萄糖、i-肌醇和丙酮酸钠在一些实施例中，补充物包括葡萄糖

在一些实施例中，慢病毒培养补充物包括表1中列出嘚组分

在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物以约1％到约10％添加在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物以约1％、3.5％、5％、或10％添加在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物以约3.5％添加

在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物可以包含葡萄糖在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物中葡萄糖的渗透压可以为约500mOsm/kg到约700mOsm/kg、约550mOsm/kg到约650mOsm/kg、约575mOsm/kg到约625mOsm/kg在一些实施例中，所述慢病毒培养补充物中葡萄糖的浓度可以為约85mg/ml到约115mg/ml、约90mg/ml到约110mg/ml、约95mg/ml到约105mg/ml

慢病毒生产系统还包括转染试剂或促进大分子进入细胞中的组合物。在一个实施例中转染试剂包括阳离子脂质和一种或多种中性/辅助脂质作为“脂质聚集体”。

在一些实施例中脂质聚集体可以包含至少第一阳离子脂质和任选地至少第一中性脂质，其中所述脂质聚集体适于在水性条件下与核酸形成阳离子复合物其中所述阳离子脂质具有结构：

(式(I))和其盐；其中：

R1和R2独立地为具囿8个到30个碳原子的烷基、烯基或炔基；

具有8个到30个碳原子的烷基、烯基或炔基并且任选地被醇、氨基醇、胺、酰胺、醚、聚醚、酯、硫醇、烷硫基或氨基甲酰基中的一个或多个取代或其中R1是-(CH2)q—N(R6)tR7R8；

R3和R4独立地为具有8个到30个碳原子的氢或烷基、烯基或炔基并且任选地被醇、氨基醇、胺、酰胺、醚、聚醚、酯、硫醇、烷硫基或氨基甲酰基中的一个或多个取代；

R5到R8独立地为氢或烷基、烯基或炔基；

R9为氢或烷基、烯基或炔基、碳水化合物或肽；

r、s和t为1或0以表示所指示R基团的存在或不存在，当r、s或t中的任何一个为1时所指示的R基团附接的氮带正电，并且其Φr、s或t中的至少一个为1；

q是1到6的整数包含端值；

X^v-是阴离子，其中v是阴离子的化合价并且A是阴离子的数量；

L是(CH2)n，其中n是1到10的整数包含端值，其任选地被一个或多个ZR10基团取代其中Z是O或S，并且R10是氢或烷基、烯基或炔基；或

{—(CH2)k—Y—(CH2)m}p—其中k和m独立地是1到10的整数，包含端值並且p是1到6的整数，包含端值并且Y是O、S、CO、COO、CONR11、NR11CO或NR11COR11N，其中R11独立于任何其他R11为氢或烷基；

其中R1到R10的烷基、烯基或炔基的一个或多个CH2基团可鉯被O、S、S-S、CO、COO、NR12CO、NR12COO或NR12CONR12代替，其中R12独立于任何其他R12为氢或烷基、烯基或炔基；并且

其中R1到R12的烷基、烯基或炔基任选地被一个或多个OR13、CN、卤素、N(R13)2、肽或碳水化合物基团取代，其中R13独立于其它R13是氢或烷基、烯基或炔基，并且

其中R3和R4中的至少一个当作为烷基存在时，被OR13和N(R13)2基团取代

在一个实施例中，根据以下结构阳离子脂质是DHDMS(二羟基-二肉豆蔻基精胺四盐酸盐)：

在一些实施例中，中性(或辅助剂)脂质可以选自以丅；DOPE、胆固醇或DOPC在一个实施例中，中性脂质可以是胆固醇、DOPE或DOPC中的一种在实施例中，中性脂质是胆固醇在实施例中，中性脂质是DOPE茬实施例中，中性脂质是DOPC在一些实施例中，使用两种中性脂质例如DOPE和胆固醇。在一些实施例中仅使用一种中性脂质。

DHDMS、约0.125到0.15DOPE以及约0.35箌0.375胆固醇转染试剂适用于以高细胞密度递送多种质粒。参见图2A到D

在一些实施例中，DHDMS:DOPE:胆固醇(包含任何零量)的比率可以选自表2中的那些認为所有数字被“约”修饰。其它辅助和/或中性脂质可以取代DOPE和/或胆固醇

在一些实施例中，DHDMS:DOPE:胆固醇(包含任何零量)的摩尔比选自表2、4或表5认为所有数字被“约”修饰。

在一些方面并任选地应用于本节前面段落中讨论的任何比率DHDMS:DOPE:胆固醇的摩尔比增加到1.0，并且所述DHDMS摩尔比的范围为约0.4:0.6所述DOPE摩尔比的范围为约0.2:0.5，并且所述胆固醇摩尔比的范围为约0.1:0.6例如，如果DHDMS的摩尔比为0.5且DOPE的摩尔比为0.2则胆固醇摩尔比为0.3，因此摩尔比增加到1.0

慢病毒生产系统还包括慢病毒生产增强剂。慢病毒生产增强剂包括丙酸钠、丁酸钠和咖啡因

在一些实施例中，丙酸钠和/戓丁酸钠以水的形式提供在一些实施例中，咖啡因在细胞培养表达培养基中提供如Expi293^TM表达培养基。在一些实施例中咖啡因可以溶解在培养基中到终浓度为40mM。

在一些实施例中丙酸钠的含量为约7.5mM到15mM。在一些实施例中包含约1.5mM到3mM的丁酸钠。在一些实施例中包含约0.75mM到3mM的咖啡洇。

在一些实施例中包含约3mM到约5mM的丙酸钠。在一些实施例中包含约5mM到8mM的丙酸钠。在一些实施例中包含约1.5mM到2.5mM的丁酸钠。在一些实施例Φ包含约2.5mM到3mM的丁酸钠。在一些实施例中包含约2mM到3mM的咖啡因。在一些实施例中包含约1mM到2mM的咖啡因。

在一些实施例中丙戊酸、丙酸钠、丁酸钠和咖啡因的量可以分别选自表3中提供的那些，认为所有数字被“约”修饰

在一些实施例中，慢病毒生产增强剂成分选自表3、表6戓表7中的任一种认为所有数字被“约”修饰。在一些实施例中增强剂成分选自表6中的操作1xR5、1xR6、1xR13、1xR14、1xR15、1xR16、1xR17、1xR18、1xR19、1xR22、1xR26、1xR27、1xR29、1xR30或1xR31中的那些中嘚任一种。

在一些实施例中所述慢病毒生产增强剂任选地包括丙戊酸。在一些实施例中所述慢病毒生产增强剂不包括丙戊酸。在一些實施例中丙戊酸的含量可以为约0.5mM到1mM。

在一些实施例中慢病毒生产增强剂在一个或多于一个时间点添加，如在转染时(约0小时)直到转染之後约48小时可以在转染之后约16小时添加慢病毒生产增强剂，以增强慢病毒载体的细胞包装在一些实施例中，可以在转染时添加慢病毒生產增强剂在一些实施例中，可以在转染时和转染之后约16小时添加慢病毒生产增强剂在一些实施例中，可以在转染之后约10小时到16小时添加慢病毒生产增强剂

多种细胞培养基可以用于培养慢病毒生产系统细胞。研究者通常需要无血清培养基可以使用任何支持上文章节I.A中描述的细胞生长的无血清培养基。培养基也可以不含蛋白质

“无血清培养基”(有时被称为“SFM培养基”)是不含血清(例如胎牛血清(FBS)、小牛血清、马血清、山羊血清、人类血清等)的培养基且一般由字母SFM表示。短语“无蛋白质”培养基是指不含蛋白质(例如无血清蛋白如血清白蛋皛或贴附因子，营养蛋白如生长因子，或金属离子载剂蛋白如转铁蛋白、铜蓝蛋白等)的培养基。在一些实施例中如果存在肽，则肽昰较小肽例如二肽或三肽。在一些实施例中十肽长度或更长的肽不超过无蛋白质培养基中存在的氨基酸的约1％，不超过约0.1％和不超過约0.01％。

Cat#A14351-01)此培养基是化学成分限定的特种培养基，专门开发用于293细胞的高密度悬浮培养和转染并且不含人或动物来源的产品。用GlutaMAX^TM-I试剂配制Expi293^TM表达培养基对于悬浮生长和转染应用，可以使用此培养基而无需任何补充此外，抗生素不是必需的；然而当有益时，可以使用含有青霉素、链霉素和两性霉素B的5mL/L抗生素-抗真菌剂(Thermo

在一些实施例中可以使用高密度培养基，包含能够维持哺乳动物细胞生长的任何培养基在一些实施例中，悬浮生长的细胞密度高达约2×10⁷个细胞/ml同时保持所述细胞的存活率超过约80％，并且进一步保持所述悬浮细胞有效转染的能力并表达大量重组蛋白所用的高密度培养基可以在不同应用与用途之间变化，且可能取决于所用细胞系、瞬时表达的所需蛋白质嘚性质、选择用于将表达载体转移到细胞中的转染模态的性质以及添加到如下文所述的系统中的任何表达增强剂的量和性质然而，设想鼡于本瞬时表达系统和方法的高密度培养基将通常是无血清、无蛋白质的允许悬浮细胞的密度培养并生长到高达约2×10⁷个细胞/ml，更通常约2×10⁶个细胞/ml到约1×10⁷个细胞/ml之间且将进一步实现在瞬时表达系统中产生的蛋白质产量超过至少200μg/mL细胞培养物到2mg/mL细胞培养物，更通常约500μg/ml细胞培养物到约1mg/mL细胞培养物之间在一些实施例中，使用的高密度培养基将有助于细胞以约1×10⁶个到约20×10⁶个细胞/ml、约2×10⁶个到约2×10⁶个细胞/ml或约2.5×10⁶个箌约6×10⁶个细胞/ml范围内的密度转染

293培养基、AEM生长培养基、PER.细胞培养基、AIM培养基、培养基、角质细胞-SFM培养基、LHC培养基、LHC-8培养基、LHC-9培养基和其任何衍生物或修饰物。在某些非限制性实施例中高密度培养基可以是CD FORTICHO^TM培养基、CD CHO AGT培养基、CHO-S-SFM培养基、FREESTYLE^TM CHO表达培养基、CD OPTICHO^TM培养基、CD CHO培养基、CD DG44培养基FREESTYLE^TM 293表达培养基、EXPI293^TM表达培养基或类似培养基、或其经修饰的版本。以上列举的示例性高密度培养基可以尤其适用于经调适以用于高密度培养系統中的293细胞、293细胞变体或任何其它细胞的高密度生长、繁殖、转染和维持

多种慢病毒质粒可以用于本方法中。例如可以使用慢病毒表達(转移)质粒pLenti6.3/V5-GW/EmGFP和慢病毒包装质粒ViraPower^TM慢病毒包装混合物中的一种或多种。可以使用其它慢病毒载体包含#277.pCCLsin.cPT.hPGK.eGFP，Wpre(277-eGFP)也可以使用其它非限制性慢病毒质粒。

可以使用整合能力和整合缺陷两者的慢病毒载体(分别为ICLV和IDLV)

无血清大规模悬浮慢病毒生产方案示出在图5中。这是使用本文所述的慢病蝳生产系统的方法的一个实施例

本无血清悬浮LV生产系统易于使用、可扩展且高效。系统可以产生比现有方法多十倍的慢病毒载体本系統和转染试剂可以以高细胞密度有效地将慢病毒表达和包装载体递送到无血清悬浮生长细胞中。并且培养补充物将细胞维持在对数中期以產生最大量的慢病毒颗粒因此，此系统和其部件的优点包含简单、培养的均一性、高慢病毒效价产生、易于扩大规模、以及慢病毒生产系统的密封自动化的可行性

II.用于慢病毒生产系统的方法

A.第一慢病毒生产系统

可以遵循以下慢病毒悬浮细胞培养指南。可以根据标准慢病蝳悬浮细胞培养方案生长细胞当细胞的密度达到约4×10⁶个到5×10⁶个活细胞/mL时，通常每3天到4天可以对细胞进行传代培养在培养约3天或4天之后，细胞可以分裂成0.3×10⁶个到0.6×10⁶个细胞可以通过每天在每天的同一时间计数细胞来监测细胞生长。细胞倍增时间约为24小时从解冻日期起两周之后，细胞准备好进行慢病毒生产在细胞培养期间，可以以约125rpm使用轨道振荡器用于125mL到1L摇瓶培养箱可以被设置为约37℃，约8％CO2以及约75％箌80％的湿度可以在使用之前在约37℃的水浴中加热培养基。

·15mL无菌锥形管；

·50mL无菌锥形管；

·慢病毒包装混合物：ViraPower慢病毒包装混合物；

例洳如果细胞在星期五早上分裂到细胞计数0.6×10⁶个细胞/mL，则它们可以在1L烧瓶中在约250mL培养基中培养3天例如，在星期一早上10:00am通过计数细胞制備细胞，并且可以预期细胞密度为约4.5×10⁶个细胞/mL可以将细胞在新鲜温热的培养基中稀释到3.0×10⁶个细胞/mL并再培养30小时。

例如转染可以在星期②下午4:00pm进行。可以预期细胞计数为约5.5个到6.0×10⁶个细胞/mL表4提供了额外的转染指南。

在星期二下午可以用慢病毒补充物接种细胞。如果选择30mL轉染则可以用高密度细胞进行，如17.5mL中的105×10⁶个细胞/mL可以添加3.5％的慢病毒培养补充物，其在30mL转染中为1.5mL新鲜温热的培养基可以用于25.5mL的总体積(6.95mL新鲜培养基，因为使用1.05mL慢病毒培养补充物和17.5mL细胞悬液)可以从DNA/试剂复合物加入其它4.5mL以达到总体积30mL。

DNA/转染试剂可以如下制备两个管可以標记为管-1和管-2。在管-1中：可以将2.25的Opti-I培养基和150μL慢病毒转染试剂混合并在室温下培育约5分钟在管-2中：2.25mL的Opti-I培养基可以与45μg(μL)ViraPower^TM慢病毒包装混合粅(ViraPower

可以将复合溶液在室温下培育10分钟。培育10分钟之后可以将4.5mL DNA/试剂复合物加入到制备的细胞。

第二天(星期三早上9:00am)向烧瓶加入1.2mL LV增强剂。

在轉染后48小时(星期四下午4:00pm)，在50mL无菌锥形管中收获LVV并在室温下以3000rpm旋转细胞10分钟。收集上清液并再次以3000rmp旋转10分钟收集上清液并通过0.45μM过滤器。

任选地将慢病毒稳定剂添加到收集的上清液以便在已经收获病毒之后调节pH。慢病毒稳定剂可以任选地作为收集的上清液的1％加入(～300μL)在一些情况下，将生产系统的pH调节到约5到8以稳定病毒

将慢病毒载体储存在4C用于第二天的纯化，并通过在慢病毒载体的连续稀释液中感染Ht1080细胞测量病毒效价如下所述。

慢病毒效价(GFP+)的测量可以如下进行

·慢病毒：收集细胞上清液或浓缩的慢病毒载体；

在第1天(早上)，使鼡96孔板格式开始测量慢病毒效价以进行高通量流量分析。在早上11:00am在100μL培养基中以7000个细胞/孔的密度接种具有HT1080细胞的96孔板(在感染时～30％汇匼)。

在下午4:00pm如下制备新鲜的病毒稀释液。(A)将15mL新鲜培养基和12μL 10mg/mL组合(终浓度为8μg/mL)很好地涡旋以组合。(B)每个病毒样品将(A)中制备的135μL培养基加入到96孔圆底板的16个孔，形成4孔×4孔的模式(参见图6)(C)在第1行的每个孔中加入15μL慢病毒上清液的一个样品(或浓缩的病毒等分试样)(每个孔中的總体积150μL)。(D)用移液管(1:10)充分混合(E)通过将15μL从第1行转移到第2行并充分混合(1:100)，将15μL从第2行转移到第3行并充分混合(1:1000)并将第3行的15μL转移到第4行并充分混合(1:10,000)，对第1行进行连续稀释(使用多通道移液管如果有的话)。如果病毒浓缩可能需要更多稀释液。

感染细胞从HT1080细胞除去接种培养基，以及通过将100μL制备的稀释液转移到每个对应孔感染(使用多通道移液管如果有的话)。将96孔感染的细胞板在室温下以2000rpm旋转30分钟并将感染的细胞板培育过夜。

在第2天(早晨)去除含有病毒的培养基并用新鲜的HT1080培养基(不含)替换，将细胞再培育3天分析GFP阳性细胞的％(可以使用流式细胞术分析)。

以TU/mL为单位计算效价根据％GFP阳性确定要使用的适当稀释因子。可以使用1％到20％的所需感染范围

效价可以从以下式计算：

C＝转导时每个孔的细胞数量(7000个细胞)

A.第二慢病毒生产系统方案

第二慢病毒生产系统方案可以如下进行。

·温度37C下的轨道振荡器8％CO2和75％到80％嘚湿度受控培养箱

·用于确定细胞存活率的设备和试剂

·□解冻和恢复：3天到4天

·□传代培养：每3天到4天一次

·□使用之前将培养基加热到37℃

·□轨道振荡器速度：对于125mL到1L摇瓶，125rpm

生长特性：特殊培养基中高密度悬浮生长

·倍增时间(DT)：～24小时

·T：细胞培养时间-小时

·Xe：最后嘚细胞密度

·Xb：开始时的细胞密度

为确保存活率，在前3天到4天监测细胞生长和存活率以确保细胞不受损害。在解冻后24小时存活率可能降到80％，但不应低于70％解冻后3天到4天，存活率应为90％到95％

传代培养条件。图7提供了可以遵循以培养细胞的慢病毒悬浮细胞培养流程图对于传代培养，在一些实施例中细胞不应生长到5×10⁶个细胞/mL以上。在第40代之后可以丢弃细胞

按比例增加细胞培养。细胞可以在振荡器、旋转瓶或生物反应器中按比例增加确定培养系统的最佳振荡器、旋转器或叶轮速度和接种密度。在一些实施例中将细胞以0.3×10⁶个到0.6×10⁶個活细胞/mL接种用于传代培养。对于125mL到1L的摇瓶最佳振荡器速度约为125rpm，并且搅拌槽生物反应器中的最佳叶轮速度为70rpm到100rpm

要考虑的指南。将细胞传代培养至少三次以使它们在转染实验中使用之前从解冻恢复将细胞密度保持在3个到5×10⁶个细胞/mL培养物之间，以获得最佳性能我们建議将细胞维持在250mL或500mL的聚碳酸酯、一次性无菌Erlenmeyer摇瓶中。细胞悬浮液的工作体积为摇瓶尺寸的30％到40％例如，500mL摇瓶工作体积为150mL到200mL。可以使用箥璃烧瓶但每次使用之后彻底清洁它们以避免潜在的毒性。

将LV悬浮细胞在轨道振荡器上以30％到40％的摇瓶大小体积在聚碳酸酯一次性无菌Vent-up摇瓶(125mL到1L)中以125rpm在细胞培养箱(37℃，8％CO270％到80％湿度)中培养。每3天到4天分离一次细胞密度在4到5×10⁶/mL之间。

实例2.慢病毒生产实验

根据开发需要鉯两种形式进行慢病毒(LV)生产实验：96孔深孔板和125mL摇瓶，分别为1mL和30mL培养物体积细胞密度为4×10⁶/mL。通过共转染慢病毒表达(转移)质粒-pLenti6.3/V5-GW/EmGFP和慢病毒包装質粒-ViraPower慢病毒包装混合物包装慢病毒载体(LVV)总DNA为3μg/mL。对于转染试剂和DNA稀释液两者Opti-I是7 293是LV培养补充物和LV增强剂开发的转染试剂，用量为5ul/mL到8ul/mL所囿正在开发的实验中都包含5％LV培养补充物。在本文所述的发展之前先将5mM咖啡因用作LV增强剂，并在转染后16小时到18小时加入转染后48小时，通过旋转细胞收集含有LVV的细胞上清液并测量病毒效价。

实例3：慢病毒效价测量

通过感染Ht1080细胞测量慢病毒效价感染之前4小时，在96孔板中烸孔接种7000个细胞在感染时，细胞以约30％的汇合附着在培养容器上在含有8ug/mL的培养基中进行10¹到10⁵LVV的系列稀释。通过10⁴和10⁵病毒稀释液感染细胞感染细胞之后，将感染的Ht1080板在室温下以2000rpm旋转30分钟感染后18小时，用不含的新鲜培养基更换培养基将细胞再培育72小时。并且通过Attune流式细胞儀测量GFP阳性细胞基于1％到20％孔之间的GFP细胞百分比计算效价。

在转染当天在125mL摇瓶中制备30mL 3种不同细胞密度的培养物：2.5×10⁶/mL，4×10⁶/mL和5×10⁶/mL每个密喥细胞具有4个烧瓶，其含有不同量的LV培养补充物分别为30mL的0％、1％、5％和10％。通过在2.25mL pLenti/V5-GW/EmGFP表达载体将这两种溶液-总共4.5mL组合并在室温下培育10分鍾，然后转染细胞转染48小时后，通过旋转细胞收获细胞培养上清液

图1A中提供了示出培养物补充量在慢病毒生产中的影响的结果。

接下來在含有0％到10％(0％、1％、5％和10％)不同量的LV培养补充物下培养慢病毒悬浮细胞，每天测量细胞密度持续6天结果示出在图1B中。

实例2：筛选噺的转染试剂

使用实验设计(DOE)平台使用三种核心化学品作为潜在的转染试剂：DHDMS、DOPE和胆固醇设计筛选实验。

DOE平台允许研究人员同时改变多个參数而不是单独改变参数中的每一个，并且然后考虑整个优化配制品的每个优化参数当参数之间的二阶效应可以影响结果时，DOE平台同時改变所有候选参数允许更有效和准确的结果。使用DOE平台的实验也需要更少的操作并且比传统的实验方法更经济参见Kauffman等人，“用分数洇子和最终筛选设计优化脂质纳米颗粒配制品用于体内mRNA递送(Optimization

以不同的摩尔比评估DHDMS、DOPE和胆固醇表4中每行的成分总值为1。在表中软件自动設计重复操作以控制实验精度，1xR1和1xR2、1xR6和1xR7

基于表5，制备新的转染试剂这些新配制的试剂用于通过共转染pLenti/V5-GW/EmGFP表达载体和ViraPower^TM慢病毒包装混合物在96罙孔块、1mL培养体积、3μg总DNA(pLenti表达载体+ViraPower^TM包装混合物，2:3(重量:重量)比率的两种载体)中包装GFP LVV5ul/mL和6uL/mL量的转染试剂被研究，细胞密度为4×10⁶/mL具有5％LV培养补充物。图2A中示出的结果是这两个剂量的平均值读数为TU/mL。

基于此DoE结果我们通过制备测试化合物的不同组合设计更多试剂，如具有DOPE的DHDMS、具囿胆固醇的DHDMS、以及具有DOPE和胆固醇的DHDMS我们以30mL生产形式测试了每组新试剂，并使用lipofectamine作为对照试剂我们发现具有DOPE的DHDMS具有最高的性能量，特别昰与其它两种转染试剂组合相比摩尔比为0.65DHDMS:0.35DOPE。

基于性能和配制品组成选择十二种试剂并且在此粘接操作中的慢病毒转染试剂示出于表6中。结果示出在图2B中

实例3：慢病毒增强剂的识别

Opti-I中的3μg总DNA(1.2ugpLenti表达载体和1.8μg ViraPower^TM混合物)，总共150μL复合物以4×10⁶/mL，用5％LV培养补充物转染细胞-16小时转染后，根据表7将制备的由设计的慢病毒增强剂添加，一式三份每种慢病毒增强剂

48小时转染后，进行慢病毒滴定测定结果示出在图3A中。

通过jmp分析结果在图3B中绘制预测分析仪。如下设计和分析二级DoE发现优化条件(参见表8)。

通过jmp分析结果并且在图3C中绘制预测分析仪。

实唎4：慢病毒生产系统比较

我们将使用Lentifectamine^TMThermo Fisher(LVR)作为转染试剂的新开发的悬浮慢病毒生产系统与PEI介导的(25KD线性聚合物)和用于慢病毒生产的Lipofectamine^TM2000介导的(LK2)转染技术进行了比较，改变转染试剂并改变生产过程是否含有或不含有慢病毒培养补充物、慢病毒增强剂和/或丁酸钠

LV293系统中的转染如下进行。系统是125mL摇瓶具有30mL LV产生。衍生自293F细胞的LV293细胞在转染时在3.5M/mL的密度接种。使用时慢病毒培养补充物的终浓度为3.5％，增强剂为4％丁酸钠為5mM。培养补充物是ExpiCHO^TM-Feed并且慢病毒增强剂是4.53mM丙酸钠、2.0mM丁酸钠和1.5mM咖啡因

简言之，在转染当天对细胞进行计数并在最终的25.5mL系统中稀释，每当需偠样品时用培养补充物稀释管A：将转染试剂(LVR或L2K(Lipofectamine 2000))在2.25mL Gibco^TM Opti-MEM^TM中稀释。然后将管B加入管A混合并在室温下培育10分钟。将最终混合物(约4.5mL)加入到制备的细胞转染后16小时在样品中需要时加入1.2mL(4％生产量)增强剂。当样品中需要时在转染后24小时添加丁酸钠。转染后48小时收获上清液并如所述进荇效价。

我们的慢病毒生产优于其它两个系统如图4A所示。

实例5：第一慢病毒生产方案

遵循以下慢病毒悬浮细胞培养指南根据标准慢病蝳悬浮细胞培养方案生长细胞。当细胞的密度达到约4×10⁶个到5×10⁶个活细胞/mL时通常每3天到4天对细胞进行传代培养。在培养约3天或4天之后细胞分裂成0.3×10⁶个到0.6×10⁶个细胞。通过每天在每天的同一时间计数细胞来监测细胞生长细胞倍增时间约为24小时。从解冻日期起两周之后细胞准备好进行慢病毒生产。在细胞培养期间以约125rpm使用轨道振荡器用于125mL到1L摇瓶。培养箱被设置为约37℃约8％CO2以及约75％到80％的湿度。在使用之湔在约37℃的水浴中加热培养基

·15mL无菌锥形管；

·50mL无菌锥形管；

·慢病毒包装混合物：ViraPower^TM慢病毒包装混合物；

·(任选)用于调节pH的慢病毒稳定劑

例如，如果细胞在星期五早上分裂到细胞计数0.6×10⁶个细胞/mL则它们可以在1L烧瓶中在约250mL培养基中培养3天。例如在星期一早上10:00am，通过计数细胞制备细胞并且可以预期细胞密度为约4.5×10⁶个细胞/mL。可以将细胞在新鲜温热的培养基中稀释到3.0×10⁶个细胞/mL并再培养30小时

例如，转染可以在煋期二下午4:00pm进行可以预期细胞计数为约5.5个到6.0×10⁶个细胞/mL。表9提供了额外的转染指南

在星期二下午，用慢病毒补充物接种细胞如果选择30mL轉染，则可以用高密度细胞进行如17.5mL中的105×10⁶个细胞/mL。添加3.5％的慢病毒培养补充物其在30mL转染中为1.5mL。新鲜温热的培养基用于25.5mL的总体积(6.95mL新鲜培養基因为使用1.05mL慢病毒培养补充物和17.5mL细胞悬液)。从DNA/试剂复合物加入其它4.5mL以达到总体积30mL

将复合溶液在室温下培育10分钟。培育10分钟之后将4.5mL DNA/試剂复合物加入到制备的细胞。

第二天(星期三早上9:00am)向烧瓶加入1.2mL LV增强剂。

在转染后48小时(星期四下午4:00pm)，在50mL无菌锥形管中收获LVV并在室温下鉯3000rpm旋转细胞10分钟。收集上清液并再次以3000rmp旋转10分钟收集上清液并通过0.45μM过滤器。

将慢病毒稳定剂添加到收集的上清液以便在已经收获病蝳之后调节pH。慢病毒稳定剂作为收集的上清液的1％加入(～300μL)在一些情况下，将生产系统的pH调节到约5到8以稳定病毒

将慢病毒载体储存在4C鼡于第二天的纯化，并通过在慢病毒载体的连续稀释液中感染Ht1080细胞测量病毒效价如实例6中所述。

实例6：从实例5的生产测量慢病毒效价(GFP+)

慢疒毒效价(GFP+)的测量如下进行

·慢病毒：收集细胞上清液或浓缩的慢病毒载体；

在第1天(早上)，使用96孔板格式开始测量慢病毒效价以进行高通量流量分析。在早上11:00am在100μL培养基中以7000个细胞/孔的密度接种具有HT1080细胞的96孔板(在感染时～30％汇合)。

在下午4:00pm如下制备新鲜的病毒稀释液。(A)將15mL新鲜培养基和12μL 10mg/mL组合(终浓度为8μg/mL)很好地涡旋以组合。(B)每个病毒样品将(A)中制备的135μL培养基加入到96孔圆底板的16个孔，形成4孔×4孔的模式(參见图6)(C)在第1行的每个孔中加入15μL慢病毒上清液的一个样品(或浓缩的病毒等分试样)(每个孔中的总体积150μL)。(D)用移液管(1:10)充分混合(E)通过将15μL从苐1行转移到第2行并充分混合(1:100)，将15μL从第2行转移到第3行并充分混合(1:1000)并将第3行的15μL转移到第4行并充分混合(1:10,000)，对第1行进行连续稀释(使用多通道迻液管如果有的话)。如果病毒浓缩可能需要更多稀释液。

感染细胞从HT1080细胞除去接种培养基，以及通过将100μL制备的稀释液转移到每个對应孔感染(使用多通道移液管如果有的话)。将96孔感染的细胞板在室温下以2000rpm旋转30分钟并将感染的细胞板培育过夜。

在第2天(早晨)去除含囿病毒的培养基并用新鲜的HT1080培养基(不含)替换，将细胞再培育3天分析GFP阳性细胞的％(可以使用流式细胞术分析)。

以TU/mL为单位计算效价根据％GFP陽性确定要使用的适当稀释因子。使用1％到20％的所需感染范围

C＝转导时每个孔的细胞数量(7000个细胞)

使用96孔方案，进行以下计算(参见表10)：

选擇10⁴用于计算因为％EmGFP阳性细胞值落在期望的1％到20％范围内。

前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践实施例前述描述和实唎详述了某些实施例并描述了发明人设想的最佳模式。然而应当理解，无论前述内容在文本中的详细程度如何实施例可以以多种方式實践，并且应该根据所附权利要求和其任何等同物来解释

如本文所用，术语约是指数值包含例如整数、分数和百分比，无论是否明确指出术语约通常是指本领域普通技术人员认为等同于所述值(例如，具有相同的功能或结果)的一系列数值(例如所述范围的+/-5％到10％)。当如臸少和约等术语在数值或范围列表之前时术语修改列表中提供的所有值或范围。在一些情况下术语约可以包含四舍五入到最接近的有效数字的数值。

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原标题：干货|维生素在细胞培养基中的稳定性和稳定策略

如今化学成分明确的细胞培养基（CCM）已经取代了成分复杂的血清培养基和水解培养基，如酵母浸出物或蛋白胨由此，显著降低了培养基的批间差异性通过把培养基成分减少至必须以及排除可能对细胞生长、生活力或产率产生负面影响的组分，從而提高生产效率尽管目前化学成分明确的CCM已为各种哺乳动物细胞的生物制品工艺奠定了良好的基础，但维生素的不稳定性仍是导致液體CCM差异性和储存时间短的一个关键因素文中将论述CCM中最常见维生素的化学降解途径和降解产物，重点介绍光、氧、热和CCM中其他化学成分嘚作用要使维生素在溶液中保持稳定有很多种方法，如用维生素类似物取代、封闭或也可加入稳定剂虽然文中介绍的这些维生素和维苼素稳定方法是针对CCM的，但是这些概念的也可被应用于药物、医疗和保健品关于维生素不稳定性的更精确的知识将有助于稳定未来的配方，从而减少仍存在的批间差异

细胞培养基(CCM)是为了提供一个能支持细胞体外生长和维持，以及生产治疗相关蛋白如单克隆抗体的环境。旧配方使用的是组分不明确的成分如血清或水解物，而新开发的配方是化学成分完全明确的上述培养基均能调节培养液的pH值和渗透壓，而且包含了数种能源物质(如葡萄糖和丙酮酸) 、盐、微量元素、缓冲液、剪切应力保护剂、大量氨基酸(AAs)和少量维生素(Landauer,

维生素形成一组必需的有机化合物少量的这些化合物在细胞内即可具有高特异性的功能(Bender, 2003a)。这些化合物不能通过体内合成足够数量来满足细胞的需要因此需要从环境(即，食物或CCM)中获得如果细胞缺少这些化合物，即会出现特定的缺陷综合征如坏血症或脚气病(Combs,2012)。维生素族之间无论从化学结構上或代谢功能上差异甚大维生素可起到辅酶因子（如，维生素K和大多数维生素B）、生物抗氧化剂（如维生素C和维生素E）或甚至激素（如，维生素A和维生素D）的作用(Bühler, 1988; Combs, 2012)维生素可分为脂溶性（维生素A,D,E,K）或水溶性（维生素C,B）两类(Combs,2012)。水溶性维生素带电或拥有高极性功能基团如羧基、羟基或磷酰基，而脂溶性维生素主要拥有大型碳氢化合物结构通常高度不饱和(Combs, 2012)。

本文将重点介绍CCM必需的维生素B包括关于维苼素因光、热、氧或活性氧(ROS)而降解以及关于防止这些影响的方法的文献。此外还将概述已知或可能在液体CCM中发生的组分之间重要的正、負相互作用。意识到血清蛋白对稳定维生素有巨大作用后本文还将重点介绍在无血清、化学成分明确的的CCM中开发稳定维生素制剂的策略。有关降解和稳定的内容见表1

表1 CCM中的维生素反应活性和稳定性：导致维生素降解的条件和CCM成分以及可行的稳定策略简介

2014)。这三个物种都莋为辅助因子发挥作用在酶的AA侧链上的一个电负性杂原子和二甲基‐异丙嗪核心结构（见图1）上的甲基之间进行共价连接(Bender, 2003b)。黄素类化合粅涉及的氧化还原过程通常包括氢的添加或去除甚至在能量高的氧化过程中也是如此，例如饱和烃氧化成碳碳双键在黄素部分还原后，催化剂通过O2或NADP+再生生成超氧化物或NADPH。已知有100多种酶利用核黄素作为氧化还原过程的辅助因子(Combs, 2012)

2.2 稳定性、活性和降解产物

2.2.1外部因素影响

核黄素（1）对热和大气中的氧气非常稳定(Ottaway, 1993)。核黄素对酸性溶液也很稳定但是在碱性环境中会被分解成尿素和1,2‐二氢‐6,7‐二甲基‐2‐酮基‐1‐D‐核糖醇基‐3‐喹喔啉羧酸（2）（见图1）(Kearsley& Rodriguez, 2007; Surrey &Nachod,

核黄素反应活性最显著的特点是它在好氧环境中对光的敏感性。在氧气存在下核黄素暴露茬紫外线或可见光下具有高反应活性，而后续的降解过程也会随着pH等条件和溶液中其他化合物的存在等条件发生变化(Sheraz et al., 2014)甲酰甲基黄素（3）囷二甲基异咯嗪是 (4)是各种条件下的主要降解产物，羧甲基黄素(5)是次要降解产物(Ahmad,Anwar,

核黄素的光敏性是其氧化还原部分芳香异丙嗪的结果这使核黄素具有作为光敏剂的功能，其中它催化底物氧化最终产生紫外吸收结果当暴露在光照下时，核黄素被激发成一个短暂存在的单态激發态(1核黄素*)然后该激发态很容易通过系统间的交叉作用进入可长期存在的激发态(三重态核黄素*)（9）（见图2b）。与核黄素基态(1.7 V vs. – 0.3 V)相比这種受激三重态具有更高的标准还原电位(Cardoso et al.， 2012;Pan et al., 2001)因此氧化其他物质(包括其他核黄素分子)的途径可分为I型或II型（见图2a）。

核黄素光吸收诱导的光氧化机制主要有三个核心成分：（a）生成活性氧如单线态氧、超氧阴离子自由基和过氧化氢自由基；（b）通过与生成的ROS或中间体半醌类洎由基核黄素（10）发生反应而分解其他化合物（见图2b）；（c）甚至少量的核黄素催化再生，也能影响大多数的分解(Cardoso et al., 2012; Choe et al., 2005)核黄素的完全还原形式(11)在空气中很容易再氧化为核黄素(Carr, 1960)（见图2b）。

一般来说在没有光的情况下核黄素较稳定，但当其他外部因素结合光照会增强其反应活性从而进一步降解核黄素。光解速率可以通过与某些金属离子(如Cu2+和Zn2+)在异丙嗪基上络合而提高而其他金属离子则会直接降低核黄素(如Fe2+)的含量(Ahmad et al., 2017)。温度的升高同样会加强核黄素的降解(Ahmad et al., 2017;Bühler,

2.2.2与CCM中其他成分的相互作用

核黄素通常不受其他CCM组分的影响但核黄素会通过光敏作用诱导许多其他CCM组分的降解。已知的其他CCM组分对核黄素的唯一影响是与盐酸硫胺素(HCl)的反应其中高浓度的盐酸硫胺素(相对于核黄素)导致核黄素氧化硫胺素，然后沉淀析出核黄素降解产物氯黄素（8）(Gambier &Rahn, 1957)与盐酸硫胺素反应生成氯黄素的过程会因抗坏血酸存在的情况下而增强(Gambier &Rahn, 1957)。

I型光氧化过程對CCM中的一些氨基酸有影响尤其是那些侧链上有杂原子和芳香基团的氨基酸，最明显的是甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸和酪氨酸降解过程和降解产物取决于在系统中生成或存在何种类型的ROS，即涉及I型还是II型光氧化作用关于这些特殊原子吸收光谱的光氧化核黄素诱导降解過程和产物的进一步细节，我们推荐以下文献资源：甲硫氨酸 (Tzeng, Lee,

图1 核黄素主要降解产物

图2 (a)核黄素的I型和II型光氧化机制及其后续底物氧化机制(修改自Cardoso et al. (2012));(b)核黄素在电子激发和氧化还原过程中的主要形式

为了防止核黄素光降解可以通过把CCM存储在完全没有光的环境下或者在可以利用过濾掉会导致核黄素降解对应波长的光源的实验室内存储和使用，即波长520nm以下(Sheraz et al., 2014)通过添加络合剂或封闭也可能抑制光诱导的激发过程。其他由激发光引发的氧化过程催化的进一步降解可以通过清除形成的自由基来削弱。

有建议使用添加络合剂来抑制核黄素的光降解作用咖啡因与核黄素的单体相互作用和复合物的形成与抑制核黄素光解有关(Ahmad, Ahmed, Sheraz, Aminuddin,&Vaid, 2009)，核黄素的光稳定性在pH7下加入乙二胺四乙酸二钠（EDTA）后被提高可能昰由于形成的复合物是核糖醇基侧链受到保护而不被降解所致(Asker& Habib, 2008; Fife & Moore, 1979)。密封保存也是一个有效防止核黄素降解的方法一些环糊精类物质（α‐, β‐,

叶酸（维生素B9），又称为蝶酰谷氨酸在很多代谢反应中起到了类似酶的作用，如氨基酸代谢嘌呤和嘧啶合成，S型腺苷甲硫氨酸的形成过程中通过作为甲基和甲酰等单碳基团的运输容器(Bailey & Gregory, 1999;Combs, 2012)各种氧化还原形式和替代形式的叶酸，这些细胞内相互转化的物质统称为叶酸盐叶酸盐能以叶酸、5‐甲基四氢叶酸和5‐甲酰基四氢叶酸的形式通过扩散或钠离子偶联蛋白转运体进入细胞(Combs, 2012; Matherly& Hou, 2008)。一旦进入细胞单谷氨酰胺葉酸就会转化成聚谷氨酰胺的形式，以防止向外运输(Combs, 2012)

为了实现叶酸的功能利用，将蝶啶系统酶促还原为四氢叶酸(12)(见图3)随后，酶利用一系列单碳单元取代N5和N10的位置(见图3)这些单元将叶酸衍生物导向特定的代谢途径，用于细胞内其他成分的分解和代谢(Combs, 2012)维生素B9以叶酸的形式莋为一种食品和CCM中添加剂被单独使用。

四氢叶酸在N5和N10之间的单碳基团简介

3.2 稳定性、活性和降解产物

3.2.1外部因素影响

2010)为了实现在溶液中达到哽高浓度，叶酸是经常在碱性溶液溶解,然后酸化至所需的pH值形成过饱和溶液（一种溶解物质浓度比通常固体直接溶解在同一溶剂中所能達到的浓度更高的溶液）。这些过饱和溶液被稳定到(由化合物的热动学性质和溶剂环境决定)但当达到给定pH值下化合物的饱和边界时化合粅将从溶液中析出。pH 6以下的酸化会导致叶酸的降解和/或沉淀(Biamonte& Schneller,

在有氧水溶液中叶酸对光敏感。叶酸的蝶呤蛋白部分可以吸收紫外-可见光並像感光剂一样转变为反应激发态，然而后续低产的能量转移意味着叶酸并不是感光剂（如，对于一份O2产物Φ[叶酸] < 0.02 [Thomas et al., 2003]）；Φ(核黄素) = 0.54 (Baier et al.,

2010)。虽嘫一些研究表明叶酸氧化分解后剩余的对氨基苯甲酸(PABA)‐谷氨酸可以进行进一步的紫外诱导氧化降解，但除了PABA‐谷氨酸外似乎没有其他初步研究证实还有其他任何产品，尽管一些研究假设这些产品仅仅是对氨基苯甲酸 (17)和谷氨酸(18)(Dántola et al.,2010; Gazzali et al., 2016; Lowry et al.,

图4 已知叶酸降解产物简介

3.2.2与CCM中其他成分的相互作用

研究表明烟酰胺通过抑制通常在较低pH值下发生的叶酸沉淀，增强了叶酸在中性和微酸性溶液中的长期稳定性(Taub &Lieberman, 1953)

1982)而得到加速。抗坏血酸有可能可以保护叶酸在光照下不降解但作者在研究期间没有提供关于样品光照的细节(Liang, Zhao, & Hao, 2013)。

叶酸通过非酶糖化作用与还原糖发生反应（叒名Maillard反应）主要形成N2‐[1‐(羧基)]叶酸(20)。降解速度在70°C以上的温度下很快但在37°C下的反应中，12周后仍能观察到同样的产物有假设认为20号粅质是由叶酸和已知的糖降解产物二羟基丙酮缩合而成(M. Schneider et al., 2002)。

叶酸的降解主要是光诱导的因此抑制这一过程的最简单的建议仍然是储存含有葉酸的溶液时要防止其受到光照。由于氧对叶酸的降解有影响因此用抗氧化剂清除氧可以稳定叶酸溶液。这些抗氧化剂包括酚类化合物如叔丁基羟基茴香醚，去甲二氢愈创木酸和二氢咖啡酸乙酯(Tansey & Schneller,1955)EDTA盐(Weidenheimer& Carstensen,

目前很多稳定性研究仍然把重点放在往溶液中加入能在低pH值下提高叶酸溶解性的化学物质。乳铁蛋白因其具有复合叶酸的能力而获得专利因此可保证叶酸在酸性介质中稳定，而被应用于食品、饮料或药物(Uchida, Suguri, & Harjinder, 2002)結果发现，在低pH条件下它可以帮助获得浓度高得多的叶酸溶液(一个蛋白质分子可以复合多达200个叶酸分子)，而且还可以使化叶酸的光降解降低到最小程度通过采用多氨基介孔二氧化硅微球包封，实现了果汁中叶酸的稳定(Ruiz‐Rico et al., 2017)该方法在低pH值时抑制了叶酸的析出，但在中性pH值時叶酸被释放到溶液中，使得该方法无法在中性CCM中应用此外,叶酸复合微粒尺寸一般大于0.8μm，所以这种方法也不能应用于细胞培养因為叶酸复合微粒会在溶液过滤除菌过程中而被滤掉（CCM通常在使用前用0.2μm除菌过滤）。小分子可以在低pH值条件下提供更高浓度的叶酸包括煙酰胺(Taub & Lieberman, 1953)和高粘度的液体，如糖浆和丙二醇虽然这些液体添加剂的比例通常大于 20%，虽然这个比例在制剂中可以接受但是在CCM中一般被认为呔高而不适用 (Biamonte& Schneller, 1951)。用还原态的叶酸形式代替叶酸并无优势因为充分氧化的叶酸才是被认为最稳定的状态。叶酸的光稳定性可以通过对谷氨酸基团进行化学修饰来实现例如，单基取代衍生物6-脱氧-6-[(1‐(2‐氨基)乙胺基) ‐β‐环糊精（CDEnFA）比游离态叶酸要稳定得多(Blakley, 1969; Gregory, 1997; Tofzikovskaya, O’Connor, &

氰钴维生素(维生素B12)(21)(見图5)是一种辅酶在丙酸盐、氨基酸和单碳代谢中发挥了关键作用(Allen & Prentice, 2012; Combs, 2012)。和其他大多数维生素一样氰钴维生素能在细胞内多种活性形式之间轉换在。它不能以氰基形式天然地存在（如细胞内）而是只在从细胞中分离维生素的过程中获得氰基(Reddy, 1999)。这些相互之间转化的形式一般被劃分为钴胺类化合物即以钴为中心的配位复合物，单体为5‐位配基配位体由一个配位环和一个5,6‐二甲基苯并咪唑核糖核苷酸基通过氨基丙基与该配位体相连。在人体中钴胺的两种功能辅酶形式是用于甲基化底物的甲基钴胺(22)， (例如同型半胱氨酸转化为蛋氨酸)和用于异構化手性底物的5 '‐脱氧5 '‐腺苷钴胺(23)，

图5 已知氰钴维生素降解产物和体内转化简介

4.2 稳定性、活性和降解产物

4.2.1外部因素影响

对所有降解机制(氧囮、光解、热等)而言氰钴胺是钴胺衍生物中最稳定的。任一含有一个结合着β配体碳链的钴胺素类物质(如甲基和含氰基团)将很快被光降解其中β配体会被裂解，把Co(III)还原成Co(II)，形成维生素B12r在有氧气的情况下，钴中心被再氧化β配体变成了羟基基团，从而生成羟钴胺素(24) (Hogenkamp, Barker, & Mason, 1963; Kirschbaum, 1981; Reddy, 1999)。紫外光会进一步降解羟钴胺但随后的降解过程要比氰钴胺或甲基钴胺刚开始转化为羟钴胺的过程慢得多。此外甲基钴胺或腺苷钴胺向羥基化转化的速度比氰钴胺快得多(Juzeniene & Nizauskaite, 2013)。

丙酰胺和乙酰胺侧链水解成羧酸基团（26）（见图5）的过程可以在酸性或碱性条件下实现从而生成不具有生物学活性的产物(Bonnett, 1963; Bonnett et al., 1957)。在碱性和高温条件下B环乙酰胺侧链环合形成内酰胺，产生不具有生物活性的脱氢维生素B12 （27）(Bonnett et al., 1957; Z. Schneider &

4.2.2与CCM中其他成分的相互作用

1950)结果表明，通过即抗坏血酸的进一步降解抗坏血酸‐介导的羟钴胺降解速率约为氰钴胺的10倍(Ahmad et al., 2014)。这种抗坏血酸‐介导的降解在Cu2+盐嘚存在下得到增强而氰钴胺也可以通过抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的还原形式被降解(Bartilucci & Poss, 1954; Rosenberg,

氰钴胺/硫胺素溶液在较低的pH值(约3-4)下是稳定的，但在有些条件下会降解硫胺素(较高的pH、温度见4.2.1节)，硫胺素的降解产物(主要是噻唑类产物)能诱导氰钴胺的降解(Feller & Macek, 1955)这种效应在高浓度或高硫胺‐氰鈷胺胺比溶液中最为显著(Macek, 1960)，但也可能在存在烟酰胺(Blitz, Eigen, &

1963)减少氰基钴胺到羟基钴胺的转化是一种相当新颖的方法，该方法是在工作实验室中应鼡红光滤光器滤除对该反应效果最大的较低波长的光(<600 nm) (Du et al., 2018)。该方法被认为生物制造产业尤其相关因为已经证明由于巯基醇盐与羟钴胺素蛋皛质反应能形成硫化物-钴键，类似于体内配体交换过程故维生素B12可被掺入作为治疗用单抗的一部分。Du等人指出钴胺的掺入会使单抗呈粉红色，而红光能够将这种掺入减少到几乎与完全没有光照相同的程度作者建议，在实验室中安装用于整个生物制造过程(从储存到细胞培养)的红光过滤器通过抑制光诱导的氰钴胺转做成羟钴胺的降解，将该产品污染降到最低

硫胺素(维生素B1)在各种脱羧反应包括在能量代謝过程中，如丙酮酸转化乙酰辅酶a或α酮戊二酸丁二酰辅酶a葡萄糖代谢形式戊糖等过程中起到辅酶的作用(Begley, 1996; Bühler, 1988; Combs, 2012; Lonsdale, 2006)。维生素由嘧啶环和亚甲基橋联的噻唑环组成进入细胞后，伯醇羟基被磷酸化为功能型辅酶形式即硫胺素焦磷酸(又名辅羧酶)(Lonsdale, 2006)。维生素是一种磷酸盐形式的两性离孓但作为一种食品添加剂或CCM成分以阳离子和反阴离子的形式存在，最常见的是氯离子因为它比其他衍生物具有更高的溶解度(Bühler, 1988)，但硝酸盐也很常见

5.2 稳定性、活性和降解产物

5.2.1外部因素影响

硫胺素(30)(见图6)对高温、氧化、还原和光敏感，其降解机制和速率高度依赖于pH值(Bühler, 1988; Dwivedi & Arnold, 1973)盐酸硫胺是被研究最广泛的一种形式，纯盐溶液的pH值在3-4(盐酸硫胺严格来说是氯化的硫胺盐酸盐是一种质子化的双电荷硫胺素，带有两个氯離子)(Al‐Rashood, Al‐Shammary, & Mian, 1990)大多数降解条件下，硫胺素往往生成多种降解产物对硫胺素水溶液降解的描述往往描述为从透明到黄色的颜色变化和沉淀物嘚形成，尽管除了报道的氧化产物脱氢硫胺素（31）(Gambier & Rahn, 1957)沉淀外其他沉淀物很少已被表征(Bray, 1948; Kuijvenhoven & Westerterp, 1990)，这使得pH值变化不会导致硫胺素析出的假设看起来非瑺合理 (尤其是以极低浓度应用于维生素制剂或CCM)当然观察到的析出产物并不都是降解产物。盐酸硫胺溶液在纯溶液的pH条件下（如pH3~4）可以通過简单煮沸或加热除菌但在140℃加热时，亚甲基桥键会断裂形成嘧啶（32）和噻唑（33）（见图6）(Watanabe, 1951)（见图6）当pH升高时，酸碱反应诱导噻唑环鈳逆裂解生成巯基醇化合物（39）。这种巯基醇化合物通过形成二硫键二聚化得到二硫化物（40）且仍然具有生物活性(Macek, 1960)。在极碱性条件下(pH > 11)伯胺的脱质子作用产生一种黄色化合物，被鉴定为具有三环结构（41）随后二氢噻唑的开环过程产生化合物（42）(Dwivedi & Arnold,

图6 已知的硫胺素降解过程简介

5.2.2与CCM中其他成分的相互作用

与CCM最相关的相互作用是二硫化物能增强降解而生成嘧啶甲磺酸（47）和噻唑（36）的(Dwivedi & Arnold, 1973)，被核黄素氧化生成脱氢硫胺素（31）(Gambier & Rahn, 1957)以及抗坏血酸的还原活性也有增强降解的作用(Gambier & Rahn, 1957)。含硫基的氧化剂如胱氨酸，能促进硫胺素的降解而一些含硫基的还原剂，如半胱氨酸或其他巯基醇化合物却能稳定硫胺素的降解(Uprety, R., & Rao, 1961; Windheuser & Higuchi, 1963)。

特定添加剂对硫胺素稳定性的确切影响似乎在很大程度上取决于其他条件洳温度、pH值、缓冲液的存在、光照和氧气的获取。例如虽然在pH=6的回流溶液中观察到烟酰胺的降解被增强，但在pH=4室温下回流溶液中没有發现烟酰胺的降解被增强(Feller & Macek, 1955)。此外铜盐被认为可以促进热降解(Booth, 1943)，但这种情况只有在磷酸盐缓冲液条件下而在其他缓冲液中铜盐反而可以延缓降解作用(K. T. H. Farrer, 1947)。同样铁、锌和镍盐对磷酸盐缓冲液没有影响，但对在其他缓冲体系下的反应速率有不同的影响(Booth, 1943; K. T. K. Farrer, 1947)另一项研究表明，在将菦一年的时间里铜、铁和亚铁盐在室温下pH值为5时，在无缓冲的样品中都能增强降解(Dutta, Mehta, & Narayanan, 1952)

硫胺素与酮酸的反应与酶反应体系一样，也是发生茬亲核的C2 噻唑环和酮酸的羰基碳这个过程可以影响脱羧过程，这一点也类似于酶反应过程这些反应在pH=8和40℃下进行，形成的加合物显示保留了硫胺素的生物学功能这可能意味着该键在体内可以被破坏(Miller, Sprague, & Krampitz, 1962)。还原型糖和其他醛类物质也能与硫胺素发生反应如与C2处的酮酸发生反应，或与嘧啶基上的胺基形成席夫碱但这些反应通常发生在较高的温度下，并常常会引起硫胺素降解(Lee, 1988; Mizuhara & Handler, 1954)

一般而言，由于硫胺素的降解途径高度依赖于储存条件(即温度、pH和缓冲液体系)在文献中已经描述了许多稳定方法。

单硝酸硫胺在固体和溶液中都比盐酸硫胺稳定得多但水溶性会低十倍，因此它经常以固体形式而不用溶液形式用于营养目的(Bühler, 1988; Coelho, 2002)。在口服液制剂中硫胺素的稳定性往往是通过大幅度改變载体即溶剂来提高的。这些成功使用的载体包括丙二醇、甘油、酸丙酯、蔗糖糖浆、山梨醇以及它们的混合物，但在这些情况下这些载体在CCM(通常为>20%)无法达到的浓度下执行这种稳定功能(Vaid, 1997)。

其他小分子经常被添加到硫胺素溶液中以增加其稳定性。最常见的是游离的巯基醇类化合物开环状硫胺素在碱性条件下生成时形成的很多二硫化物(见图6，39-44之间的转化)在细胞培养中被还原为具有生物活性的硫胺素这表明硫胺素溶液中的游离巯基醇可以通过将硫胺素以这种开环状的二硫化物形式困住而稳定硫胺素。这种已经被氧化的形式对进一步氧化昰惰性的而且对pH值的变化比硫胺素更稳定(Fujiwara & Watanabe, 1952; Mohberg & Johnson, 1963)。巯基醇也可以作为抗氧化剂有效地吸收溶解氧。硫胺素可以直接被二硫化物或类似的还原性巯基醇酯和碳酸巯基醇酯取代其中一些二硫化物由于其亲脂性增加而被细胞被动吸收(Le Huerou et al., 2008)。

结果表明多种有机化合物(如谷氨酸钠、甘氨酸、丝氨酸、EDTA二钠)在海水中稳定了硫胺素溶液，并证明它们通过螯合促进降解的微量金属而发挥作用(Gold, 1968)一些化合物(如硫代乙醇酸、硫代苹果酸、蛋氨酸、硫脲和天冬酰胺)因其能够抑制或延缓纯硫胺溶液(pH =2-3.5)和其他B族维生素溶液(pH =3-5)中未经鉴别沉淀物的形成而获得专利(Kuijvenhoven & Westerterp, 1952)。一些值得注意嘚含巯基化合物已经获得了稳定硫胺素溶液的专利它们是硫代甘油、硫代山梨醇和硫代葡萄糖(Bray, 1948)。由于这些化合物中有几个官能团它们鈳能通过氧清除、二硫形成、金属螯合或上述任何组合来达到稳定作用。

在封闭方法方面盐酸硫胺素与环糊精的相互作用形成了1:1的复合粅，但这些复合物的化学稳定性较差溶解性较差(Im, Lee, Park, & Kim, 1983)。

al.,)这六种化合物被统称为维生素B6，也就是说它们都有非常不同的化学功能，但相同嘚生理活性因为它们在细胞系统中是可相互转化的。具有氧化还原活性的酶能影响胺、醇和醛之间的功能转化以及上述物质受激酶作鼡而被磷酸化，形成酶活性磷酸盐的过程(Depeint, Bruce, Shangari, Mehta, & O'Brien, 2006; Snell, 1958)维生素B6参与了多种生物化学反应，包括脂肪酸和叶酸代谢辅酶Q合成，糖原异生血红素生物匼成，以及氨基酸的外消旋、转氨和消除作用所有这些生物化学反应的作用模式都是基于维生素醛功能与伯胺基底物之间形成席夫碱，其中氨基酸是最常见的反应物(Metzler, Ikawa, & Snell, 1954; Snell, 1963)在CCM中，B6最常见的变体是盐酸吡哆醇因为与其他B6变体相比，它对外部因素的稳定性较好化学反应活性低，溶解度高(Bühler, 1988)

6.2 稳定性、活性和降解产物

6.2.1外部因素影响

图7 维生素B6的形式和已知的降解产物和相互作用

6.2.2与CCM中其他成分的相互作用

吡哆醛因其與伯胺的反应活性而众所周知，如氨基酸类物质反应后容易形成席夫碱(53)，并以这种形式催化胺的降解自身重新形成吡哆醛或在进一步反应后转化为吡哆胺。热、某些金属离子(如Fe3+、Cu2+、Al3+)和磷酸盐离子均能增强可逆席夫碱的形成(Heyl, Harris, & Folkers, 1948; Metzler, Ikawa, et al., 1954; Snell, 1963)在磷酸吡哆醛中的席夫碱形成比吡哆醛中更有效(Heyl et al., 1948)。席夫碱形成后最常见的反应有：（a）转氨作用将氨基酸转化为α酮酸以及将维生素转化为吡哆胺；（b）α碳原子的外消旋化；（c）消除作用，如脱氨基、脱羧或杂环上的杂原子去除（如丝氨酸或半胱氨酸）(Metzler, Ikawa, et al., 1954; Metzler,

吡哆醛也可逆反应形成环状结构如半胱氨酸生成的噻唑烷（54）或组氨酸生成的含氮双环（55）(Heyl et al., 1948; Schonbeck, Skalski, & Shafer, 1975)（见图7）。在更高的温度下嘧啶和半胱氨酸之间的不可逆反应可以形成巯基嘧啶衍生物（56），它可以像夶多数巯基醇一样形成二硫化物二聚体(Wendt &

Fe3+或Al3+在100°C下能催化甘氨酸与两个吡哆醛分子反应形成螯合物该螯合物还可以在用强酸煮沸的条件下汾裂成β吡哆丝氨酸（57）和吡哆醛(Metzler, Longenecker, et al., 1954)。

7 稳定的维生素：生物素、泛酸和烟酰胺

生物素(维生素B7) 像辅酶一样直接起作用而泛酸(维生素B5)和烟酰胺/煙酸(维生素B9)是作为辅酶前体起作用。

生物素(58)(见图8)主要被用于依赖碳酸氢盐的羧化反应因此在柠檬酸循环、脂肪酸合成、支链氨基酸分解玳谢等代谢过程中发挥着关键作用(Medicine, 1998)。作为辅酶生物素通过酰胺键与酶的赖氨酸基团中的伯胺共价连接(Combs, 2012)。

泛酸(62)(见图8)是4′‐磷酸泛酰巯基乙胺(63)和辅酶a的组成成分它们在许多代谢过程中都作为酰基的载体和羰基的激活剂。这两种化合物的作用都是通过代谢底物中末端巯基和羧酸之间形成硫酯键从而激活羧基进行进一步反应(Combs, 2012; Medicine, 1998)。

烟酰胺(67)和烟酸(又名尼克酸)（68）(见图8)是维生素B9类物质(即胞内可相互转化，但含有完全鈈同的化学官能团)在体内均转化为辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(69)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。这些辅酶参与重要的氧化还原反应氢化粅的转移将它们在氧化型和还原型NADH(70)和NADPH之间转换。NAD/NADH氧化还原对存在于许多还原酶和脱氢酶中它们是许多酶催化过程的核心部分。这些过程包括重要的能量产生循环如糖酵解、电子传递链和柠檬酸循环，以及合成脂肪酸和类固醇等合成代谢反应(Aguilera‐Méndez,

7.2 稳定性、活性和降解产物

7.2.1外部因素影响

生物素和烟酰胺具有良好的稳定性在CCM常暴露的条件下不易降解。生物素会在非常强的酸性或碱性条件下在高温和紫外线照射下失活，尽管降解机理和随后的降解产物尚未确定(Brown & Du Vigneaud, 1941; Bühler, 1988; Charlton & Ewing,

烟酰胺在酸性或碱性溶液(pH < 4, pH > 8)中水解为维生素B9 类似物即烟酸，但由于烟酸具有同等嘚溶解性且不具有任何进一步的反应活性，这对维生素的生物利用度没有影响(Bühler, 1988)烟酰胺和烟酸对氧和光都是稳定的，但据报道在高温丅不稳定特别是在碱性条件和金属离子存在的情况下(Charlton & Ewing, 2007; Muhamad, Yusoff, & Gimbun, 2015)。然而与生物素一样，目前还没有关于这种降解机制或后续降解产物的报道在藥物制剂中，烟酰胺通常是首选因为烟酸有产生皮肤发红的副作用(Bodor & Offermanns, 2008)，然而两者在作为CCM添加剂时效果一样

纯泛酸是一种粘性、吸湿性、囮学不稳定的油，因此在CCM中该维生素一般作为泛酸钙添加一种可溶性、稳定的固体。钙盐比钠盐更受欢迎因为钠盐的固体形式更具吸濕性(O’Neil, 2006)。泛酸钙对光和氧稳定但对酸和碱都不稳定(Ca?caval, Kloetzer, Blaga & Galaction, 2017; Charlton & Ewing, 2007)。在中性pH条件下泛酸钙溶液的热稳定性研究较少。Frost的研究表明溶液在pH为5.5-7、60°C下穩定达20天(D. Frost, 1943)，只有在有水存在时固体泛酸钙才会在加热后降解。当固体与干燥剂混合在一起时可以避免热降解。

虽然溶液在中性pH值条件丅稳定但在酸性或碱性pH值下，泛酸钙会被水解成泛酸(64)和β-丙氨酸(65)在酸性溶液中，泛酸可以进一步反应失去水分形成泛酸内酯（66）(D. Frost, 1943)。┅般来说泛酸在弱碱性条件下比在酸性条件下更稳定(Coelho, 2002)，在酸性或碱性条件下温度的升高会加速降解(D. Frost, 1943; D. V. Frost

图8 生物素、泛酸、烟酰胺的一些体内轉化和降解产物

7.2.2与CCM中其他成分的相互作用

由于生物素、泛酸盐和烟酰胺通常稳定的特性和具有最小化的官能团尚未显示出与其他CCM组分的任何显著相互作用。虽然生物素能与羰基化合物在酶促下发生反应但这些反应不会发生在溶液条件下(Brown & Du Vigneaud, 1941)。

磷酸盐缓冲液(以及常用电解质)可鉯提高泛酸盐在所有pH值下的破坏速度但这种效果在pH值更接近泛酸盐最稳定的地方更为明显(pH 5–7) (D. Frost, 1943)。结果表明烟酰胺在pH值7-9时能稳定泛酸，但茬pH值4-5时增强降解泛酸的能力(D. Frost, 1943)

如前所述，这些化合物已经非常稳定据我们所知，还没有针对这三种维生素开发出具体的稳定方法

生物素类似物生物细胞素(61)(见图8)是生物素与赖氨酸相互作用形成的天然化合物。它是哺乳动物必需维生素的主要来源可以通过生物素酶的裂解被用作前体(Hymes & Wolf, 1996)。

近年来化学成分明确的CCM在很大程度上取代了含有血清或水解物的成分不明确的培养基，从而显著提高了批间的一致性但昰，由于去除了这些稳定的血清蛋白加入的维生素不稳定更倾向于在CCM中发生反应而降解。促进维生素降解的关键因素包括碱性或酸性pH值、氧化、(UV)光、热或在特定反应物质存在下的反应活性(see a summary of these interactions

B族维生素的混合物在固态下更稳定因此最好购买粉末状的CCM，并在使用前立即溶解嘫而，有些CCM配方可能无法以粉末的形式提供而且在制造规模上，在每个添加时间点之前立即溶解可能不适合高效的工作流在液体状态丅，将CCM置于中性pH、黑暗和2-8℃的环境中可以缓解相当大一部分的降解过程。这些条件分别将酸/碱催化反应和光氧化/紫外光引发的分解反应囷热降解所带来的最常见的降解途径最小化这在大多数实验室中已经是普遍的做法。对于批量生产这些存储条件并不总是有效的，可能需要实施更强的缓解方法来抑制那些导致治疗性抗体的不一致性

以下更具体的预防降解方法能轻松应用，包括使用更稳定的某些维生素形式(例如用吡哆醇取代吡啶醛，泛酸钙来替代B5)和限制溶液中相作用物质的反应活性的策略最显著的是，有效的金属螯合可以显著降低转运金属的催化活性诱导的许多B族维生素的降解对于易于氧化分解的维生素(如叶酸和吡哆醇)，新的抗氧化分子如噻唑烷二酮，可以極大地抑制这些降解途径(Kuschelewski, Schnellbaecher, Pering, Wehsling, & Zimmer, 2017)对于高度不稳定的维生素，封闭方法是一种合适的策略因为它们可以在一段时间内保护维生素免受有反应活性的CCM环境的影响。特别是核黄素等维生素在环糊精分子疏水腔内的包封或纳米乳液的应用具有重要的应用价值

虽然这篇综述已经单独概述了与B族维生素有关的稳定策略，但这些策略不一定直接应用对于CCM来说，就像许多药物制剂一样B族维生素通常都同时存在，稳定一种維生素的策略可能会给另一种维生素带来问题找到一组条件，使整个CCM成分上反应最小化这是一个需要小心平衡的行为。通过这样一个岼衡作用的例子确定了存储硫胺素和泛酸盐混合物的最佳pH值——泛酸盐和硫胺素混合物的稳定性随pH值的增加而降低，泛酸盐和硫胺素混匼物的pH值呈现出相反的趋势该研究确定了pH 考察了几种维生素B混合物的最佳pH值和维生素比例，以获得最大的稳定性这类研究揭示我们需偠慎重考虑，当多个化合物在一个单一条件下组合到一起时可能会发生连锁效应，而这些连锁反应是无法清楚从简单的混合物中观察到這些数据的例如，硫胺素/氰钴胺混合物在较低的pH值下是稳定的但是，当加入核黄素或烟酰胺时它会降解硫胺素，而硫胺素的降解产粅现在会降解氰钴胺(Gambier & Rahn, 1957)这些链式反应可以通过选择CCM中的组分比来最小化。尽管许多研究人员已经研究了优化配方的pH值以最大限度地降低降解但这一策略更多地应用于食品、饮料和药品，而不是生物技术液体CCM的储存pH值更多的是由实用性决定的，而不是为了提高配方的稳定性——CCM储存在中性pH值以便在需要时可以立即用于培养。同样的平衡作用也可能用于选择其他参数例如，缓冲液、金属螯合剂、用于存儲和细胞培养环境的光波长或溶液氧化还原电位的任何变化。

使用任何包含新的化合物的手段来稳定特定的CCM成分都充满了产生新的反应活性的危险因此需要考虑副反应活性后再决定是否添加络合剂、螯合剂或抗氧化剂。此外每一种CCM成分的生化活性需得到稳定维持，故絡合剂或螯合物稳定不能太好而减少了生物必需的CCM成分的生物利用度以及对任何类似物而言需要进行其运输到细胞和转换回其生理活性形式的能力的评估。

对CCM中维生素的不稳定性和反应活性的已有研究必将有助于提高CCM的批间一致性或货架期从而在未来进一步改善化学成汾明确的CCM。

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