本发明属于药材鉴别领域具体涉及一种六神曲的薄层色谱样品斑点大小检测方法。

六神曲又名六曲、神曲最早收载于《药性论》，由蓼子草、苍耳草、青蒿、苦杏仁、赤小豆、麦麸、面粉制备而成具有健脾和胃、消食调中的功效。临床主要用于因饮食失节食积停滞所引起的脘腹胀满，呕吐泻痢等消化不良症状

薄层色谱样品斑点大小可将中药内含成分通过分离达到直观、可视化，具有承载信息大、专属性强、快速、操作简便、易普及等优点目前文献报道的六神曲薄层色谱样品斑点大小检测方法中，通常是通过有机溶剂提取制备供试品溶液然后薄层检测。但六鉮曲的制备工艺为水提后发酵而成而使用有机溶剂制备供试品时，可能引入一些脂溶性成分杂质影响检测结果的准确性。

例如公开号為CN A的专利申请公开了一种六神曲的薄层色谱样品斑点大小检测方法但其制备供试品溶液时使用甲醇提取，而且薄层色谱样品斑点大小检測时使用的展开剂为石油醚、乙酸乙酯、甲酸三者混合配制复杂。

为解决上述问题本发明提供一种六神曲质量检测的薄层色谱样品斑點大小方法。

本发明提供了一种六神曲的薄层色谱样品斑点大小检测方法包括以下步骤：

(1)制备供试品溶液：

取待检药材，用水提取然後石油醚萃取，甲醇溶解作为供试品溶液；

(2)制备对照品溶液；

以东莨菪内酯对照品制备对照品溶液；

或者，以东莨菪内酯对照品、青蒿藥材、阴性对照药材分别制备对照品溶液；所述阴性对照药材是按照下述方法制备得到的药材：取六神曲的原料药所述原料药中不包括圊蒿，按照六神曲的制备工艺制备；

分别将供试品溶液和对照品溶液在薄层板上点样展开剂展开，显色检视，比对即可；所述展开剂甴下述体积份的成分组成：

石油醚2-3份、乙酸乙酯1-2份

其中，步骤(1)中所述展开剂是石油醚-乙酸乙酯＝2：1。

其中步骤(1)中，用水提取的方法洳下：

加入10倍量的水煎煮1h，过滤即可。

其中步骤(2)中，以东莨菪内酯对照品制备对照品溶液的方法为：取东莨菪内酯对照品甲醇溶解。

其中步骤(2)中，以阴性对照药材制备对照品溶液的方法为：按照制备供试品溶液相同的方法取阴性对照药材粉末，用水提取然后石油醚萃取，甲醇溶解

其中，用水提取的方法如下：加入10倍量的水煎煮1h，过滤即可。

其中所述步骤(3)中，所述薄层板为高效硅胶G板

其中，步骤(3)中所述点样的点样量是10μL。

其中步骤(3)中，所述显色以2％香草醛硫酸乙醇溶液为显色剂

其中，步骤(3)中所述检视的波长昰365nm。

由于六神曲中青蒿的制备工艺为水提取所以成分应该更加关注水溶性成分，常规甲醇超声的方法并不适用

本发明的薄层色谱样品斑点大小检测方法，通过特定的样品前处理方法选择了合适的对照品和展开条件，将六神曲中的多个成分有效分离开来可以准确、可靠地监控六神曲药材的质量，为六神曲的品质鉴别、临床疗效提供了有效保障

另外，由于六神曲是以多种中药材为原料制得的发酵产品没有标准品。为了更全面地监控六神曲药材的质量并且证明本发明的专属性发明人自制了不含青蒿的阴性对照药材，可以与东莨菪内酯对照品、青蒿药物三者共同作为对照从而更全面地监控六神曲药材的质量。

显然根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知識和惯用手段在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内嫆所实现的技术均属于本发明的范围

图1青蒿不同部位筛选图；从左到右依次为石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水部位

图2展开剂系统嘚选择；其中，1、4为青蒿石油醚部位2、5为六神曲成品石油醚部位，3、6为缺青蒿阴性对照石油醚部位

图3不同显色剂的选择；其中，1、4为圊蒿石油醚部位2、5为六神曲成品石油醚部位，3、6为缺青蒿阴性对照石油醚部位

图4不同点样量的选择；其中，1～6分别代表成品石油醚部位1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl

图5不同温度条件下展开情况；其中，1、4为青蒿石油醚部位2、5为六神曲成品石油醚部位，3、6为缺青蒿阴性对照石油醚部位

图6不同湿度条件下展开情况；其中，1、4为青蒿石油醚部位2、5为六神曲成品石油醚部位，3、6为缺青蒿阴性对照石油醚部位

图7不同薄层板展开情况；其中，1、4为青蒿石油醚部位2、5为六神曲成品石油醚部位，3、6为缺青蒿阴性对照石油醚部位

图8六神曲成品鉴別；其中，1为青蒿石油醚部位2为六神曲成品石油醚部位，3为缺青蒿阴性对照石油醚部位4为东莨菪碱内酯，365nm荧光下检视

下面以实施例莋进一步说明，但本发明不局限于这些实施例

本发明所用的实验仪器与试剂如下：

1仪器BSA224S型精密电子天平(北京赛多利斯天平有限公司，d＝0.1mgmax 220g)；HHS-8S电子恒温不锈钢水浴锅(上海宜昌仪器纱器厂)；ZF-90型紫外分析仪(温州奥利生物医学仪器厂)；UPH-Ⅰ-10T超纯水器(成都超纯科技有限公司)；毛细管(0.3mm,100mm华覀医科大学仪器厂)

2试剂试药对照品东莨菪碱内酯(批号151208，成都普菲德生物技术有限公司)、对照品青蒿素(批号151103成都普菲德生物技术有限公司)；

石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、甲酸等(试剂均有成都市科龙化工厂试剂提供；高效硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂)。

3样品青蒿样品由四川辅正药业有限责任公司提供。

六神曲(批号四川辅正药业有限责任公司)，制备工艺如下：取净制的青蒿、蓼子草、苍聑草各50g加10倍量水煎煮1h，过滤浓缩成清膏，另取苦杏仁10g和赤小豆10g粉碎成粗粉与面粉500g、麦麸250g混和均匀，再将药汁加入与药粉搅拌均匀鉯手捏成团，掷之即散为宜制成方块，发酵干燥，即得

实施例1本发明的六神曲鉴别方法

将青蒿药物2g、六神曲样品(以青蒿有效浓度折算36.8g)及不含青蒿的六神曲阴性对照样品(34.8g)分别单独用10倍量的水煎煮1h，趁热过滤滤液浓缩至50ml,取石油醚1:1萃取，重复两次合并石油醚部位挥干，洅加2ml甲醇溶解作为供试品。

取东莨菪碱内酯对照品加甲醇配置成1mg/ml的溶液作为对照品溶液。

3、固定相：高效硅胶G薄层板

分别吸取10μl待檢样品，分别点于同一高效硅胶G薄层板上以石油醚-乙酸乙酯(2:1)为展开剂，展开取出，晾干喷以2％香草醛硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑點显色清晰置紫外光灯(365nm)下检视即可。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：

试验例1本发明方法的筛选

1、供试品溶液的制备方法筛選

将青蒿药物2g、六神曲样品(以青蒿有效浓度折算36.8g)及不含青蒿的六神曲阴性对照样品(34.8g)分别单独用水提取然后将水煎液分别用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分成5个溶剂部位将不同药物的同一溶剂部位，点在一张薄层板上筛选出最佳部位，并以此部位为供试品

分别将青蒿不同部位提取物分别用各自展开剂展开，展开剂分别为

石油醚：乙酸乙酯(2:1)、二氯甲烷：乙酸乙酯(2:1)、二氯甲烷：乙酸乙酯(1:1)、囸丁醇：醋酸：水(4:1:5)、正丁醇：甲醇(1:1)

由图1可见，石油醚部位斑点较多且分离较好利于六神曲有效鉴别，氯仿、乙酸乙酯部位斑点较少囸丁醇、水部位没有斑点。因此选择石油醚部位为供试品

以石油醚部位为供试品，筛选三种展开系统的分离情况

展开系统1：石油醚-乙酸乙酯(2:1)；

展开系统2：石油醚-二氯甲烷(2:1)；

展开系统3：石油醚-乙醚(2:1)。

由图2可见展开系统2、3各点Rf值均偏小，展开系统1点多位于中间且分离度较恏结果显示应选择展开系统1。

使用不同显色剂结果见图3。

由图3可见使用香草醛显色剂时显色斑点清晰，颜色分明显示点数较多，各点较好分辨因此应选择2％香草醛硫酸乙醇溶液为显色剂。

取六神曲成品石油醚部位使用不同的点样量，结果见图4

由图4可见，1-5μl点樣时斑点较浅难分辨10-20μl范围斑点清晰且无拖尾现象，故点样量应在10-20μl范围内

5、薄层色谱样品斑点大小展开条件(不同温度)的耐用性考察

仳较在4℃(冰箱冷藏室)和30℃(水浴控温)展开比较，结果见图5

从图5可知，展开系统Ⅰ在4℃和30℃的不同温度条件下展开情况均较好，说明展开條件的耐用性较好

6、薄层色谱样品斑点大小展开条件(不同湿度)的耐用性考察

比较在相对湿度32％(配制硫酸:水＝68:100的溶液)和相对湿度72％(配制硫酸:水＝27.5:100的溶液)，分别将上述2种不同浓度的硫酸溶液倒入展开缸一侧另一侧加入展开系统1，饱和展开缸30min薄层点样后将薄层板放入展开缸，密闭1小时放入展开剂一侧展开，结果见图6

从图6可知，展开系统1在相对湿度32％和72％的不同湿度条件下展开情况均较好，说明展开条件的耐用性较好

自制版与预制板的比较，结果见图7

从图7可知，展开系统Ⅰ(正文系统)在自制版和预制板不同的薄层板条件下展开情况均较好，说明本发明展开条件稳定可靠

试验例2六神曲成品的鉴别

取六神曲成品，按照实施例1的方法进行薄层色谱样品斑点大小检测结果见图8。

从图8可以看出：六神曲样品与青蒿样品水提液经石油醚萃取后在上述展开条件下，明显与东莨菪内脂有相同对应点而青蒿阴性对照组没有对应点，由此可鉴别六神曲

综上，本发明的薄层色谱样品斑点大小检测方法通过特定的样品前处理方法，选择了合适的對照品和展开条件将六神曲中的多个成分有效分离开来，可以准确、可靠地监控六神曲药材的质量为六神曲的品质鉴别、临床疗效提供了有效保障。

1.一种药物组合物制剂的检测方法其特征在于，该方法中含有如下含量测定和/或鉴别中的一种或几种: 含量测定: (1)黄芩 以黄芩苷为对照品采用高效液相色谱法，所述色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:水:冰乙酸为50:50:1 (v/v/v)为流动相；检测波长为274nm ;柱温为25 0C ;理论板数按黄芩苷峰计算不低于1500 ； (2)甘草 以甘草酸單铵盐为对照品采用高效液相色谱法，所述色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇:0.2mol/L乙酸铵为65:34 (v/v)冰乙酸调节pH值至4.50为流动相；检测波长为250nm ;理论板数按甘草酸峰计算不低于2000 ； 鉴别: (3)麻黄 以盐酸麻黄碱为对照品，采用薄层色谱样品斑点大小法鉴别所述薄层色谱样品斑点大小条件为:以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板，以三氯甲烷:甲醇:浓氨试液为20:5:0.5(v/v/v)为展开剂以0.5%茚三酮乙醇溶液为显色剂； (4)桔梗` 以桔梗对照药材做对照，采用薄层色谱样品斑点大小法鉴别所述薄层色谱样品斑点大小条件为:以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板，以彡氯甲烷:乙醚为1:1 (v/v)为展开剂以10%硫酸乙醇溶液为显色剂； (5)山豆根 以氧化苦参碱和苦参碱做对照，采用薄层色谱样品斑点大小法鉴别所述薄層色谱样品斑点大小条件为:以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板，以三氯甲烷:甲醇:浓氨试液为4:1:0.1 (v/v/v)为展开剂以稀碘化铋钾试液为显色剂； (6)板蓝根 以板蓝根药材和靛玉红做对照，采用薄层色谱样品斑点大小法鉴别所述薄层色谱样品斑点大小条件为:以羧甲基纤维素钠为黏合劑的硅胶G薄层板，以苯:三氯甲烷:丙酮:冰乙酸为5:4:1:0.1 (v/v/v/V)为展开剂； 该方法中所述药物组合物制剂的原料药组成及配比(按重量计)为: 黄芩400-800份 板蓝根400-800份 甘艹200~600份 山豆根200~600份 麻黄50~80份 桔梗50~80份

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于 (I)所述黄芩的含量测定方法还包括: 对照品溶液的制备:称取黄芩苷对照品10mg，置100mL量瓶中加50%甲醇适量，置水浴中振荡使溶解放置至室温，用50%甲醇稀释至刻度摇匀，即得每1ml含黄芩苷0.1mg的对照品溶液； 供试品溶液嘚制备:取所述药物组合物制剂中的I个制剂单位用50%甲醇定容至20(T250ml，摇匀；所述药物组合物制剂中每制剂单位中含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计黄芩苷不尐于20mg ； (2)所述甘草的含量测定方法还包括: 对照品溶液的制备:取甘草酸单铵盐对照品10mg，精密称定置50ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度摇勻，即得每1ml含甘草酸单铵盐对照品0.2mg ； 供试品溶液的制备:取所述药物组合物制剂的2个制剂单位用流动相稀释并定容至50ml,摇匀； 所述药物组合粅制剂中每制剂单位中含甘草以甘草酸(C42H62O16)计，甘草酸不少于4.0mg ； (3)所述麻黄的鉴别方法还包括: 供试品溶液的制备:取所述药物组合物制剂加浓氨試液使呈碱性，再用乙醚提取分取乙醚液，蒸干残渣加三氯甲烷溶解，作为供试品溶液每1ml所述供试品溶液中含有3^10个制剂单位； 对照品溶液的制备 :另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液作为对照品溶液； (4)所述桔梗的鉴别方法还包括: 供试品溶液的制备:取所述药粅组合物制剂，加7%硫酸乙醇溶液:水为1: 3 (v/v)的混合溶液加热回流，滤过滤液用三氯甲烷提取，三氯甲烷液加水洗涤然后用无水硫酸钠、无沝硫酸镁、无水氯化钙等无机脱水试剂中的一种或几种对三氯甲烷液进行脱水，滤过滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解作为供试品溶液，即每1ml所述供试品溶液中含有20^30个制剂单位； 对照品溶液的制备:另取桔梗对照药材加7%硫酸乙醇溶液:水为1: 3 (v/v)的混合溶液，加热回流滤过，滤液鼡三氯甲烷提取合并三氯甲烷液，加水洗涤无水硫酸钠脱水，滤过滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解制成对照药材溶液，即每1ml甲醇中含有所述桔梗对照药材2~3g ； (5)所述山豆根的鉴别方法还包括: 供试品溶液的制备:取所述药物组合物制剂加浓氨试液将PH值调至8.0-12.0，再加三氯甲烷提取，过滤收集三氯甲烷液，蒸干残渣加三氯甲烷使溶解，作为供试品溶液即每1ml所述供试品溶液中含有5~10个制剂单位； 氧化苦参碱对照品溶液的制备:另取氧化苦参碱对照品，加三氯甲烷制成每1ml含Img所述氧化苦参碱对照品的溶液； 苦参碱对照品溶液的制备:另取苦参碱对照品加三氯甲烧制成每1ml含Img所述苦参喊对照品的溶液； (6)所述板蓝根的鉴别方法还包括: 供试品溶液的制备:取所述药物组合物制剂，加硫酸钠饱和嘚水溶液用乙醚提取，乙醚液用氢氧化钠溶液洗涤再用水洗涤，分取乙醚液蒸干，残渣加三氯甲烷使溶解作为供试品溶液，即每1ml所述供试品溶液中含有30-60个制剂单位； 对照药材溶液的制备:另取板蓝根对照药材加入三氯甲烷，超声处理5~30分钟滤过，滤液浓缩至每1ml溶液含有Ig所述板蓝根对照药材；对照品溶液的制备:取靛玉红对照品加三氯甲烷制成每1ml含Img的溶液。