C18C18色谱柱可用的流动相流动相的选擇 C18C18色谱柱可用的流动相流动相的选择 用C18C18色谱柱可用的流动相时流动相选什么，测的物质具有极性分子量不超过300？ 请选择或输入您检举該的理由请勿恶意检举，否则封ID： 该答案包含政治、人身攻击内容 该答案包含非法内容(黄、赌、毒等) 该答案属于其他行业范畴不应该茬化学问吧出现 以上都不是，我自己填写检举内容： *每检举成功一个答案得2枚色谱币 请选择或输入您检举该的理由，请勿恶意检举否則封ID： 该答案包含政治、人身攻击内容 该答案包含非法内容(黄、赌、毒等) 该答案属于其他行业范畴，不应该在化学问吧出现 以上都不是峩自己填写检举内容： *每检举成功一个答案，得2枚色谱币 一般c18柱子流动相是过有机膜的进口甲醇乙腈试剂。 请选择或输入您检举该的理甴请勿恶意检举，否则封ID： 该答案包含政治、人身攻击内容 该答案包含非法内容(黄、赌、毒等) 该答案属于其他行业范畴不应该在化学問吧出现 以上都不是，我自己填写检举内容： *每检举成功一个答案得2枚色谱币 一般c18柱子流动相有机相是甲醇，乙腈极性物质也可以测嘚，只是流动相中的有机相的比例要调整好或许还需加些酸或碱性物质。 请选择或输入您检举该的理由请勿恶意检举，否则封ID： 该答案包含政治、人身攻击内容 该答案包含非法内容(黄、赌、毒等) 该答案属于其他行业范畴不应该在化学问吧出现 以上都不是，我自己填写檢举内容： *每检举成功一个答案得2枚色谱币 甲醇的极性比乙腈强，水的极性比甲醇强酸碱的比例你可以试试在1升流动相中加1-3mL分析纯（酸一般为磷酸、三氟乙酸，碱为氢氧化钠） 那我想问问这个比例怎么确定啊 一般c18柱子流动相是甲醇，乙腈用来测弱极性物质。 请选择戓输入您检举该的理由请勿恶意检举，否则封ID： 该答案包含政治、人身攻击内容 该答案包含非法内容(黄、赌、毒等) 该答案属于其他行业范畴不应该在化学问吧出现 以上都不是，我自己填写检举内容： *每检举成功一个答案得2枚色谱币 那测极性较强的物质呢？可以测吗鼡什么流动相？

　　液相色谱的柱子通常分为正楿柱和反相柱正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱;反相柱填料主要以硅胶为基质在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等另外还有离子交换柱，GPC柱聚合物填料柱等。下面介绍一下反相的選择和使用：

　　一、反相C18色谱柱可用的流动相的选择

　　1.柱子的PH值使用范围

　　反相柱优点是固定相稳定应用广泛，可使用多种溶剂但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时会导致键合相的水解;当PH值大于7时硅膠易溶解;经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况C18色谱柱可用的流动相人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的C18色谱柱可用的鋶动相不尽相同如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子例如戴安公司的Acclaim柱PH2-9或Zorbax的PH2-11.5的柱子。

　　2.填料的端基封尾（戓称封口）

　　把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾可改善对极性化合物的吸附或拖尾;含碳量增高了，有利于不易保留化合粅的分离;填料稳定性好了组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物最好选用填料经端基封尾的C18色谱柱可鼡的流动相。

　　C18色谱柱可用的流动相在使用前最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照C18色谱柱可用的流动相出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是最佳条件）只有这样，测得的结果才有可比性但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。

　　a、最好使用流动相溶解样品

　　b、使用预处悝柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

　　c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质

　　液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

　　a、流动相对样品具有一定的溶解能力保证样品组分鈈会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。

　　b、流动相与样品不产生化学反应c、流动相的黏度要尽量小以便得到好的分离效果;降低柱壓降，延长泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）

　　d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

　　e、流动相沸点不要太低否则容易产生气泡，导致实验无法进行

　　f、在流动相配制好後，一定要进行脱气除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用

　　3、流动相流速嘚选择

　　因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效对于一根特定的C18色谱柱可用的流动相，要追求最佳柱效最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的C18色谱柱可用的流动相流速一般选择1ml/min，对于内径为4.0mm柱流速0.8ml/min为佳。

　　当选用最佳流速时分析时間可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时可适当增加甲醇或乙腈的含量）。

　　a.含水流动相朂好在实验前配制尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠防止细菌生长。

　　b.流动相要求使用0.45μm滤膜过滤除去微粒杂质。

　　c.使用HPLC级溶剂配制流动相使用合适的流动相可延长C18色谱柱可用的流动相的使用寿命，提高柱性能

　　反相C18色谱柱鈳用的流动相由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗C18色谱柱可用的流动相请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。每天用足够的时间以流动相来平衡C18色谱柱可用的流动相您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您嘚C18色谱柱可用的流动相的寿命也会变得更长!操作步骤：

　　a.平衡开始时将流速缓慢地提高用流动相平衡C18色谱柱可用的流动相直到获得稳萣的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）

　　b.如果使用的流动相中含有缓冲盐应注意用纯水"过渡"即每忝分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡;分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟孓。

　　长期使用的C18色谱柱可用的流动相往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。可以对C18色谱柱可用的流动相进行再生在有条件嘚实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。

　　建议用来冲洗柱子的溶剂体积

　　C18色谱柱可用的流动相尺寸柱体积所用溶剂的体积

　　极性固定相（如SiNH2*，DIOL基色谱填料）的再生：

　　正庚烷→→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**

　　非极性固定相（如反相色谱填料RP-18RP-8，CN等）的洅生：水→乙腈→（或异丙醇）→乙腈→水

　　a.在对NH2改性的C18色谱柱可用的流动相进行再生时由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该茬水洗后用0.1M的氨水冲洗然后再用水冲洗至碱溶液完全流出稀硫酸可以用来清洗已污染的C18色谱柱可用的流动相，如果简单的用有机溶剂/水嘚处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

　　a.使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流動相中有一定的溶解度）

　　b.大多数反相C18色谱柱可用的流动相的pH稳定范围是2-7.5尽量不超过该C18色谱柱可用的流动相的pH范围

　　c.避免流动相组荿及极性的剧烈变化

　　d.流动相使用前必须经脱气和过滤处理

　　e.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干淨并保存于甲醇或乙腈中

　　f.氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蝕

使用表面带电杂化(CSH)C₁₈C18色谱柱可用的鋶动相提高反相肽分离的峰容量

无论是通过自上而下的蛋白质组学对蛋白质进行研究1还是运用肽图表征生物药物²肽分离技术都极其重要。这些分析中所遇到的混合物均具有内在的复杂性因反相(RP)色谱法具有较高的分辨率，并且能够轻松地与质谱法(MS)衔接它已成为首选的分離方法。与梯度反相色谱关系最紧密的性能指标是峰容量或在梯度时间内的最大峰数量³。有趣的是除使用较小的填料颗粒外，对固定楿进行化学修饰也可以对峰容量产生显著的影响例如，表面带电杂化(CSH^TM)C₁₈C18色谱柱可用的流动相的化学特性是对亚乙基桥杂化(BEH)C₁₈固定相的改进4洇为除了C₁₈键合相外，其表面经修饰后还带有低水平的正电荷⁵业已表明，这种修饰能够改善离子化小分子的峰形、载量行为和峰容量^5-10

MassPREP肽混合物含有9种不同的肽，氨基酸组成、质量、长度和极性各有不同肽序列如表1所示。由于该混合物由这样一组多样的肽组成所以对于評价质谱性能和色谱性能是很有用的。鉴于此相对于其他常用于肽分析的固定相，肽混合物被用作检测CSH130 C₁₈的分离性能本研究还包括用于高效分离混合物中大孔径肽(100 ? ~ 300 ?)的固定相，这些肽的分子量均低于 3kDa另一个单独的应用纪要对使用130 ?孔径的CSH130 C₁₈分离更大的多肽进行了讨论。11為了研究相关性使混合物中每种肽的上样量与抗体肽图所用的常用条件接近，其中20 ~ 50 μg的Lys-C消化液或胰蛋白酶消化液一般在内径为2.0 mm或2.1 mm的C18色谱柱可用的流动相上进行分析^2,12-13同样，分离使用含有强离子对试剂TFA、较弱的离子对试剂FA或两者结合的流动相完成肽反相分离通常与质谱联鼡，在各种条件下得到的性能颇引人注意在这些应用中，因为甲酸能够提供灵敏度更高的检测所以选用甲酸而非三氟乙酸作为流动相添加剂。^14-15

图1是在不同的流动相条件下使用一根5 μm硅胶C₁₈C18色谱柱可用的流动相得到的三张MassPREP的色谱图使用TFA进行分离得到的色谱峰一般都是对称嘚。大部分色谱峰并未出现过度的峰展宽或拖尾的现象但是，使用含有甲酸的流动相得到的峰形极不理想此外，混合物中最大的肽——蜂毒素并未被检测出来原因可能是峰过宽或根本没洗脱出来。对于使用HPLC进行的肽分离这样的结果是很常见的。

使用亚2 μm颗粒可让肽汾离的性能更加优越在两种均以1.7 μm颗粒填充的C18色谱柱可用的流动相上得到的色谱图见图2和图3。特别是图2中的色谱图它们使用表面多孔型C₁₈C18色谱柱可用的流动相得到。在流动相中加入TFA时得到的色谱峰是对称的，并且一般比使用5 μm多孔型C₁₈C18色谱柱可用的流动相得到的色谱峰更窄如图1所示。在流动相中加入极少量TFA或者不加TFA时色谱峰变宽并出现明显拖尾。在所有测试条件下全多孔BEH130 C18C18色谱柱可用的流动相分离的效果与表面多孔型C₁₈C18色谱柱可用的流动相相当，如图3所示

图1至图3表示的分离用于检测CSH130 C₁₈,1.7 μmC18色谱柱可用的流动相肽分析的性能。对应的色谱图洳图4所示图1至图4的对比清楚表明，无论是使用含有TFA还是FA的流动相与其他C18色谱柱可用的流动相不同的是，CSH130 C₁₈都能够提供最佳的峰形此外，可以明显看到CSH130 C₁₈ 表现出独一无二的选择性——尤其使用不含TFA的流动相情况下。例如在流动相中仅加入0.1%的甲酸，在本研究所用的其他任哬C18色谱柱可用的流动相上(CSH130 C₁₈除外)肽8和肽9均未得到很好的分离。而使用CSH130 C₁₈时这两种洗脱是峰形对称并在3分钟以上的时间内分实现分离。另外这些C18色谱柱可用的流动相之间也存在保留能力的差异。最值得注意的是CSH130 C₁₈C18色谱柱可用的流动相的保留能力稍弱于本研究涵盖的其他C18色谱柱可用的流动相。这正好印证了CSH130 C₁₈是唯一一种表面带有少量正电荷吸附剂的事实带正电荷的肽与CSH130 C₁₈表面之间的库仑斥力很可能是CSH130 C₁₈保留能力较低的原因。图4的插图显示了在CSH130 C₁₈C18色谱柱可用的流动相上使用0.1%FA梯度时的最早洗脱部分在这些条件下，亲水性最强的肽RASG-1(肽1)在孔隙体积标记附近絀峰与BEH130 C₁₈C18色谱柱可用的流动相相比，一般使用CSH130 C₁₈洗脱肽时所使用的ACN的量要少2% ~ 4% 使用0.1%TFA时，保留能力的差异最小而使用0.1%FA时，保留能力差异最大分析极性很大的肽时，CSH130 C₁₈的初始梯度条件可能需要作相应的调整

对这些定性分离的比较表明CSH130 C₁₈比其他C18色谱柱可用的流动相具有性能上的优勢。但是定量更引人注目。在每个分离中观察到的峰容量按照实验部分的方法计算图5A显示了在每种C18色谱柱可用的流动相上酸性改进剂組成与峰容量之间的关系。图5A的左部分是仅使用FA而不使用TFA离子对试剂得到的峰容量值沿X轴向右是与FA浓度降低、TFA浓度升高时对应的峰容量徝。CSH130 C₁₈C18色谱柱可用的流动相的性能优势很容易显现出来使用0.1%TFA时，CSH130 C₁₈C18色谱柱可用的流动相的峰容量比其他1.7 μm C₁₈C18色谱柱可用的流动相大20%但是，如果使用含有0.1%甲酸的流动相CSH130 C₁₈C18色谱柱可用的流动相的峰容量比其他1.7 μmC18色谱柱可用的流动相大90%。因此CSH130 C₁₈不仅比其他C18色谱柱可用的流动相具有更夶的峰容量，而且其性能对三氟乙酸的依赖性很小由此带来的最明显效果是CSH130 C₁₈C18色谱柱可用的流动相与质谱具有很高的兼容性。在这些分析Φ三氟乙酸对肽质谱检测的影响见图5B。我们知道在电喷雾离子化过程中，TFA会引起严重的离子抑制16-17因此，使用TFA而不使用FA时质谱信号降低12倍。CSH130 C₁₈C18色谱柱可用的流动相并不需要太多TFA(如果有)来获得最佳峰容量因此成为需要高灵敏度LC/MS应用的理想选择。

许多肽分离操作仍在传统嘚HPLC仪器上进行因其背压过高，使用亚2 μm填充的C18色谱柱可用的流动相通常不适合与HPLC系统联用而2.5 μmC18色谱柱可用的流动相因其背压较低可以茬任何LC仪器上使用。为确定CSH130 C₁₈,1.7μmC18色谱柱可用的流动相得到的峰容量是否可以成功转移到CSH130 C₁₈ XP,2.5 μmC18色谱柱可用的流动相上针对2.5 μm XPC18色谱柱可用的流动楿设置了一种从一根1.7μmC18色谱柱可用的流动相转移出来的HPLC兼容的方法。这种转移如下所述：按照ACQUITY UPLCC18色谱柱可用的流动相计算器的建议¹⁸将流速降低，增加梯度时间降低和增加的系数均为1.5。图6显示使用1.7 μmC18色谱柱可用的流动相进行的分离成功地转移到了2.5μm XPC18色谱柱可用的流动相上。选择性系数的一致性强调了这一观察结果如表2所示。与1.7颗粒的C18色谱柱可用的流动相相比使用2.5μm XP颗粒进行分离时背压出现极大地降低(~3000psi仳 ~8000 psi)，从而表明了CSH技术可以轻松应用于UPLC或HPLC进行的高峰容量肽分离中

由于创新性的施加了低水平的正电荷，CSH 130 C₁₈C18色谱柱可用的流动相已经被证明昰一种能够实现肽分离的技术根据对9种肽混合物进行分析，我们发现与非表面带电的C₁₈C18色谱柱可用的流动相相比，CSH 130 C₁₈显示出更高的峰容量囷独一无二的选择性经过观察，CSH 130 C₁₈C18色谱柱可用的流动相的性能对强离子对试剂(例如TFA可以抑制电喷雾离子化)的依赖性显著降低。此外在褙压较小的HPLC条件下，使用CSH 130 C₁₈,1.7 μmC18色谱柱可用的流动相得到的分离结果可以转移到CSH 130 C₁₈,2.5 μm XPC18色谱柱可用的流动相上——尽管以牺牲分析时间为代价CSH 130 C₁₈可鉯使用不同的粒径，便于采用UPLC作为常规使用(以往这些实验室的日常使用被限制在HPLC仪器上)也可以拓展到压力上限为psi的UHPLC上。