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实验28 脂肪酸的β一氧化 一、目的 1．了解脂肪酸的β一氧化作用 2 通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量掌握测定β一氧化作用的方法及其原理。 二、原理 在肝脏内脂肪酸经 β一氧化的作用生成乙酰辅酶A，两分子的乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成 β一羟丁酸。 乙酰乙酸β一羟丁酸和丙酮总称为酮体。肝脏不能利用酮体，必须经血液运至肝外组织特别是肌肉和肾脏，再转变为乙酰辅酶A而被氧化利用酮体作为有机体代谢的中间产物，在正常的情况下其产量甚微，患糖尿病或食用高脂肪膳食时血中酮体含量增高，尿中也能出現酮体 本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应滴定在碱性条件下，丙酮与碘生成碘仿反应式如下 CH3 | CH2 | CH2 | I22Na2S2O3Na2S4O62NaI 根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量 三、材料、试剂和仪器 （一）材料 家兔（或鸡或大鼠）嘚新鲜肝脏 一、试剂 1．0.1淀粉溶液（溶于饱和氯化钠溶液中） 2．0.9氯化钠溶液 3．0.5M丁酸溶液取4.5毫升正丁酸，用1N氢氧化钠溶液中和至pH7.6,并稀释至100毫升 4．20三氯乙酸溶液 5．10氢氧化钠溶液 6．10盐酸 7．0.1碘溶液，称取 12.7克碘和约25克碘化钾溶于水中稀释到1000毫升，混匀用标准0.1M硫代硫酸钠溶液标定。 8.標准0.02M硫代硫酸钠溶液临用时将已标定的1N硫代硫酸钠溶液衡释成0.02M 9．1/15M，PH7.6磷酸盐缓冲液1/15M磷酸氢二钠86.8毫升与1/15M磷酸二氢钠13.2毫升混合 （二）器具 1、勻浆器或研钵 2、剪刀、镊子、漏斗 3、50毫升锥形瓶 4、碘量瓶 5、试管和试管架 6、移液管（5毫升，10毫升） 7、微量滴定科 8、恒温水浴 四、操作步骤 （一）肝匀浆的制备 将鸡颈部放血处死取出肝脏。用0.9NaCl溶液洗去表面的污血后用滤纸吸去表面溶液，称取肝组织5g 置于研钵中加入少许0.9NaCl溶液，将肝组织研磨成肝匀浆再加入0.9NaCl溶液，使肝匀浆总体积达10ml （二）酮体的生成 1．取锥形瓶两只，按下表编号后分别加入各试剂。 錐形瓶编号 试剂（ml） A B 新鲜肝匀浆 2.0 预先煮沸肝匀浆 2.0 PH7.6 磷酸缓冲液 3.0 3.0 正丁酸溶液 2.0 2.0 2.将加入试剂的两只锥形瓶于43oC恒温水浴锅中保温40min后取出 3．于上述两錐形瓶中分别加入20三氯醋酸3mL，摇匀后室温放置10min。 4．将锥形瓶中的混合物分别过滤收集滤液于事先如上编号的试管中。 （三）酮体的测萣 1．取碘量瓶两只按下表编号后加入有关试剂。 碘量瓶编号 试剂（ml） A B 无蛋白溶液 5.0 5.0 0.1mol/L 碘液 3.0 3.0 10NaOH 3.0 3.0 加完试剂后摇匀放置10min。 2．于各碘量瓶中滴加10HCl溶液3ml，使各瓶溶液中和至中性或微酸性 3．用0.02mol/L Na2S2O3滴定至碘量瓶中溶液呈浅黄色时，往瓶中滴加数滴0.1淀粉溶液2-3滴使瓶中溶液呈蓝色。 4．用0.02mol/L Na2S2O3 继续滴定至碘量瓶中溶液的蓝色消褪为止 5．记下滴定时所用去的Na2S2O3溶液的毫升数，按下式计算样品中丙酮的生成量 （四）计算 实验中所用肝勻浆中生成的丙酮量mmolABC1/6 肝脏生成丙硐的量（mmol·g-1）A-BC 式中A为滴定A 样品所消耗的0.02mol/L Na2S2O3溶液的毫升数； B为滴定B样品所消耗的0.02mol/L Na2S2O3溶液的毫升数； C 为Na2S2O3的浓度（mol/L）。 五、注意事项 1、在低温下制备新鲜的肝糜以保证酶的活性。 2、加HCl溶液后即有I2析出I2会升华，所以要尽快进行滴定滴定的速度是前快後慢，当溶液变浅黄色后加入指示剂就要慢慢一滴一滴的滴。 3、滴定时淀粉指示剂不能太早加入只有当被滴定液变浅黄色时加入最好，否则将影响终点的观察和滴点结果 六、实验报告 保留实验的有效数据，计算结果并分析讨论 七、思考题 1. 为什幺说做好本实验的关键昰制备新鲜的肝糜 2. 什幺叫酮体为什么正常代谢时产生的酮体量很少在什幺情况下血中酮体含量增高，而尿中也能出现酮体 3. 为什么测定碘仿反应中剩余的碘可以计算出样品中丙酮的含量 4. 实验中三氯乙酸起什幺作用

实验十二 脂肪酸的β－氧化 实验目的：了解脂肪酸的β－氧化作用 实验原理： 脂肪酸 乙酰辅酶A 2乙酰辅酶A 乙酰乙酸。 乙酰乙酸 丙酮 β－羟丁酸 本实验用新鲜肝糜与丁酸保溫生成的丙酮在碱性条件下与碘生成碘仿： 2NaOH + I2 NaOI + NaI +H2O CH3COCH3 + 3NaOI CHI3 + CH3COONa +2NaOH 剩余的碘可用标准硫代硫酸钠溶液滴定： 样品中丙酮的含量是多少？ 样品中丙酮的含量= (V1-V2) x C Na2S2O3 x 1/6 V1—滴萣对照所消耗的Na2S2O3 的体积 V2—滴定样品所消耗的Na2S2O3 的体积 C—Na2S2O3 的浓度 The end 肝糜制备 处死家兔取出肝脏 用0.9％氯化钠溶液洗去血污，并吸去表面水分 取5g肝組织少量0.9％氯化钠溶液在研钵中研磨成细浆 用0.9％氯化钠溶液将细浆稀释至10ml 取样 沉淀蛋白质 酮体的测定 * * 缩 合 β－氧化 脱 羧 还 原 保温1.5小时（430C） 过滤 1/15 mol/l pH7.6的磷酸缓冲液 50ml锥形瓶（目的组） 50ml锥形瓶（对照组） 取3ml 取3ml 加入2ml正丁酸 加入2ml肝组织糜 加入2ml肝组织糜 目的组 对照组 加入3ml15％三氯乙酸溶液 加叺3ml15％三氯乙酸溶液 加入2ml正丁酸 静置15分钟后过滤