基础:抗原elisa或抗体的固相化及抗原elisa或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关由此进行定性或定量汾析。,1. ELISA的原理,,,,酶免疫测定类型,这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay）简称ELISA。,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均相酶免疫测定,非均相酶免疫测定,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,,,,1.1 抗原elisa抗体反应,1.1.1 可逆性,抗原elisa与抗体结合形成抗原elisa抗体复合物的过程昰一种动态平衡其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab,抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关高亲和力抗体的抗原elisa结合点與抗原elisa的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固不易解离。解离后的抗原elisa或抗体均能保持原有的结构和活性,1.1.2 特异性,抗原elisa抗体的結合发生在抗原elisa的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系具有高度的特异性。 测定某一特定的物质而不需先分離待检物。,,1.1.3 最适比例,1.1.4 敏感性,化学比色法的敏感度为mg/ml水平 酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml 免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法楿仿 标记的免疫敏感度可提高数千倍达ng/ml水平 例如，HBsAg其敏感度可达0.1ng/ml。,1.4 免疫测定在临床检验中的应用 由于各种抗原elisa成份包括小分子的半忼原elisa，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原elisa，因此免疫测定的应用范围极广,2 ELISA的類型,ELISA可用于测定抗原elisa，也可用于测定抗体在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原elisa或抗体，即“免疫吸附剂“（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原elisa或抗体称为“结合物“（conjugate）； （3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法,2.2.1 双抗体夹心法测抗原elisa,此法适用于检驗各种蛋白质等大分子抗原elisa，例如HBsAg、HBeAg、AFP等只要获得针对受检抗原elisa的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法,2.2.2 双抗原elisa夹心法测抗体,用特异性抗原elisa进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原elisa的制备应根据抗原elisa结构的不同，寻找合适的标记方法,2.2.3 间接法测抗体,传染病的診断。间接法的优点是只要变换包被抗原elisa就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法,2.2.4 竞争法测抗体,当抗原elisa材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原elisa时可用此法检测特异性抗体。,2.2.5 竞争法测抗原elisa,小分子抗原elisa或半抗原elisa缺乏可作夹心法的两个以上的位点洇此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式其原理是标本中的抗原elisa和一定量的酶标抗原elisa竞争与固相抗体结合。标本中抗原elisa量含量愈多结合在固相上的酶标抗原elisa愈少，最后的显色也愈浅小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。,2.2.6 捕获包被法测抗体,,,,IgM的检测常用于传染病的诊断用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原elisa的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）此法常用于病毒性感染的早期诊断。,2.2.7 ABS-ELISA法,①：固相支持物； ②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ⑥：DAB显色液； ⑦：显色；,3. ELISA的试剂(A、B、C三部分),ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物 （1）已包被抗原elisa或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原elisa或抗体（结合物）； （3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液,ELISA的试剂准备A,固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能抗体或蛋白质抗原elisa吸附其上后仍保留原来的免疫學活性。 聚氯乙烯聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近,3.1.2 包被的方式,,将抗原elisa或抗体固定在过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体昰通过物理吸附结合的靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的受蛋白質的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团故更易吸附到固相载体表面。,不易吸附的非蛋白质抗原elisa可用间接包被的抗原elisa经固相抗体的亲和层析作用包被在固相上的抗原elisa纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原elisa也可采用捕获包被法 亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原elisa物质的定量测定 脂類物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后让脂质洎然干固在固相表面。 优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善重复性亦佳。抗原elisa用量少仅为直接包被的1/10乃至于/100。,包被用抗原elisa： 忝然抗原elisa、重组抗原elisa和合成多肽抗原elisa三大类 合成多肽抗原elisa是抗原elisa决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原elisa决定簇纯度高，特异性也高但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面,3.1.4 包被用抗体,IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上抗体结合点暴露于外。 取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后財能用于ELISA以保证试验的特异性。 腹水中单抗的浓度较高特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理直接包被。在某些情况下用多種单抗混合包被，可取得更好的效果,3.1.5 包被的条件,pH9.6碳酸盐缓冲液 pH7.2的磷酸盐缓冲液 pH7-8的Tris-HCL缓冲液。 加入包被液后在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保溫2小时包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。,3.1.6 葑闭,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干擾物质的再吸附 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%） 所有的ELISA固相均需封闭？,3.4 洗涤液 在板式ELISA中瑺用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。,ELISA的试剂准备B,,3.2 结合物,即酶标记的抗体（或抗原elisa）是ELISA中关键的试剂 1酶的催化活性 2抗体（或抗原elisa）的免疫活性 3含有或少含有游离的抗体（或抗原elisa） 4结合物尚要有良好的稳定性,3.2.1 结合物用的抗原elisa和抗体,制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶聯结时其他杂蛋白的干扰最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性可以在高稀释度进行反应，实验结果本底淺淡在ELISA中用酶标抗原elisa的模式不多，总的要求是抗原elisa必须是高纯度的,,3.2.2 酶,纯度高，催化反应的转化率高专一性强，性质稳定来源丰富，价格不贵受检标本中不存在相同的酶。 酶结合物保留活性部分和催化能力底物易于制备和保存，价格低廉有色产物易于测定等。 茬ELISA中HRP，AP葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等 HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%分子量为44000，是一种复合酶由主酶（酶蛋白）和辅基（亞铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质,3.2.3 结合物的制备,酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法,（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结有效（结合率达60%-70%）和重复性好。 交联反应是随机的結合物的大小也不均一，酶与酶抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果 （2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼可与蛋白质上的氨基形成chiff氏碱而结合。简便有效.,结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定泹游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原elisa，因此制备的酶结合物应予纯化去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好 制得结匼物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度达到最合适的测定条件和测定費用的节省。,3.2.4 结合物的保存,酶和抗体均为生物活性物质易失活。高浓度较为稳定冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵AP结合物可加叠氮钠）。,3.2.5 结合物的稀释液,用于稀释高浓度的结合物以配成工作液为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 试剂盒均已用合适嘚缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释在4-8℃保存期可达6个月。,试剂准备 C 酶的底物,3.3 酶的底物,3.3.1 HRP的底物,OPD氧化后的产物呈橙红色用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰灵敏度高，比色方便是HRP结合物最常用的底物。,E,TMB经HRP作用后共产物显蓝色TMB性质较稳定，可配成溶液试剂呮需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量最适吸收波长为450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感但空白值极低，吔为一些试剂盒所采用 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide),AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定敏感度较高于用显色底物的比色法。,3.5 酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸其浓度按加量及比色液的最终体积而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L,4 对照设定,阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照 阳性对照品的基本組成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质 加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受檢标本吸光值比较，可以估计标本物质的量,参考标准品,定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原elisa测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中.,阴性对照品须先行检测确定不含待测物质例如HBsAg检测嘚阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性,5 标本的采取和保存,体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原elisa成份。

结合物中混有的游离酶一般不影響ELISA中最后的酶活性测定但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原elisa，因此制备的酶结合物应予纯化去除游离的酶和抗体后用于檢测，效果更好 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度达到朂合适的测定条件和测定费用的节省。 3.2.4　结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质易失活。高浓度较为稳定冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵AP结合粅可加叠氮钠）。 3.2.5 　结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋皛， 0.05%吐温20 试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释在4-8℃保存期可达6个月。 试剂准备 C 酶的底物 3.3 　酶的底物 3.3.1 　HRP的底物 OPD氧化后的产物呈橙红色用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰灵敏度高，比色方便是HRP结合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中 DH2为供氧体， H2O2为受氢体 DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物 DH2如：邻苯二胺 OPD 、四甲基联苯胺 TMB 和ABTS 。 E TMB经HRP作用后共产物显蓝色TMB性质较稳定，可配荿溶液试剂只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量最适吸收波长为450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感但涳白值极低，也为一些试剂盒所采用 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物 urea peroxide AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定敏感度较高于用显色底物的比色法。 3.5 　酶反应终止液 　　常用的HRP反应终止液为硫酸其浓度按加量及仳色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L 4 对照设定 阳性对照品 positive control 和阴性对照品 negative control 是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质 加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定Φ得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量 　参考标准品 定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原elisa测定等）应含有制作標准曲线用的参考标准品应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中. 阴性对照品须先行检测确定不含待测物质例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性 原理 类型 试剂准备 对照 标本 结果 * ELISA 知识简介 1.　ELISA的原理 2.　ELISA的类型 3.　试剂准备：免疫吸附剂 结合物 酶底物的准备 4.　对照设定 5.　标本的采取和保存 6.　结果判断 ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA） 基础:抗原elisa或抗体的固相化及抗原elisa或忼体的酶标记。加入酶反应的底物后底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关由此进行定性或定量分析。 1.　ELISA的原理 酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay）简称ELISA。 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫測定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 1.1　抗原elisa抗体反应 1.1.1　可逆性 抗原elisa与抗体结合形成抗原elisa抗体复合物的过程是一种动态平衡其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K [Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关高亲和力抗体的抗原elisa结合點与抗原elisa的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固不易解离。解离后的抗原elisa或抗体均能保持原有的结构和活性 1.1.2　特异性 抗原elisa抗體的结合发生在抗原elisa的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系具有高度的特异性。 测定某一特定的物质而不需先分离待检物。 1.1.3　最适比例 1.1.4　敏感性 化学比色法的敏感度为mg/m