1. 肉眼及显微镜观察确保细胞冻存原理满足冷冻标准。

2.使细胞冻存原理生长至对数生长晚期若为贴壁细胞冻存原理，用胰酶消化并进行细胞冻存原理技数。若为悬浮苼长细胞冻存原理进行细胞冻存原理计数并离心。

4.将以下任意一种细胞冻存原理保护剂加入到生长培养基中配制冻存液：

5. 用冻存液将細胞冻存原理悬液按1：1的比例稀释至细胞冻存原理度浓约为1×106 ~1×107 /ml ,此时DMSO的浓度为5%-10%（或甘油浓度为10-15%）。建议勿将冻存管置于冰上减少细胞冻存原理退化。使用DMSO时室温操作30min是无害的，当使用甘油时则对细胞冻存原理是有益的。

6. 将细胞冻存原理悬液分装至预先标记好的冻存管Φ盖上盖子，拧紧密封，注意不要太紧避免螺旋扭曲变形。

7. 将冻存管夹在铝条上装入储存筒中，或将其松散地排列在抽屉储存器Φ

8. 将冻存管通过上述方法之一以1℃/min的速率进行冷冻。使用隔热保温的方法使冻存管达到-70℃，若最初温度为20℃则需4~6h，但最好于-70℃过夜

9.当冻存管温度达到-70℃或更低时，在将其从-70℃或能控制冷冻速率的冷冻柜中转移出来之前检查冷冻记录，确定液氮罐中存放冻存管的合適位置

10. 将冻存管转移至液氮冷冻罐中，最好不要使其浸没在液氮中将放油冻存管的铝条和纸质管放入预先确定的储存筒中，或将个别凍存管放入预先确定的抽屉中该步骤必须迅速（＜2min），因为冻存管会以越10℃/min的速度升温如果温度上升超过-50℃，细胞冻存原理会迅速恶囮