八月七日在国际学术期刊《Nucleic Acids Research》发表的一项研究中来自美国国立卫生研究院的研究人员，提出了一种简单、快速和具有成本效益的荧光PCR为基础嘚方法――CRISPR Somatic Tissue Activity Test (CRISPR-STAT)来确定sgRNA的靶向特异性效率。

生物通报道：CRISPR/Cas9已经成为一种通用的基因组工程工具依赖于一个单导向RNA（sgRNA）和Cas9酶进行基因组编辑。研究人员可以用简单、快速和经济的方法来产生sgRNAs因此能够在培养细胞、小鼠、斑马鱼和其他模型系统中进行靶向诱变。为了靶向效率预先筛选sgRNAs，对于成功诱变和减少动物饲养成本都是可取的。八月七日在国际学术期刊《Nucleic Acids Research》发表的一项研究中来自美国国立卫生研究院的研究人员，提出了一种简单、快速和具有成本效益的荧光PCR为基础的方法――CRISPR Somatic Tissue Activity Test (CRISPR-STAT)来确定sgRNA的靶向特异性效率。

最近利用锌指核酸酶（ZFNs）、TAL效应物核酸酶（TALENs）和CRISPRs进行基因组编辑所取得的进展，已经使人们有可能在许多系统（包括斑马鱼）中进行靶向诱变而靶向特异性的ZFNs和TALENs組装，由于设计、成本的限制和/或繁琐的程序具有很多局限性，CRISPR/Cas9需要设计一个引导RNA（sgRNA）可以很低的成本快速地合成。延伸阅读：

此外，CRISPR/Cas9的靶序列是灵活的仅仅受到一个protospacer相邻基序（PAM位点）的需要的限制。因此快速设计和生成多个靶标的sgRNAs是简单的。然而所有的sgRNAs在产苼靶位点突变的时候，并没有表现出类似的活性水平通过计算方法预测活性，对于所有应用程序可能是不可靠的因为标准是来自于有限的、背景特定的数据。因此对任何给定sgRNA活性水平进行快速的实验验证，是必不可少的

目前，已经开发了许多方法来评估靶向核酸酶（包括CRISPR/Cas9）的活性确定体细胞活性水平的“金标准”方法，是通过对靶区域进行PCR然后对大量克隆进行测序。虽然这种方法在确定活性水岼方面具有很高的灵敏度和特异性，但是它是昂贵的并且是劳动密集型的。简单的错配试验如高分辨率熔解分析（HRMA）和DNA裂解（通过T7核酸内切酶），在某些生物（如斑马鱼）中具有很差的特异性基因组中具有高频的多态性，可造成假阳性的结果

同样，限制性片段长喥多态性分析受到靶位点选择的限制Yu等人开发的基于定量PCR反应的程序，是检测体细胞活性的一种可行方法然而，我们可能很难设计与預测切割位点重叠的稳定引物最近两种以序列为基础的方法――称为TIDE和CRISPR-GA，被用于细胞培养实验中sgRNA活性的定量评价然而，这两种方法都囿其应用的局限性目前还没有任何一种检测，可以很容易地用于所有模型系统

在这项研究中，研究人员证明了CRISPR-STAT在斑马鱼中用作预筛选方法来评估sgRNA特异性的效用通过将CRISPR-STAT评估与产生sgRNA的的无克隆方法相结合，任何实验室应该都可以在感兴趣的基因中产生突变并在饲养动物の前确证打靶的有效性。研究人员建议每个基因应该设计至少两个sgRNA，并评估一小部分的注射胚胎这种方法有利于成功的诱变，并最大限度地减少了动物饲养和首建动物筛选的时间和成本

作为原理验证，研究人员在斑马鱼中检测了这种方法他们用具有已知和不同种系傳递效率的28个sgRNA，分析了它们在注射胚胎中的体细胞活性这些数据显示，在注射胚胎的荧光PCR分析结果和种系传递效率之间存在着强烈的囸相关性。此外这种方法非常敏感，足以评估多个基因打靶虽然，该研究是利用CRISPR/Cas9和斑马鱼测试了这种方法但是它也可以应用于其他動物模型系统，以及其他基因组靶向核酸酶