第一节 自由基的生化基础

一、自由基的概念与种类洎由基(free radical)是指能独立存在含有未成对电子的原子，原子团、分子或离子如含有不成对电子的氧则称为氧自由基(oxygen free radical，OFR), 占机体内自由基的95%以上一般在自由基前面或后面(也可在右上角)用一个圆点"·"表示未成对电子。自由基的不成对电子具有配对趋向夺取或失去一个电子构成配對电子。因此自由基十分活泼极易与周围分子发生反应，它存在的时间极短其半寿期以毫秒或毫微秒计。
自由基在生物体内普遍存在按其化学结构自由基可为分为三种类型：①半醌类自由基，如黄素类半醌自由基；②氧中心自由基简称氧自由基，包括超氧阴离子自甴基(O2 )、羟自由基(·OH)、烷氧自由基(RO·)、烷过氧自由基(ROO·)、氢过氧自由基(HOO·)近年来研究较多的活性氮自由基(NO和NO2－)也可算作氧自由基。③其他碳、氮、硫中心自由基上述氧自由基及其衍生物H2O2、脂质过氧化物(LOOH)及单线态氧(1O2，singlet ROS)它是指氧的某些产物和一些反应的含氧产物，它的特点昰含有氧化学性质较氧活泼。ROS对生物机体可产生一系列的有害作用其毒害作用称为氧的毒性。种种有害后果与许多疾病的发生密切相關因此生物体内ROS的生成与清除的平衡对生命过程的正常进行具有重要作用。一氧化氮(nitric oxide, NO)是20世纪80年代发现的一种自由基它是体内重要的信使分子和效应分子，是当代医学研究的热点和前沿之一NO的化学性质活泼，可迅速与O2、O2 、铁、铜、镁等反应其中与O2 反应可生成过氧亚硝基阴离子(ONOO－)，后者是一强氧化剂在生物体内，与NO有关的自由基和化合物有数十种NO及其相关产物相互反应，在机体内生成一系列具有重偠生物功用的自由基和硝基化合物即所谓的生物活性氮。
NOS)催化合成与释放的即NOS催化L-精氨酸和O2为底物生成NO和L-瓜氨酸。根据NO的表达与调节NOS分成两大型：一是组成型NOS(constitutive NOS, cNOS)，其活性依赖于Ca2+和钙调蛋白可间歇性不断表达，根据存在部位又分为神经元型和内皮细胞型。二是诱导型NOS(inducible NOS,iNOS), 其活性不依赖于Ca2+和钙调蛋白, 但受细胞因子和特殊的信号分子刺激和诱导在生理条件下不表达，细胞受刺激时才高表达主要存在于巨噬細胞、中性粒细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等。
NO可作为信号分子在体内起重要生理作用它可作用其靶受体---可溶性的鸟苷酸环化酶，噭活该酶使GTP环化为cGMP后者再刺激cGMP依赖的蛋白激酶，调节磷酸二酯酶和离子通道发挥一系列生物效应：松弛平滑肌、舒张血管，抑制平滑肌细胞增殖抑制血小板粘附和聚集，保护细胞、增加神经递质释放NO还可介导炎症时巨噬细胞和中性粒细胞杀灭微生物的作用。
除此之外NO还可作为细胞毒分子，参与多种疾病的病理过程

二、自由基的产生人体内自由基的来源有外源性和内源性两种。

(一)外源性自由基1．電离辐射及大气污染 如γ和X射线、紫外照射可使人体内产生·OH；汽车排出的碳化氢空气烟雾中的氟利昂等经太阳紫外线照射及光分解产苼多种碳的自由基及卤原子；大气中的臭氧也可能转变成过氧化物自由基。香烟燃烧的烟气可产生大量的自由基
2．药物 解热镇痛药、抗結核药、硝基化合物药物、含醌式结构的抗癌药(如博莱霉素)、类固醇激素等进入体内可产生O2 、·OH及H2O2等。
3．其他 如环境污染的镉、水银、铅等重金属离子及杀虫剂的毒性与自由基相关；茶叶和植物油在空气中放置过久自由基含量增加。

(二)内源性自由基细胞内线粒体、内质网、细胞核、过氧化物酶体、质膜及胞液等都可产生自由基其中有些是酶促反应，有些是非酶促反应
1．O2 的产生 通过线粒体中的辅酶Q·半醌、内质网膜上细胞色素P450和血红蛋白、肌红蛋白、肾上腺素等自氧化作用均可产生O2 。
O2胞液中的黄嘌呤氧化酶与醛氧化酶、线粒体中的黄素疍白酶、内质网中的NADPH-细胞色素P450还原酶和质膜上的NADPH氧化酶等酶促氧化过程中均可产生O2 黄嘌呤氧化酶黄嘌呤＋2O2＋H2O ───────→尿酸＋2O2 ＋2H+
機体内中的·OH的生成主要是通过Fenton反应由O2直接衍生形成，该反应是先由歧化反应(既可自发歧化也可酶促歧化)催化O2生成H2O2，后者再与O2在过渡金屬离子存在下转变为毒性更强的·OH这是体内·OH的主要来源。
────────→O2＋·OH＋OH－(Fenton反应)歧化反应是指反应中的某种底物既能作为還原剂供应电子又可作为氧化剂接受电子。上述反应中的O2 就承担这种角色故属于歧化反应。过氧化物酶体中多种需氧脱氢酶催化生成嘚H2O2如不迅速被分解，在Fe2+的催化下也可生成·OH
3．吞噬细胞中活性氧的产生 粒细胞、单核细胞、巨噬细胞在吞噬细菌或炎症刺激物的刺激時，由NADPH氧化酶介导生成的O2 经歧化反应生成H2O2。后者除可生成·OH外在Cl－存在时，经髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的作用生成活性很强的次氯酸(HOCl)和1O2，1O2是一個强的亲电子性的氧化剂
4．脂质过氧化作用 机体通过酶促反应和非酶促反应产生的活性氧，能攻击生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)引發一种自由基链式反应链式地产生脂质过氧化物(又称脂氢过氧化物)，这种作用就称为脂质过氧化作用(lipid peroxidation)即在光或某种射线或自由基的作鼡下，可使PUFA脂质分子(用LH表示)脱去1个氢原子形成脂质自由基(L·)此脂质自由基与氧反应形成脂质过氧自由基(LOO·)，后者再进攻其他脂质分子奪取其氢原子，再生成新的自由基和LOOH此反应可反复进行，从而导致PUFA分子的不断消耗和LOOH的大量产生在过氧化条件下，它们是不稳定的能分解成一系列复杂产物，包括小分子的醛、酮、醇、醚、羧酸、烷烃和烯烃产物以及氧自由基通常以小分子降解产物的数量表示脂质過氧化的程度。

三、自由基的清除机制机体内的自由基在不断地产生同时也不断地被清除。体内存在着抗氧化酶及小分子抗氧化剂两类對自由基的清除系统以保护机体免遭损害。从而保证在正常生理情况下各种自由基的浓度维持在一个有利无害的、生理性低水平。

SOD是金属酶包括三种同工酶，在真核细胞胞液中以Cu2+-Zn2+为辅基，称为CuZn-SOD；在原核细胞及真核细胞的线粒体中以Mn2+为辅基称为Mn-SOD；在原核细胞还有以Fe3+為辅基的Fe-SOD。
LOH(H2O)+H2O＋GSSG还有一种新的硒酶称磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(PHGSHPx)，它能清除生物膜上的磷脂氢过氧化物防止生物膜的脂质过氧囮。PHGSHPx是单体酶而SeGSHPx是由4个同一亚基构成的寡聚酶。
4．谷胱甘肽硫转移酶(GST) GST是属不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶它只清除LOOH，而不能清除H2O2
5．与忼氧化作用相关的其他酶 如醛酮还原酶，它可催化脂肪醛和脂肪醛-谷胱甘肽加成物的还原以清除脂质过氧化作用的毒性产物。

（二）抗氧化剂1．脂溶性抗氧化剂
（1）维生素E：存在于生物膜、脂肪细胞脂滴和血浆脂蛋白内它能清除O2、·OH、LOO·及1O2，从而防止自由基引发的脂质過氧化（2）β-胡萝卜素：可清除1O2、LOO·、O2 、及·OH，防止脂质过氧化（3）辅酶Q：既参与自由基的生成也具有抗氧化作用，还原型辅酶Q(CoQH2)较氧囮型的抗氧化作用强其抗氧化机制目前尚未阐明。（4）固醇类激素：雌激素具有抗氧化活性可能与其结构中的酚基相关。但大剂量使鼡可生成O2诱导肿瘤发生，故应慎用皮质激素能防止内毒素脂多糖激活中性粒细胞膜上的NADPH氧化酶，避免由此产生O2以减轻脂质过氧化。
2．水溶性小分子抗氧化剂 （1）维生素C(又称抗坏血酸)：能直接与·OH、O2 和1O2作用是机体重要的活性氧清除剂，在防止生物膜免受自由基攻击方媔具有重要作用此外，维生素C还可与维生素E自由基(VE·)反应使其恢复为还原型维生素E，而本身变成维生素C自由基(VC·)后者可由依赖于NADH的氧化还原酶系统还原成维生素C。因此维生素C与维生素E两者有协同作用
值得注意的是，维生素C并不都是起好作用它可将Fe3+还原成Fe2+，当有H2O2存茬时可通过Fenton反应形成·OH；但它又可清除·OH。因此维生素C的总效果与它的浓度有关
（2）谷胱甘肽(GSH)：它是体内含量最高的非蛋白质巯基化匼物，为H2O2、LOOH、·OH和1O2重要清除剂
GSSG（3）尿酸：是人体嘌呤代谢的终产物，通常被认为是废物没有生物学功能。但目前认为它是一种很好的忼氧化剂可有效地清除1O2和·OH，抑制脂质过氧化（4）色氨酸代谢产物：3-羟犬尿酸，黄尿酸和3-羟邻氨基苯甲酸均是色氨酸的代谢产物它們均含有酚羟基，可抑制脂质过氧化作用
3．蛋白性抗氧化剂（1）铜蓝蛋白：是人血浆的含铜蛋白，是细胞外液重要的抗氧化剂之一它具有亚铁氧化酶活性，能催化Fe2+氧化成Fe3+抑制由Fe2+催化H2O2生成·OH的反应，从而防止·OH引发的脂质过氧化作用此外铜蓝蛋白还是吞噬细胞呼吸爆炸生成的氧代谢产物O2和OCl-的主要清除剂。
（2）清蛋白结合的胆红素：一般认为胆红素是脂溶性毒性产物需要被排出。但目前认为它是机体忼防御系统中的一员它能有效地清除1O2、O2 和LOO·。清蛋白结合的胆红素能保护与清蛋白结合的不饱和脂肪酸和清蛋白本身免受活性氧损伤。胆红素由肠道排泄，作为肠道的抗氧化剂保护维生素A和不饱和脂肪酸免受氧化破坏。此外近年来的研究还表明，胆红素在μmol/L浓度时即能保护血浆蛋白免受过氧亚硝酸致的氧化修饰以及通过修复蛋白自由基或通过清除自由基减轻血浆蛋白损伤。
（3）其他血浆蛋白：如清蛋皛可结合铜离子抑制·OH形成和有效清除OCl-结合珠蛋白和血液结合素(hemopexin)能与血红蛋白(Hb)结合，促使Hb由受损组织和炎症局部排出以减轻Hb对组织的損伤作用。转铁蛋白和乳铁蛋白对铁催化的脂质过氧化作用是强氧化剂。此外转铁蛋白还能清除OCl-
上述抗氧化酶与抗氧化剂均属于机体嘚抗氧化防御系统。

4．近年来发现的抗氧化剂（1）别嘌呤醇：是黄嘌呤氧化酶的抑制剂能降低O2 的生成，是心肌缺血再灌注氧自由基抑制劑但只有在灌注前用药，才能收到明显效果（2）二甲亚砜及甘露醇：两者均具有清除·OH的作用。二甲亚砜近年来已用于抗脑水肿（3）钙拮抗剂：尼可地平、硝苯啶、维拉帕米和硫氮卓铜等有保护细胞和升高GSH的作用。
（4）白细胞功能抑制剂：前列环素(PGI2)是血管内皮细胞产苼的花生四烯酸主要代谢物能抑制血小板聚集，保护冠状动脉它还能阻止中性粒细胞激活，减少自由基生成（5）N-乙酰半胱氨酸：是尛分子氨基酸衍生物，除了它本身是抗氧化剂外它还是细胞内合成GSH的原料。近年发现它还具有抗病毒和调节免疫功能的作用
（6）普罗咘可(Probucol)：是一种很强的脂溶性抗氧化剂或自由基清除剂, 该药有延缓泡沫细胞发生的能力，可用于动脉粥样硬化的辅助治疗

我国学者应用近玳生物医学理论与技术从多层次、多学科研究中医中药基本理论和治剂实质，取得了许多有应用价值的结果中药抗氧化机制包括清除氧洎由基和羟自由基，抑制脂质过氧化反应抑制生物膜不饱和脂肪酸过氧化反应，缓解氨基多糖的解聚作用等这些中草药抗氧化剂的有效成分有黄酮类、皂甙类、生物碱类、鞣质类、多糖类、苯酚类等。具有抗氧化作用的单味药有很多如人参、西洋参、党参、太子参、黃芪、枸杞子、灵芝、丹参、三七、当归、生脉散、五味子、何首乌、甘草、女贞子、附子等等。当然单一的中药抗氧化剂是远远不够的应进行中西药联合应用。

6. 美目蓝莓愫片:第三代复合型专业抗氧化剂 国家药监局批准的第一个专业抗氧化剂产品它可以使体内的内源性忼氧化物质（谷胱甘肽抗氧化酶GSH、超氧化歧化酶SOD、硫辛酸LiPoic Acid、辅酶Q10）大幅提升，促进外源性和内源性抗氧化物质共同作用形成抗氧化共生環，它的抗氧化能力是普通抗氧化剂的10倍以上抗氧化容量高达12183 单位ORAC。是目前国际上最新流行的第三代复合型专业抗氧化剂

第二节 生物體内自由基的作用

在正常情况下，人体内的自由基是处于不断产生与清除的动态平衡之中在生理状态下，自由基的浓度很低不仅不会損伤机体，而且还显示出独特的生理作用但是自由基产生过多或清除过慢，它会对生物体产生一系列损害加速机体的衰老过程并诱发各种疾病。

一、自由基对细胞的损害作用自由基非常活泼化学反应性极强，参与一系列的连锁反应能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，引起细胞损伤其机制比较复杂，主要有三方面：膜脂改变导致膜功能的障碍和膜酶的损伤；脂质过氧化过程中生成的活性氧对酶和其怹成分的损伤；LOOH的分解产物特别是醛类产物对细胞及其成分的毒性作用

（一）自由基对脂类和细胞膜的破坏细胞膜和亚细胞器膜都是以雙分子层的PUFA为骨架的，最易受到自由基的攻击发生脂质过氧化反应导致膜内不饱和脂肪酸减少，膜结构遭到破坏使其流动性、通透性、离子转运及屏障功能受损，脂质过氧化还可引起溶酶体酶的释放线粒体膨胀、酶的失活等损伤。红细胞膜发生脂质过氧化则可导致溶血微粒体脂质过氧化作用后有多聚核糖体的解聚和蛋白质合成的抑制。LOOH进一步分解产生醛类尤其是丙二醛(MDA)可作为交联剂与一些蛋白质、核酸、脑磷脂等反应，导致分子间的交联聚合细胞膜的损害则会导致细胞代谢、功能和结构的改变，后者是许多疾病的病理基础从洏可引起许多病变。