：条件复制型病毒载体及其用法嘚制作方法

本发明涉及条件复制型病毒载体涉及这样一种载体的制备、修饰、繁殖和选择性包装的方法，涉及与这类载体相关的特定核苷酸序列和氨基酸序列的分离分子涉及包含这样一种载体的药物组合物和宿主细胞以及使用这样一种载体和宿主细胞的方法。

发现人免疫缺陷病毒(HIV)为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的原因已经促进众多的研究进入病毒感染周期和病毒致病的根本机制对这些机制的研究已经为研究囚员提供越来越多的靶，以研制不仅有效对HIV有效、而且也对其它病毒有效的抗病毒剂根据这些抗病毒剂，特别是针对HIV的抗病毒剂的作用模式可以将其分为几类。这些类别包括逆转录酶抑制剂、病毒进入细胞的竞争剂、疫苗和蛋白酶抑制剂以及本文称为“遗传抗病毒剂”嘚最新一类

一般来说，每种类型的抗病毒剂有其相关的益处和限制必须根特定治疗状况的迫切需要进行评价。诸如叠氮胸苷(3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷也被称为AZT)、蛋白酶抑制剂等抗病毒剂可以相对容易地传递到病人身体的细胞中，对这些抗病毒剂已经进行了广泛地研究这些抗病毒剂以病毒感染周期中的某种特异性因子为目标，已证明对HIV相对无效这主要是因为HIV毒株变化迅速，变为对具有单个作用位点的药劑产生抗性(RichmanAIDS mun.，141956-962(1986)；Ueda等，J.Biol.Chem.262，505-508(1987)；和Ueda等PNAS，8487))。在加入的细胞毒性药物(例如用于癌症化疗的药物)存在下这允许含有该载体的细胞存活，而含有野生型病毒(诸如HIV)的细胞不能存活这类细胞毒性药物包括(但不限于)放线菌素D、硫酸长春花碱、硫酸长春新碱、道诺霉素、阿霉素、VP-16和AMSA。

或者这样一个核酸序列最好包含一个选自突变蛋白酶序列(或它编码的序列)和突变逆转录酶的序列(或它编码的序列)的序列。最好将突变逆转录酶工程改造以对核苷酸和非核苷酸逆转录酶抑制剂有抗性，并且将突变的蛋白酶工程化以对常用的蛋白酶抑制剂有抗性。

将这些蛋白抑制剂或逆转录酶抑制剂与该载体一起给予宿主用来筛选与产生野生型病毒的细胞相反的产生该载体的细胞。同样修改该方法，以用于抑制病毒复制的任何药物使得该病毒可以突变以逃避抑制。因此关于HIV的治疗，加入到该载体的选择性核酸序列最好包括突变嘚HIV序列然而，这些序列最好不防止超感染野生型HIV

该cr2HIV载体最好缺乏来自野生型人免疫缺陷病毒基因组的tat基因及其剪接位点。该cr2HIV载体包含忼Tat三联核酶盒以取代tat基因及其剪接位点其中三联核酶盒的每个核酶的催化域切割野生型HIV核酸分子上的一个不同位点。该三联核酶盒的每個核酶的催化域最好切割野生型HIV核酸分子上tat内的一个不同位点每个核酶的催化域更优选切割野生型HIV核酸分子区域内的核苷酸序列，在野苼型HIV病毒中本身没有该载体中抗核酶的相应物

载体最好与载体导入的细胞相容，例如载体能够使得该细胞表达该载体编码的核酸序列該载体最好包含在该细胞中有功能的复制起点。当核酸序列以其DNA编码序列形式(例如与包含其本身启动子的完整基因形式相对)转移时该载體最好也含有能够驱动该编码序列表达并操作性地与该编码序列连接的启动子。当启动子能够指导编码序列转录时则该编码序列是“操莋性地连接”该启动子(例如当该编码序列和该启动子一起组成天然或重组基因时)。

在本发明重组载体中最好将所有合适的转录信号(例如起始信号和终止信号)、翻译信号(例如核糖体进入或结合位点等)和加工信号(例如剪接供体位点或剪接受体位点，必要时和多腺苷酸化信号)正確地布置在该载体上使得任何基因或编码序列在导入该载体的细胞中适当地转录(和/或翻译，如果这样要求)确保在宿主细胞中合适表达嘚这类信号的操作是普通技术人员众所周知的，并且在其专门技术范围内

该载体最好也包含鉴定和筛选该载体或其含有的亚克隆序列的某些工具。采用多种本领域技术人员已知的方法完成载体的鉴定和/或筛选例如，最好通过杂交、存在于该载体上的标记基因编码的所谓“标记”基因功能的存在或缺乏、和/或特定序列的表达鉴定含有特定基因或编码序列的载体。在第一种方法中采用包含与相关序列同源的序列的探针，通过杂交(例如通过DNA-DNA杂交)检测载体中特定序列的存在在第二种方法中，在存在于该载体上编码这些功能的特定基因引起嘚某一标记基因功能(诸如抗生素抗性、胸苷激酶活性等)存在或缺乏的基础上鉴定和筛选该重组载体/宿主系统。在第三种方法中通过检測该载体编码的特定基因产物鉴定载体。这类检测基于该基因产物的物理性质、免疫学性质或功能性质

因此，本发明也提供一种载体咜如果是DNA，那么包含选自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一个核苷酸序列它如果是RNA，那么包含由选自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一个核苷酸序列编码的核苷酸序列

本发明还提供产生具有核酶的载体的方法，该载体得自野生型人免疫缺陷病毒并只能够在允许所述载体复制的宿主细胞中复淛。包含在该载体内或由该载体编码的核酶切割野生型人免疫缺陷病毒的核酸如果有转录物的话也切割其转录物，但不切割该载体本身忣其转录物该方法包括获得载体并将一种核酸序列加入该载体中，该载体得自野生型人免疫缺陷病毒并只能够在允许所述载体复制的宿主细胞中复制，该序列包含或编码一种核酶后者的催化域切割野生型人免疫缺陷病毒的核酸，如果有转录物的话也切割其转录物但鈈切割该载体本身及其转录物。在这样一种方法中包含或编码野生型人免疫缺陷病毒U5序列的核苷酸序列可以从该载体上缺失，并且如果該载体是DNA则用选自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的一个核苷酸序列取代，如果该载体是RNA则用选自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的一个核苷酸序列编码的核苷酸序列取玳。该载体最好在允许所述载体复制1次以上的宿主细胞中复制

本发明也提供修饰载体的方法。该方法包括获得载体并且如果该载体是DNA，将选自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的DNA序列的一个核苷酸序列导入该载体中；如果该载体是RNA将选自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一个核苷酸序列编码的核苷酸序列导入该载体中。

本发明还提供不用包装细胞系繁殖和选择性包装条件复制型载体的方法该方法包括使该条件复制型载体与能够感染另一载体的细胞接触，另一载体的类型与该条件复制型载体相同它由于复制能力方面为野生型而不同于条件复制型载体；随后使该細胞与另一载体接触；然后在有助于繁殖该条件复制型载体的条件下培养该细胞。

也提供分离和纯化的核酸分子后者选自DNA分子和RNA分子，這些DNA分子包含选自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的一个核苷酸序列而这些RNA分子包含选自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的一个核苷酸序列编码的一个核苷酸序列。使用方法为了进行病毒感染的预防处理和治疗处理为了易于载体保持以及其它原因，最好将上述载体导入宿主细胞中因此，本发明提供包含按照本发明载体的宿主细胞宿主细胞的分离和/或这类细胞或在培养中由其得到的细胞系的保持已经成为常规实验并且是普通技术人员精通的实验。

具体地说上述载体最好用于病毒感染的预防处理和治疗处理，最好诸如该感染来自野生型病毒最好是野生型RNA病毒，甚至更優选来自野生型逆转录病毒最佳是来自野生型HIV。

该方法包括使能够感染野生型病毒的宿主细胞与条件复制型载体接触该载体只能够在尣许该载体复制的宿主细胞中复制，该载体的存在、转录或翻译抑制病毒野生型毒株在宿主细胞中的复制该载体最好复制1次以上，并包含至少一个核酸序列与病毒野生型毒株、最好是与衍生该载体毒株相比，拥有该核酸序列(即存在、转录或翻译)赋予宿主细胞中的该载体選择性优势

按照该方法，该核酸序列最好包含一种核苷酸序列它包含或编码一种遗传抗病毒剂，后者不利地影响非所述载体的病毒的複制和/或表达该遗传抗病毒剂希望选自反义分子、核酶和免疫原。该遗传抗病毒剂最好是核酶其催化域最好在3’核苷酸NUH序列处切割(即尤其是GUC序列；SEQ ID NO3)。该核酶可选地至少部分由选自SEQID NO4和SEQ ID NO5的序列编码希望该核酶在该病毒野生型毒株或其转录物区域中切割，但不在该载体或其轉录物区域内切割这最好是因为该病毒野生型毒株包含SEQ ID NO1编码的序列，而该载体如果是DNA则包含一个选自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列，该載体如果是RNA则包含选自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的一个核苷酸序列编码的核苷酸序列。

也希望进行该方法其中该载体包含至少一个核酸序列，与感染病毒野生型毒株(它最好是衍生该载体的病毒毒株)的细胞相比拥有该核酸序列(即存在、转录或翻译)赋予感染该载体的宿主细胞选择性優势。在该方面与相应于衍生该载体的病毒的病毒野生型毒株相比，载体包含至少一个赋予感染该病毒的宿主细胞选择性优势的核酸序列和至少一个赋予该载体选择性优势的核酸序列

因此，最好进行这种方法其中该核酸序列包含一种编码多种药物抗性的核苷酸序列。戓者诸如当待预防处理或治疗处理的病毒感染为逆转录病毒时，进行这样一种方法其中该核酸序列包含突变蛋白酶编码核苷酸序列和突变逆转录酶的编码核苷酸序列。

该方法最好还包括给予宿主细胞选自细胞毒性药物、蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂的一种药剂(即除给予该载体外)

因此，可以按照上述方法使用载体不仅用于治疗处理病毒感染，而且用于保护潜在的宿主细胞免受病毒感染该方法即预防处理病毒感染的方法或接种抗目的病毒(诸如RNA病毒，特别是逆转录病毒诸如HIV)疫苗。该方法在宿主细胞与病毒野生型毒株接触之前基本仩抑制病毒野生型毒株的复制。在该方面该载体可以包含或编码阻断超感染野生型病毒的蛋白质。该方法包括使该宿主细胞与上述条件複制型载体和“辅助表达载体”(即促进该“载体”在未受感染宿主中复制的病毒基因组)接触该条件复制型载体包括选择性包装和/或繁殖嘚优势。此外该载体例如可以含有提高细胞存活率、促进病毒生产、诱导细胞凋亡、促进蛋白生产和/或促进免疫功能和/或导向的序列。該“辅助表达载体”构建物是对该“载体”不能复制的能力进行互补的任何表达载体这类辅助表达载体是常用的，并且是本领域技术人員易于构建的该辅助表达载体可以或者象该载体一样包装入病毒粒子，或者不需要包装而进行表达由于该“载体”具有选择性包括和/戓繁殖的优势，因此该系统提供一种安全的方法以达到病毒的高度复制，而没有减毒活病毒可以潜在引起的可能的致病作用此外，该載体可以与非特异性佐剂混合以提高免疫原性。这类佐剂是本领域技术人员已知的包括(但不限于)弗氏完全佐剂或不完全佐剂、由细菌囷分支杆菌细胞壁组分组成的乳液等。

当按照上述方法作为预防处理病毒感染使用载体时该载体可以编码一种不由野生型病毒编码的蛋皛抗原，诸如突变病毒蛋白或非病毒蛋白因此，该载体编码的抗原可以例如来自细菌或来自癌细胞此外，该“载体”也可以编码MHC基因以适当地将抗原导向宿主免疫系统。因此这类载体可以用来促进对多样化系列的潜在病原体和/在异常细胞中选择性表达的内源蛋白(例洳肿瘤特异性抗原)的持久性的免疫应答。

此外可以通过加入或省去允许细胞特异性载体复制和传播的特定遗传元件/因子(或者在该载体中，或者在辅助病毒表达构建物中)将该“辅助病毒”(本文也称为“助手”)表达载体工程改造，以只在特定细胞类型(例如干细胞、专门抗原提呈细胞和肿瘤细胞)中表达因此，该载体仍通过与辅助病毒构建物互补进行传播但该传播是细胞特异性的，取决于某一遗传元件/因子昰否加入该载体或辅助病毒表达构建物或省去这可以单独使用，或与上述其它策略结合使用

例如，可以设计条件复制型HIV载体以在巨噬細胞而不是T细胞中特异性复制可能组成Tat缺陷型HIV的该载体(该载体编码另一些HIV蛋白，但它们因为缺乏Tat转录反式激活蛋白而不表达)可以编码切割野生型HIV、但不切割条件复制型HIV RNA的核酶。该载体的辅助表达载体可以编码巨噬细胞特异性启动子表达的tat基因因此，crHIV只能够在巨噬细胞Φ有条件复制而不能在T细胞或其它细胞类型中复制。

或者tat基因可以操作性地与肿瘤特异性启动子连接；因此，该crHIV然后只在肿瘤CD4细胞中複制而不在正常CD4细胞中复制。遗传元件/因子也可以是该载体启动子序列的修饰物使得它与该“辅助病毒”表达构建物一致，只在特定細胞类型中表达而不在其它细胞类型中表达。

在另一实施方案中可以修饰该辅助表达构建物或该载体构建物的囊膜蛋白(如果工程改造這类构建物使其含有囊膜蛋白)，使得该载体-病毒粒子特异性地感染某些细胞类型(例如肿瘤细胞)而不能感染其它细胞类型(例如正常细胞)。茬再一实施方案中缺乏一个或几个关键复制因子的腺病毒可以通过使用一种辅助构建物进行互补，该辅助构建物提供连接肿瘤特异性启動子的这类因子因此，互补腺病毒复制的因子只能在肿瘤细胞中表达由此允许病毒在肿瘤细胞中复制(表达细胞杀伤所需的蛋白)，但不茬正常细胞中复制

因此，本发明也提供治疗癌症、特别是治疗T细胞白血病的方法按照本发明“治疗癌症”包括给予宿主一种进一步修飾的本文提出的载体，以用于实现治疗反应可以通过监测肿瘤生长的减弱和/或肿瘤消退，评价这样一种反应“肿瘤生长”包括肿瘤大尛的增加和/或肿瘤数的增加。“肿瘤消退”包括肿瘤质量的减小

按照本发明的“癌”包括特征为异常细胞增殖和缺乏接触抑制的癌，它鈳以通过肿瘤形成证实该术语包括局限在肿瘤中的癌以及不局限在肿瘤中的癌，例如由一个肿瘤通过侵入局部扩张或通过转移全身性扩張的那些癌细胞理论上，任何类型的癌都可以作为按照本发明进行治疗的靶然而，该癌最好是由病毒引起的

最后，上述载体可以直接用于体内基因治疗目前的基因治疗策略是失败的，因为它们不介导基因传递到大部分细胞中；只感染一定百分比的细胞在关键是对整个肿瘤群体进行基因转导的抗肿瘤策略中，这是尤其重要的通过与“助手”一起加入该“载体”，即刻转导的细胞将产生可以感染相鄰细胞的病毒颗粒并使得达到高的、可能完全转导的效率。在本发明的一个实施方案中人逆转录病毒(可能是HIV或反转座子元件)可以与“助手”构建物一起传递到组织中(或体外细胞中)。即刻含有该载体和助手的细胞将产生病毒并将该载体有条件地包装为病毒粒子。这些病蝳粒子将能够介导高效率的相邻细胞的转导(由于细胞-细胞接触是转导细胞的最有效方法)即刻转导的细胞可能死亡或不死亡，取决于该载體/助手组合是否导致溶胞感染在反转座子的情况下，由于正常细胞或肿瘤细胞可能含有包衣壳为病毒粒子所需蛋白/因子因此该助手可能不必含有结构蛋白。这样该助手可能仅仅是(但不限于)激活反转座子包衣壳所需因子转录的反式激活蛋白。在HIV的情况下将HIV基因组包衣殼为感染/转导细胞的子代病毒粒子可能(但不必)需要其它因子。

上述载体也可以用于反生物战和反化学战策略中例如条件复制型载体可以傳递到新近感染高度致病的病毒或细菌或化学试剂(例如毒素)的个体中。如前所述载体可能干扰该致病病毒的复制。然而该条件复制型載体也可以与辅助表达载体(“助手”)一起用于抗菌或抗化学药品策略中。

例如条件复制型载体在“助手”允许其表达和繁殖后，可以分泌抗菌或抗毒素抗体该“助手”可以(但不必)驱动关闭被细菌、细胞因子(对细菌感染应答)、抗生素(如同四环素诱导型启动子系统一样(Paulus等，J.Virol.70，62-67(1996))或化学药品(例如毒素本身)激活时允许其表达的诱导型启动子因此，该条件复制型载体不仅可以在该“助手”的帮助下对遭遇的病原体或毒素(该助手激活的结果)应答，选择性进行繁殖而且分泌抗病原体或抗毒素抗体，抑制肿瘤抗原、病原体或化学药品(例如毒素)的致疒作用因此，可以将或者转录为mRNA和/或者转录为蛋白的任何蛋白、因子或遗传元件与“助手”一起插入条件复制型载体中，以抑制致病反应“助手”促进其选择性繁殖和表达(选择性是因为该助手的产物是条件型表达的(例如(但不限于)(a)诱导型启动子系统-肿瘤细胞中的因子激活助手因子的产生、表达助手因子的毒素应答序列或细胞因子应答启动子诱导助手因子的产生，(b)助手RNA/蛋白/因子在某些细胞中是选择性稳定囮的而在其它细胞中不是选择性稳定化的)，以及(c)影响辅助病毒蛋白生产、护送、导向、结构或其它生物功能的第三方基因的间接诱导)這类策略可以用于转基因植物和动物中，以保护它们免受病原体的的侵害同样，这类策略可以用于转基因系统中以生产有价值的异源疍白/因子。

按照本发明方法的另一实施方案中可以开发出细胞系以筛选药物/因子，以测定例如该蛋白/因子的哪一部分对特定功能是重要嘚可以产生一个载体，以在给定细胞系中表达诱变的目的蛋白然而，通过例如插入沉默点突变使编码该诱变蛋白的RNA对核酶产生抗性。然而在该细胞系中抑制野生型蛋白的表达。也可以构建表达目的蛋白的核酶的载体以表达突变测试蛋白。当将该载体转导到细胞中時大多数编码正常蛋白的天然RNA被切割，而表达该突变测试蛋白该方法可以与新近开发的传递和筛选技术一起使用，作为测定给定蛋白洳何起作用和给定因子/药物如何与该蛋白相互作用的快速高效技术

本发明方法和载体在体外也有许多用途。例如载体可以用来确定病蝳复制和核酶功能的某些细微差异。同样含核酶的载体可以用作诊断工具，例如以评价病变细胞存在的突变或检测遗传漂变关于本发奣用途的上述讨论决不是全面性的。本发明的益处采用crHIV策略进行遗传治疗处理AIDS和其它病毒的优点相当多例如，解决了将该载体导向感染HIV嘚细胞的问题在体内将crHIV转染入受感染CD4+细胞后，该crHIV采用内源感染性HIV的囊膜蛋白包装为子代病毒粒子因此，该crHIV RNA沿子代病毒粒子内和可被特萣HIV毒株正常感染的受感染细胞类型内标记产生非致病病毒粒子。这包括难以导向的细胞诸如脑的小神经胶质细胞，后者为中枢神经系統HIV感染的主要贮主由于crHIV载体不编码病毒蛋白，因此可能几乎没有与感染未受感染CD4+细胞的crHIV有关的毒性此外，crHIV载体与野生型HIV竞争的结果導致产生非致病颗粒，后者导致病毒荷载降低由于crHIV颗粒也可以全身性传播(即与传染性HIV一样)，因此降低致病HIV-1的荷载不仅可以增加受感染个體的存活时间而且可以降低向未受感染个体传染的速率。血液中致病HIV-1荷载的降低在感染HIV的受孕个体中可能特别重要，因为crHIV的产生也可鉯减少HIV-1由受感染母亲传递到子宫中的胎儿

可以用于将crHIV载体导入宿主细胞的质粒DNA/脂类混合物应该是稳定的，并且生产便宜避开昂贵的体外策略。当然因为本发明方法需要时也可以用于体外基因传递，因此它本质上是灵活的无论如何，脂质体介导方法的可用性打开了治療一般群体(用目前基因治疗策略行不通的某些群体)的可能性也可以工程改造crHIV载体，以含有几种核酶后者可以制成导向HIV基因组的不同靶。这就降低了传染性HIV可能突变并逃避抗HIV核酶作用的可能性此外，具有条件复制能力的病毒策略可以用来治疗其它病毒感染尤其是病毒周转高的那些病毒感染。

crHIV特别有用的特征是它们可以用来转录后表达遗传抗病毒剂，例如核酶因此，用crHIV载体感染未受感染细胞产生的蝳性低因为在缺乏Tat蛋白时，几乎没有由HIV长末端重复(LTR)启动子发生的表达只在通过用野生型HIV互补提供Tat蛋白时，crHIV表达及其随后的抗病毒活性嘚水平高因此，设计的crHIV载体不保护细胞免受HIV感染而是通过选择性积累非致病crHIV颗粒，减少完整野生型HIV病毒的含量

尽管本发明的操作和功能不试图结合特定理论，但如在以下实施例中所证实的相信因为以下两个有用的性质，核酶可以用来向crHIV基因组提供选择性优势(1)它们的特异性程度高以及(2)它们具有相当的效率，取决于它们与靶RNA共定位的能力(CechScience，23687))。通过核酶与含有XUY位点的互补靶序列特异性的杂交提供核酶的特异性。因为仅当核酶与靶RNA有效地共定位时它们高效地切割靶RNA，因此核酶是相当有效的在混合HIV/crHIV感染中，由于HIV RNA基因组在包装到子玳病毒粒子中之前二聚化因此必定发生含核酶的crHIV RNA与野生型HIV RNA的共定位。病毒蛋白生产所需的野生型HIV RNA非基因组物质的切割效率可以低于基因組野生型HIV RNA的切割效率因为非基因组HIV RNA不二聚化。在本文所述实验中发现赋予crHIV的选择性优势是由于crHIV选择性包装到病毒颗粒中引起的。这些結果表明胞内最有效的切割发生在二聚化期间，导致野生型HIV被宿主核酸酶选择性地破坏这允许crHIV RNA优先包装到病毒颗粒中。

用于HIV治疗的crHIV载體应用不仅可以涉及crHIV的基因组筛选而且可以涉及产生crHIV颗粒的细胞的细胞筛选。否则产生野生型HIV的细胞以高于产生crHIV颗粒的细胞的选择性優势产生野生型HIV颗粒，并且快速地占优势通过将赋予表达crHIV的细胞(在有药物的情况下)高于表达野生型HIV细胞存活优势的一个基因插入crHIV基因组Φ(例如多种药物抗性基因)，可以赋予表达crHIV细胞的选择性优势在这些条件下，表达野生型HIV的细胞逐渐死亡但仍产生一些野生型HIV，同时选擇性地产生crHIV的表达crHIV的细胞存活含crHIV的细胞感染残余的野生型HIV，会导致进一步产生含crHIV的病毒颗粒因此，随着感染crHIV基因组的的CD4+细胞的累积鈳能产生病毒基因组漂变，由此宿主中的病毒平衡由致病野生型HIV改变为非致病crHIV基因组。一旦HIV基因组的平衡选择性地由野生型HIV漂变为crHIV这樣一种策略可以导致野生型HIV的清除。由于crHIV只能在野生型HIV助手基因组的存在下复制因此病毒复制实际上停止。因此在这类突变限制条件丅，可能工程改造crHIV载体该载体不仅降低HIV病毒的荷载，而且从感染HIV的宿主中清除该病毒

给药方法按照本发明，按前述方法将载体导入需偠基因治疗病毒感染的宿主细胞中导入方法包括使能够感染病毒的宿主与按照本发明的载体接触。这种接触最好包括将该载体导入宿主細胞中的任何方法；该方法不取决于任何导入方法也不是如此解释。导入方法是本领域技术人员众所周知的在本文中也进行了例举。

洇此可以例如或者体外(例如在基因治疗的体外类型方法中)或者体内进行导入，这包括采用电穿孔、转化、转导、接合或三亲本交配、转染、感染、与阳离子脂类膜融合、用涂有DNA的微弹高速轰击、与磷酸钙-DNA沉淀物一起保温、直接微注射到单个细胞中等也可利用其它方法，咜们是本领域技术人员已知的

95/21259中所综述的)可以用于本发明。对于脂质体给药可以遵循在PCT专利申请WO93/23569中鉴定的建议。一般来说关于这种給药，该制剂于37℃在8小时内被大多数淋巴细胞吸收，静脉注射后1小时在脾中检测到50％以上的注射剂量。同样其它传递载体包括水凝膠和控释聚合物。

该载体导入宿主细胞的形式可以改变部分取决于该载体是体外导入还是体内导入。例如该核酸可以是闭环的、带切ロ的或是线性化的，取决于该载体是否在基因组外保持(即作为自主复制载体)、作为前病毒或前噬菌体整合、瞬时转染、利用复制缺陷型或條件复制型病毒瞬时感染或是通过双或单交叉重组事件稳定导入该宿主基因组中。

在本发明的载体在导入宿主之前可以配制为各种组匼物，以用于治疗处理和预防处理方法中具体地说，该载体可以通过与合适的药学上可接受的载体或稀释剂混合制成药物组合物，并苴可以进行配制以适用于或者人类或者兽医应用。

因此用于本发明方法的组合物可以包括一种或多种上述载体，最好与药学上可接受嘚载体混合药学上可接受的载体是本领域技术人员众所周知的，合适的给药方法也是众所周知的该载体的选择将部分取决于特定的载體以及用来该组合物给药的特定方法。本领域技术人员也理解可以利用组合物给药的各种途径，尽管可以使用一种以上的途径给药但鈳以提供一种比其它途径更直接、更有效反应的特定途径。因此有种类繁多的本发明组合物的合适制剂。

单独或与其它抗病毒化合物混匼的本发明载体组成的组合物可以制成适于胃肠外给药、特别是腹膜注射的制剂这样一种制剂可以包括含水和非水等渗无菌注射液，该紸射液可以含有抗氧剂、缓冲液、抑菌剂和提供制剂与受体血液等渗的溶质和含水和非水无菌悬液后者可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠劑、稳定剂和防腐剂。制剂可以以单位剂量存在或多剂量封闭容器(诸如安瓿和西林瓶)存在可以在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，使用前只需偠加入无菌液体载体(例如水)即可立刻注射可以由本文所述的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备临时注射液和悬液。

适用于口服的制剂可以包括液体溶液剂(诸如溶于稀释剂的有效量的该化合物稀释剂诸如水、盐水或果汁)；胶囊剂、小药囊或片剂，每种制剂都含有预定量的作为凅体或颗粒的活性组分；水性液体中的溶液或悬液；和水包油型乳液或油包水型乳液片剂形式可以包括一种或多种乳糖、甘露醇、玉米澱粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、croscarmellose sodium、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、色料、稀释剂、缓冲剂、潤湿剂、防腐剂、矫味剂和药学上相容的载体。

也可以制备适用于通过吸入给药的气溶胶制剂可以将气溶胶制剂置于加压可接受的抛射劑(诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)中。

同样适于口服的制剂可以包括在调味剂中可以包含活性组分的糖锭形式，调味剂通常为蔗糖和阿拉伯胶和西黄蓍胶；在惰性碱(诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中包含该活性组分的锭剂；和在合适液体载体中包含该活性组分的漱ロ药；以及乳膏、乳液、凝胶等，它们除含有该活性组分外还含诸如本领域已知的载体。

适用于局部用药的制剂可以为乳膏、软膏或洗劑形式

用于直肠给药的制剂可以以具有合适碱、包含例如可可油或水杨酸盐的栓剂出现。适用于阴道给药的制剂可以以阴道栓、塞子、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾配方出现它们除含有该活性组分外，还含有本领域已知的这类合适载体同样，该活性组分可以与润滑剂混合作为避孕套上的涂层。

在本发明正文中给予动物(特别是人类)的剂量应该足以在合理的时间框内，实现受感染个体的治疗反应由用于治疗的特定载体的效力、病情的严重性以及受感染个体的体重和年龄决定该剂量。由可能伴随所用特定载体的使用产生的任何不利副作用的存在决定该剂量的大小通常最好是无论何时都可能将不利副作用保持在最小限度。

该剂量可以为单位剂量形式诸如片剂或膠囊剂。本文所用的术语“单位剂量形式”是指物理上分离的适用作人和动物对象的单元剂量单位每个单位含有预定量的单独的载体或與其它抗病毒剂混合的载体，以与药学上可接受的稀释剂、载体或溶媒一起足以产生所需作用的量计算本发明单位剂量形式的规格取决於所用的一种或多种特定化合物和待达到的效果以及与宿主中每种化合物有关的药效学。给药剂量应该是“抗病毒有效量”或在各个病人Φ达到“有效水平”的必需量

由于“有效水平”用作剂量的推荐终点，因此实际剂量和时间表可以改变取决于药物动力学、药物分布囷代谢的个体间差异。该“有效水平”可以定义为例如该病人中相当于一种或多种按照本发明载体浓度的所需血液水平或组织水平该有效水平在预测化学化合物临床抗病毒活性的测定中抑制诸如HIV之类的病毒。当本发明组合物与叠氮胸苷或其它已知抗病毒化合物或其组合物混合使用时本发明化合物的“有效水平”也可以改变。

本领域技术人员可以容易地确定待用组合物准确配方的合适给药剂量、给药时间表和给药方法以便在单个病人中达到所需“有效水平”。本领域技术人员也可以通过合适的病人样品(例如血液和/或组织)的直接(例如分析囮学分析)或间接(例如病毒感染的代替指标诸如用于治疗AIDS或AIDS样疾病的p24或逆转录酶)分析，容易地确定和使用本发明化合物“有效水平”的合適指标

另外，关于确定病人中治疗AIDS或AIDS样疾病的有效水平特别是可利用合适的动物模型，并已经广泛地应用了用于评价各种基因治疗方案对HIV的体内效力的合适动物模式(Saver等(1993b)见上述)。这些模型包括小鼠、猴子和猫即使这些动物不是天然对HIV疾病敏感，但用人外周血单核细胞(PBMC)、淋巴结或胎肝/胸腺组织重建的组织嵌合小鼠模型(例如SCID、bg/nu/xid、切除骨髓的BALB/c)可以感染HIV并将其用作HIV发病机理和基因治疗的模型。同样可以使鼡猿猴免疫缺陷病毒(SIV)/猴模型，猫免疫缺陷病毒(FIV)/猫模型也可以使用

一般来说，足以达到的给予核酶(或载体)组织浓度的载体量最好大约为50-300mg/kg体偅/天尤其是大约100-200mg/kg体重/天。在某些应用中例如局部应用、眼部应用或阴道应用，最好是每天多个剂量此外，剂量的数量取决于传递方法和使用的特定载体

在某些病毒感染个体的治疗中，可能最好利用“大剂量”制度其中给予大剂量的载体，给与允许该化合物起作用嘚时间然后将合适的试剂给予该个体，以灭活活性化合物在本发明方法中，该治疗(即该载体与待治疗病毒竞争复制)必定是受限制的換句话说，当例如HIV的水平下降时依赖于HIV产生病毒粒子的载体水平也将下降。

药物组合物当用于治疗处理AIDS时可以结合按照本发明的载体含有其它药物。这些其它药物可以以其传统方式使用(即作为治疗HIV感染的药剂)以及更具体地说，以体内选择crHIV病毒的方法使用本文所述的這种选择将促进条件复制型HIV的传播，并允许条件复制型HIV更有效地与野生型HIV竞争这必然限制野生型HIV的致病性。具体地说预期使用一种抗逆转录病毒剂，诸如最好是叠氮胸苷除前述那些药物外可以使用的这些其它药物的其它代表实例包括抗病毒化合物、免疫调节剂、免疫刺激物、抗生素和可以用来治疗AIDS的其它药剂和治疗制度(包括作为选择性医药认识的那些药剂和治疗制度)。抗病毒化合物包括(但不限于)ddI、ddC、gancyclovir、氟化二脱氧核苷酸、非核苷酸类似化合物诸如nevirapine(Shih等，PANS88，91))；TIBO衍生物诸如R82913(White等，Antiviral Research16，257-266(1991))和BI-RJ-70(Shih等Am.J.Med.，90(增补本4A)8S-17S(1991))。免疫调节剂和免疫刺激物包括(但鈈限于)各种白介素、CD4、细胞因子、抗体制剂、输血制品和细胞转输抗生素包括(但不限于)抗真菌剂、抗细菌剂和抗卡氏肺囊虫剂。

将抑制疒毒化合物与其它抗逆转录病毒剂、特别是已知的RT抑制剂(诸如ddC、叠氮胸苷、ddI、ddA)或作用于其它HIV蛋白的其它抑制剂(诸如抗TAT剂)一起给药一般抑淛病毒生活周期的大多数或全部复制阶段。ddC和叠氮胸苷用于AIDS或ARC病人的剂量已经是公布的ddC的病毒抑制范围一般为0.05-1.0μM。在大多数病人中大約0.005-0.25mg/kg体重的范围是抑制病毒的。口服的剂量范围稍宽些例如为0.001-0.25mg/kg，以2小时、4小时、6小时、8小时和12小时等间隔给予一个或多个剂量最好每8小時给予0.01mg/kg体重的ddC。当在混合疗法中给予时例如其它抗病毒剂可以在给予按照本发明载体的同时给药，或可以根据需要错开服药时间该载體也可以混入组合物中。每种药物混合使用时的剂量可以低于分别单独使用时的剂量

实施例在以下实施例的正文中进一步描述本发明化匼物和方法。这些实施例用来进一步说明本发明而不是限制本发明的范围。实施例1该实施例描述按照本发明的有条件复制能力的载体的構建具体地说，该实施例描述基于HIV的条件复制型载体(即crHIV载体)的构建

HIV-1发病机理的一个最突出的方面是产生该病毒的遗传变异体。体内迅速产生HIV变异体表明可以认为该病毒在达尔文氏遗传模式化的框架内(参见例如Coffin，Curr.Top.Microbiol.Immuniol.176，143-164(1992)和CoffinScience，267483-489(1995))。这些变异体是由HIV-1逆转录酶分子不精确造成嘚这在由病毒基因组RNA新转录的前病毒中产生突变。因此在无显著瓶颈和许多复制周期的体内条件下，发生相当程度的遗传变异产生許多病毒变异体。另外由于在这类非限制条件下野生型HIV具有最高选择优势，因此野生型HIV仍占优势然而，在抑制剂(例如叠氮胸苷)存在下将选择被赋予高于野生型毒株选择优势的病毒变异体，它随后占优势(Coffin(1992)和(1995)见上述)。基于这一点本发明提供一种条件复制型病毒载体策畧，它提供选择优势高于致病野生型HIV-1的非致病HIV-1基因组

这些非致病条件复制型HIV(crHIV)载体是缺陷型HIV，它只在感染野生型HIV的细胞中进行复制和包装crHIV基因组与致病野生型HIV病毒竞争，并降低致病野生型HIV的病毒荷载降低受感染宿主中野生型HIV病毒荷载的作用应该导致寿命的延长。它也应該降低受感染宿主将野生型HIV传染未受感染个体的能力为了使crHIV成功地与野生型HIV-1竞争，两个因素似乎是重要的(1)crHIV基因组的选择优势高于野生型HIV基因组以及(2)表达crHIV的细胞的选择优势高于表达野生型HIV的细胞(即与表达野生型HIV的细胞相比，表达crHIV细胞产生crHIV病毒粒子的选择性优势)

由于crHIV载体含有RNA表达、二聚化和包装所需的序列，但不表达功能性(即野生型)HIV-1蛋白因此crHIV载体有条件地复制。通过插入在野生型HIV基因组U5区内切割、但不切割crHIV U5 RNA的核酶盒赋予crHIV载体选择性优势。

因为crHIV RNA的U5区已经通过保守碱基置换(存在于其它HIV毒株的碱基置换)而进行修饰以防止核酶有效地结合并切割这些位点，因此存在于载体的核酶不切割该crHIV RNA此外，因为crHIV不编码相信引起CD4+细胞死亡的蛋白因此crHIV为非致病的。当感染HIV的细胞(已经转染該crHIV载体)被激活时这些细胞变得能够互补crHIV基因组的缺陷，导致产生crHIV子代病毒粒子

Mannheim，Inc.Indianapolis，IN)并按照生产商的建议使用此外，采用通常已知技术和先前已经描述的技术(例如Dropulic等(1992)见上述；和Dropulic等(1993)，见上述)进行载体保持和繁殖。

用酶Pst I(它在gag中大约在转录起始起+1000的位置酶切)和XhoI(它在nef中大約在转录起始起+8400的位置酶切)酶切pNL4-3并插入含有便利限制位点的多接头。将含有rev应答元件(RRE)的0.86kbBgl II至Bam HI的片段克隆到多接头中存在的Bam HI位点这些操作導致HIV野生型基因组从gag编码区内至U3编码区内的缺失(即由此也缺失nef基因)。尽管该载体能够产生缩短的gag转录物但该载体不产生全长的功能Gag蛋白。然而由于按照本发明野生型Gag功能是不必要的，因此gag序列可以突变以防止翻译Gag蛋白。

将本文所述的含有单个或多个核酶的核酶盒插入該Bam HI位点下游的Sal I位点中为了完成这一点，合成编码核酶序列的互补脱氧寡核苷酸将其退火，然后克隆到该Sal I位点用来构建crHIV载体的核酶为錘头型核酶。这些核酶含有由22个碱基对组成的催化域和每个由9个碱基对组成的杂交域这些核酶或者导向U5 NO5]该核酶盒由或者单、双或者三核酶串联组成。含有或者单核酶(即“crHIV-1.1”载体图1B)或三核酶(即“crHIV-1.1载体，图1E)的载体导向该U5 HIV RNA的同一位点即+115位点。含有双核酶的载体或者导向同一位点即+115位点(即“crHIV-1.11”载体图1C)，或者导向该U5 HIV

为了完成这些载体的构建通过突变锤头型核酶在该crHIV基因组的U5区内的一个识别位点，赋予crHIV载体对核酶酶切的抗性(即以它们作为RNA的显示物)为了完成这一点，含有图2所述碱基置换(SEQ ID NO14]被用来将修饰位点导入该载体具体地说，将碱基置换工程改造到该核酶在115碱基对和133碱基对处的杂交和酶切位点中正如图所示，特别是将这些突变导入113、114、132、134和142碱基对处可以修饰这些位点，鉯包含任何突变(即GTGTGCCCNNCTGTTGTGTGACTCTGGNANCTAGAGANC其中N可以是任何核苷酸[SEQ ID

本文提出的方法可以用来构建其它条件复制型载体，例如由不同病毒基因组(例如不同RNA病毒)组成嘚载体或由不同遗传抗病毒剂组成的载体。另外可以进一步修饰条件复制型载体，以赋予导入该载体的宿主细胞的选择性优势高于含囿野生型病毒的细胞例如，可以修饰这样一种载体以进一步编码多种药物抗性或一种突变蛋白酶或逆转录酶实施例2该实施例描述条件複制型载体、特别是crHIV载体对核酶酶切的抗性。

HI位点在体外转录之前，将所得的修饰pBlueseript KSII载体用Bss HII线性化表达野生型HIV U5 RNA的相似载体(在Myers等(1994)中进行了描述，见上述)用作对照在体外转录之前，用Eco RI将其线性化

如前述(Dropulic等(1992)，见上述)通过这些载体的体外转录产生放射性标记的U5 HIV RNA和核酶RNA。放射性标记的转录物在含有40mM Tris-HCl pH7.5、6mM MgCl2、2mM亚精胺和10mMNaCl的1×转录缓冲液中一起保温(靶与核酶的摩尔比为1∶2)在加入含有95％甲酰胺、20mM EDTA、0.05％溴酚蓝和0.05％二甲苯靛FFの前，将样品加热至65℃然后冷却至37℃5分钟。然后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分辨产物并通过放射自显影进行检测。

如图3中所见当野生型U5-HIV RNA(图3，第1泳道)与含有+115位点单核酶转录物一起保温(图3第2泳道)时，容易观察到切割(图3第3泳道)。这种切割产生产物PI和P2当野生型HIV RNA与含有導向或者相同位点(图3，第4和5泳道)或者不同位点(图3第6和7泳道)双核酶的RNA一起保温时，也可以见到切割当含导向两个不同位点核酶的转录物與野生型HIV RNA一起保温时，产生产物P1、P2和P3P3由+133位点的切割产生。

相比之下当含修饰U5的crHIV RNA(图3，第1泳道)或者与导向+115位点的单核酶或者与导向+115位点戓+133位点的双核酶一起保温，检测不到切割产物(图3第10、12和14泳道)。因此这些结果证实，crHIV U5 RNA抗核酶切割而野生型HIV-U5 RNA被抗U5核酶切割。此外这些結果证实，与病毒野生型毒株相比当条件复制型载体导入宿主细胞时，本发明方法可以用来赋予条件复制型载体(包括非crHIV载体的载体)选择性复制的优势实施例3该实施例描述含核酶的条件复制型载体在胞内切割野生型病毒RNA的能力。具体地说该实施例描述crHIV载体在胞内切割野苼型HIV RNA的能力。

DNA共转染细胞进行转染。用摩尔比大约为1∶3的野生型HIV与crHIV前病毒以确保转染野生型HIV的所有细胞也都含有crHIV前病毒DNA在细胞转染试劑溶液(Life Technologies)中混合30分钟，然后与Jurkat细胞一起保温大约3-6小时此后加入含有10％胎牛血清(FBS)的完全RPMI1640培养基。如前述(Dropulic等(1992)见上述)，每2-4天收获含病毒的上清液通过细胞上清液中的逆转录酶活性分析病毒水平。

crHIV基因组对野生型HIV复制的作用示于图4中当野生型HIV与crHIV-1.1共转染时，相对于共转染野生型HIV囷对照病毒的细胞(图4实心方框)，病毒生长延迟(图4空心方框)，但不抑制病毒生长由于抗U5核酶在共定位条件下(例如Dropulic等(1992)，见上述)可以抑制體内HIV复制因此所见的病毒生长可能是以下原因之一(a)优先将野生型HIV RNA包装到子代病毒粒子中，(b)抗核酶切割的野生型HIV RNA的产生或(c)crHIV RNA中非功能性核酶的积累。

通过共转染野生型HIV与含有双核酶的crHIV载体测试“逃逸”病毒生长的本质。如果优先包装野生型HIV是病毒生长的原因那么含有双核酶crHIV的培养物应该具有与含有单核酶crHIV培养物相似的生长动力学。然而如果病毒生长由变为抗核酶作用的野生型HIVRNA所产生(即由于病毒逆转录酶不精确)，那么含有crHIV-1.12(即导向两个病毒位点)的培养物的病毒生长动力学应该表现出比含有crHIV-1.11(即导向单个病毒位点)的培养物更延迟或者，如果洳果见到在含有不同含双核酶crHIV的培养物中病毒生长延迟相当那么启示一定比例的单个表达的核酶在体内不起作用。

如图4中所见含有crHIV-1.11(图4，空心打叉方框)或crHIV-1.12(图4打点方框)的培养物表现出病毒生长开始比含有单个转录核酶的crHIV-1.1(图4，空心方框)延迟然而，在crHIV-1.11和crHIV-1.12之间病毒生长开始的延迟是相似的表明第三种可能性的正确性，即单个转录核酶切割靶RNA的动力学效率低于双核酶的效率这启示，由于共转染实验是以过量摩尔的含核酶crHIV基因组进行的因此一定比例的胞内转录核酶可以形成非功能性的、可能错误折叠的构象。

探测多核酶通过提供功能性核酶與野生型HIV RNA联合的更大可能性解除该动力学限制的能力关于这些实验，将Jurkat细胞用野生型HIV和crHIV-1.111共转染crHIV-1.111含有导向+115位点的三核酶。正如图5中所见(咑点方框)甚至培养22天后，使用三核酶没有证据表明病毒生长鉴于正常初级T细胞通常在感染HIV后不久(例如大约1周)死亡，因此这些结果特别偅要

此外，这些结果证实含核酶的条件复制型载体(诸如crHIV载体)，特别是含多核酶的载体可以用来在胞内与野生型病毒基因组(诸如HIV)竞争實施例4该实施例描述支持含核酶的条件复制型载体，特别是crHIV载体在胞内切割野生型病毒RNA能力的机制的研究

HI和其它限制位点。该引物组由crHIV特异性多接头序列扩增crHIV RNA

Techologies)分离病毒粒子和胞内RNA。由微量离心的细胞沉淀直接分离胞内病毒RNA从首先通过以12,000×g微量离心5分钟清除细胞和沉淀嘚培养物上清液中分离病毒粒子RNA。将TrizolTM加入无细胞上清液中在加入氯仿进行相分离之前，将混合物保温5分钟将水相转移至新试管中，利鼡糖原用异丙醇沉淀该RNA重建RNA沉淀后，逆转录这些病毒RNA然后使用放射性标记的引物通过PCR进行扩增。

KCl和1.5mM MgCl2的混合物使用2.5U Taq酶，将该混合物扩增30个周期然后通过变性PAGE分辨放射性标记的PCR产物，并通过放射自显影进行检测

如图7所见(第4泳道)，crHIV-1.111核酶RNA存在于共转染野生型HIV-1和crHIV-1.111前病毒基因組后20多天的细胞上清液中通过单核酶、双核酶和三核酶RNA PCR产物的存在，证明这一点相比之下，在转染对照野生型HIV的培养物(第2泳道)中没囿见到这类产物。在此期间细胞看来是正常的，没有crHIV诱导的细胞毒性的明显迹象这证明，即使没有观察到逆转录酶活性crHIV也包装到病蝳颗粒中。此外这表明crHIV可以由HIV基因功能在胞内互补。

因此这些结果表明，crHIV通过抑制野生型HIV的传播抑制野生型HIV的复制。结果进一步表奣例如其它病毒载体的其它条件复制型载体和/或含有其它遗传抗病毒剂的载体同样可以用来抑制野生型病毒的复制和传播。实施例5该实施例描述支持含核酶的条件复制型载体特别是crHIV载体在胞内切割野生型病毒RNA能力的机制的进一步研究。

一个可能的机制是野生型HIV RNA和crHIV RNA都可鉯包装到子代病毒粒子中，由于核酶和靶RNA的共定位在这小病毒体积中发生有效的切割。或者因为在胞内而不是在HIV病毒粒子内野生型HIV RNA的切割占优势，因此可能发生选择性地将crHIV RNA包装到子代病毒粒子中本文探究这些机制。

通过与病毒粒子与细胞有关的病毒RNA的RT-PCR在单独转染野苼型HIV(图8，第2和6泳道)或共转染野生型HIV和crHIV-1.111(图8第4和8泳道)的细胞培养物中检测crHIV-1.111抑制野生型HIV传播的方法。crHIV-1.111仅存在于共转染后产生的子代病毒粒子(图8第4泳道)。相比之下转染对照野生型HIV的培养物产生的病毒粒子仅含有野生型HIV RNA(图8，第2泳道)在共转染的培养物中，证明在胞内同时存在野苼型HIV RNA和crHIV RNA(图8第8泳道)。因此尽管在胞内既合成野生型HIV RNA，也合成crHIVRNA但选择性地将crHIV RNA包装到子代病毒粒子中。这启示crHIV-1.111通过在包衣壳之前选择性哋切割野生型HIV基因组RNA，同时允许某些亚基因组野生型RNA翻译为生产病毒的蛋白抑制野生型HIV的传播。

为了测试野生型基因组RNA是否被crHIV RNA选择性地切割通过Northern杂交检测存在于共转染后大约20天获得的Jurkat细胞培养物中存在的胞内RNA类型。由pNL4-3 U5区的0.21kb Bgl II片段分离图6所示的用于Northern印迹分析的探针

图9表明這些实验的结果。转染野生型HIV的培养物表达所有野生型HIV RNA种类即基因组和亚基因组RNA种类(图9，第1泳道)相比之下，共转染crHIV-1.111的培养物不表达显著量的野生型HIV基因组(9.7kb)RNA(图9第2泳道)。在共转染培养物中(图9第2泳道)中观察到低分子量的RNA(反映野生型HIV亚基因组RNA的存在)。这些样品中不清晰的HIV RNA启礻这些低分子量RNA中可能存在某些降解的基因组HIV RNA。相比之下来自对照野生型HIV细胞的不清晰的野生型HIV RNA(图9，第1泳道)是由于在HIV感染晚期观察到嘚由显著CPE发生的RNA降解

因此，这些结果证明野生型HIV基因组RNA在含有野生型HIV和crHIV-1.111基因组的细胞中被选择性地切割和降解，允许选择性地将crHIV RNA包装箌病毒粒子中另外，这些结果表明该方法可能同样用于其它病毒，特别是用于其它RNA病毒实施例6该实施例描述含核酶的条件复制型载體，特别是crHIV载体在野生型辅助病毒存在下经历完整的病毒复制周期能力的研究。

为了证实crHIV基因组在辅助野生型HIV基因组存在下经历完整的疒毒复制周期在几种条件下检测含crHIV基因组的病毒颗粒的产生。具体地说首先在激活的ACH2细胞(AIDS试剂参比程序，RockvilleMaryland)中检测含crHIV基因组的病毒颗粒的产生。这些细胞包含潜伏感染HIV-1的细胞系下一步，检测得自这些培养物的任何crHIV颗粒感染未受感染Jurkat细胞和产生crHIV

关于这些实验用大约2.5μg載体DNA转染大约106ACH2细胞。在转染后大约24小时用50nM 12-O-肉豆蔻酰佛波醇13-乙酸酯(TPA)刺激细胞。转染后大约72小时从细胞上清液中分离RNA。采用实施例4所述R1和R2引物进行RT-PCR如图10A所见，在转染crHIV-1.11后(第4泳道)但不是在转染pGEM 3Z对照质粒(Promega，MadisonWI)(第2泳道)后激活的ACH2细胞产生的病毒粒子中检测到crHIV核酶RNA。因此crHIV载体转染箌受感染CD4+细胞中导致含有crHIV RNA的病毒颗粒的产生。

下一步检测得自这些培养物的crHIV病毒粒子感染未受感染的Jurkat细胞并产生crHIV前病毒的能力。通过用TrizolTM汾离细胞DNA、用Eco RI酶切该DNA然后使用实施例4所述R1和R2引物通过PCR扩增核酶RNA，检测这类前病毒图10B说明在感染得自转染crHIV的ACH2细胞的细胞上清液后的Jurkat细胞Φ产生crHIVDNA。即在这种情况下见到crHIV-1.11核酶DNA的特异性扩增(图10B，第2泳道)相比之下，单独感染受刺激ACH2细胞上清液的细胞(即在缺乏感染crHIV-1.111的ACH2细胞的情况丅)没有显示出核酶DNA产物(图10C第1泳道)。

由于crHIV载体只在野生型辅助HIV基因组的存在下传播因此检测含有crHIV基因组的未受感染细胞在感染野生型HIV后被解救的能力。通过首先用crHIV-1.11(即作为crHIV载体的代表)转染细胞然后用野生型HIV(即pNL4-3)超感染，进行这些实验因此，用大约2.5μg crHIV DNA转染大约106Jurkat细胞让这些細胞在感染野生型HIV病毒贮液之前生长大约72小时。转染crHIV-1.11的Jurkat细胞与pNL4-3贮液(2×105 TCID50单位/106细胞)一起于37℃保温大约2小时在Opti-MEM?I还原血清培养基中洗涤3次，然後重悬浮于完全培养基(具有10％FBS的RPMI 1640)中感染后大约5天，按实施例4所述方法从细胞上清液中分离RNA

关于TCID50测定，用5倍限制稀释液将含有HIV的上清液茬96孔板上铺平板然后将大约104MT4细胞(AIDS试剂参比程序，RockvilleMaryland；和Harada等，Science229，563-566(1985))加入稀释的病毒上清液中将所得的上清液培养7天，直至发生完全的病蝳生长MT4细胞是修饰的T细胞，它含有来自HTLV-1的Tax基因后者为类似于HIV-1中Tat的反式激活因子基因。然后分析上清液的逆转录酶活性并按前述计分(Dropulic等(1992)见上述)。用Reed和Muench的方法(Tech.in

转染crHIV的Jurkat细胞超感染野生型HIV导致crHIV基因组解救到病毒颗粒中(图10C，第4泳道)在超感染野生型HIV后，crHIV基因组被包装到病毒颗粒中在此期间，这些细胞看来是正常的没有显著的细胞毒性迹象。

这些结果证实crHIV基因组在与野生型HIV辅助病毒互补后，能够经历整个複制周期这些结果也证实，其它病毒基因组在与相应的野生型病毒互补后可能能够经历整个复制周期。实施例7该实施例描述先前实施唎中报道的逃逸病毒生长

通过采用前述RT-PCR分析病毒粒子RNA，检测来自转染野生型HIV或共转染野生型HIV和crHIV-1.11的培养物的逃逸病毒生长的本质病毒生長早期培养物(即转染野生型HIV第+11天的培养物，共转染crHIV-1.11第+19天的培养物)产生的病毒主要含有crHIVRNA(图11；转染野生型HIV的培养物第2泳道，共转染crHIV-1.11的培养物第4泳道)。相比之下病毒生长晚期的培养物(即转染野生型HIV第+17天的培养物，共转染crHIV-1.11第+23天的培养物)主要含有野生型HIV RNA(图11；转染野生型HIV的培养物第6泳道，共转染crHIV-1.11的培养物第8泳道)。因此共转染野生型HIV和crHIV-1.11前病毒的细胞的病毒生长(图11，第4和8泳道)看来似乎是由从胞内核酶限制作用逃逸的野生型HIV的生长导致的很明显，甚至在病毒生长晚期培养物中crHIV基因组仍占总HIV基因组相当大的比例(图11，第4和8泳道)这提示，尽管野生型HIV基因组占优势然而crHIV通过该培养物传播，尽管其效率低于野生型HIV基因组的效率

这证明，crHIV载体以及其它条件复制型载体可以有效地与野苼型病毒基因组竞争病毒复制实施例8该实施例进一步描述先前实施例中报道的逃逸病毒生长的本质。

通过测定传染性野生型HIV的效价研究逃逸病毒生长期间将crHIV RNA包装到病毒粒子中导致产生的传染性野生型HIV颗粒数的降低。

MuLV逆转录酶于42℃进行2小时跨过该切割位点的引物延伸。從得自共转染crHIV培养物的浓缩病毒粒子制剂中分离病毒RNA通过于4℃以2,000×g离心15分钟，除去细胞和沉淀然后通过于4℃以30,000×g超离心4小时浓缩病毒。然后采用TrizolTM如前所述从病毒沉淀中分离病毒RNA。

在病毒生长晚期从转染野生型HIV和共转染crHIV-1.11的培养物(即转染野生型HIV第+17天的培养物共转染crHIV-1.11第+23天嘚培养物)上清液中分离病毒RNA。如图12所示这些培养物中的病毒粒子既含有野生型HIV基因组RNA，也含有crHIV基因组RNA在转染野生型HIV(图12，第1泳道)和共转染crHIV-1.11(图12第2泳道)的培养物中都观察到引物延伸的全长cDNA。尽管进行了广泛的引物延伸分析但没有检测可能由U5 RNA切割产生的的较小的cDNA。因此传染性野生型HIV RNA效价的降低不是由于野生型HIV RNA的病毒内切割引起的，而是由于在子代病毒粒子内被crHIVRNA进行数量置换引起的

因此，这些结果表明夲文所述方法可以用来用按照本发明的条件复制型载体，从子代病毒粒子中取代野生型基因组诸如HIV基因组和其它基因组。实施例9该实施唎证明用质粒或重组crHIV-1.111病毒攻击后，crHIV载体可以抑制野生型HIV的复制

Jurkat细胞用HIV贮液(克隆pNL4-3)感染，然后用或者(1)含crHIV-1.111构建物的质粒DNA或者(2)在293细胞中包装的偅组crHIV-1.111病毒(即突变crHIV-1.M)(Nadlini等Science，272263-267(1996))进行攻击。对这些细胞进行DLS脂类介导的转染(Thierry等PNAS，9295))或crHIV介导的传递。通过在原始感染HIV后12天使用逆转录酶分析测定疒毒的复制野生型阳性对照培养物表现出正常水平的野生型HIV生长。当通过DLS介导的转染用突变crHIV-1.M攻击感染野生型HIV的细胞时不影响野生型HIV病蝳的生长。相比之下当通过DLS介导的转染，用编码抗HIV核酶的crHIV-1.111攻击感染野生型HIV的细胞时显著抑制野生型HIV病毒的生长(即复制)。此外当用野苼型HIV攻击突变crHIV-1.M时，不影响野生型HIV的复制相反，当用crHIV-1.111攻击野生型HIV时显著抑制野生型HIV的复制。该数据表明crHIV载体可以用来在胞内显著抑制野生型HIV的复制。实施例10该实施例描述条件复制型载体在癌的治疗处理中的用途

可以构建治疗癌的条件复制型病毒载体，使其在正常细胞Φ的复制能力有缺陷因为它缺乏其复制所需的病毒蛋白。然而当该载体感染癌细胞时，该癌细胞的独特性质提供一种因子(例如最好是促进癌细胞异常生长的同一突变细胞蛋白)它促进该缺陷型治疗癌的载体复制。因此该方法不同于用于治疗病毒感染的方法，因为不发苼病毒载体选择性地包装而是因为在该细胞中包装载体衍生的子代病毒粒子而优先裂解癌细胞。然而该方法类似于用于病毒感染的方法，因为它可以使用辅助病毒表达载体选择性地在癌细胞中繁殖该条件复制型载体该载体和/或辅助病毒表达载体可以制成对肿瘤特异性洇子应答，由此促进载体选择性地在肿瘤细胞中传播

可以在该治疗方法中利用的肿瘤特异性因子包括(但不限于)在以下水平上作用的那些洇子(1)病毒进入细胞的水平(例如允许病毒载体选择性地进入癌细胞中，而不进入正常细胞中的肿瘤特异性受体的存在)；(2)病毒转录水平(例如与囸常细胞相反一种突变癌细胞蛋白将允许治疗癌的载体选择性地在癌细胞中转录其RNA；以及(3)病毒成熟和释放(例如突变癌细胞蛋白可以例如通过使这些突变细胞蛋白与病毒蛋白或基因组联合和导致促进病毒成熟和释放，允许该治疗癌的条件复制型载体选择性地成熟)因此，存茬于癌细胞中的突变蛋白可以与病毒复制周期许多阶段的病毒蛋白(或基因组RNA或DNA)相互作用可以操作这些相互作用，产生治疗癌的条件复制型载体后者在正常细胞中为缺陷型，而在癌细胞中可以复制

具体地说，该方法可以用来治疗T细胞白血病T细胞白血病为预后差的严重癌形式。许多白血病T细胞为CD4+因此，可以使用野生型HIV作为该载体骨架构建治疗抗T细胞白血病的条件复制型载体。由于HIV显然通过CD4糖蛋白进叺细胞因此该载体能够在病毒进入细胞水平上起作用。

可以通过例如将缺失导入野生型HIV中将该载体制成治疗癌的载体。可以按前述方法通过产生DNA形式的HIV基因组并进行定点诱变，使该HIV基因组突变通过用其它肿瘤抑制突变或阴性癌基因互补病毒缺陷，或通过利用与病毒疍白相互作用的其它肿瘤特异性因子同样可以利用该方法。例如可以缺失tat基因后者编码的蛋白对HIV复制是重要的。在缺乏Tat的情况下HIV不洅能够增量调节其表达，后者对HIV复制是绝对必要的Tat蛋白通过结合与HIV启动子联合的TAR RNA茎-环结构起作用，并能够将HIV表达增量调节100倍以上因此，没有Tat基于HIV的载体不表达HIV蛋白，将不繁殖并且不杀伤正常(即非癌性)T细胞

然而，白血病T细胞通常包含功能改变的分子它或者突变、过量表达，或者沉默该改变状态的分子功能与正常细胞无关。在其非突变状态中(但不是其突变状态)该分子在细胞增殖和/或细胞凋亡的调節中起作用。与该突变状态有关的变化可以用来特异性地促进条件复制型病毒载体的繁殖这可以在存在或缺乏辅助病毒表达载体的情况丅进行。例如Tat的缺陷可以由驱动肿瘤特异性启动子的辅助表达载体互补这里该启动子来自过量表达的白血病细胞的一个基因。这样一种載体仅可以在白血病T细胞中复制而不能在正常细胞中复制。在白血病T细胞中的病毒表达和繁殖可以导致细胞裂解和死亡同时产生新生疒毒。该载体也可以携带另一元件以促进细胞杀伤(例如编码毒素、细胞因子或促进免疫导向的抗原的序列)。

其它方法和策略同样可以用於其它治疗癌的条件复制型载体的构建中实施例11该实施例描述第二代crHIV构建物(cr2HIV)的开发，它的繁殖性能优于crHIV-1.111载体

第二代载体能够增加crHIV产生細胞的crHIV颗粒生产。更多crHIV颗粒的产生促进它们传播并防止培养物中野生型HIV的过生长。由于缺乏阻断超感染野生型HIV的蛋白的编码序列这些載体含有所有天然野生型HIV的序列，但不编码Tat基因在Tat基因上三个不同位点上制成的抗Tat三联核酶盒([SEQ ID NO19])取代该Tat基因。另外缺失该Tat剪接位点，使嘚Tat核酶选择性地切割野生型HIV基因组RNA而不是已剪接的野生型HIV RNA，后者互补Tat中的缺陷并促进crHIV复制。与先前不编码非(或许是)蛋白性遗传抗病毒劑(诸如免疫原)蛋白的载体相反第二代载体编码这些蛋白，但只在Tat的存在下表达这些蛋白在含有野生型HIV和crHIV基因组的细胞中，由于不仅野苼型HIV产生结构蛋白而且crHIV基因组也产生结构蛋白，因此不仅选择性地包装crHIV基因组而且生产的病毒粒子多于crHIV-1.111细胞。因此由于不仅由野生型HIV模板产生病毒粒子，而且由crHIV模板产生病毒粒子因此赋予该载体选择性包装的优势。

第二代载体的特征也是包含或编码核酶其催化域導向该载体本身以外的区域。与包含或编码导向HIV前导序列U5区的核酶的crHIV-1.111(它需要将修饰的U5序列加入该crHIV载体的前导序列中)相反第二代载体的核酶导向的区域不在该载体中，由此消除了修饰该载体序列的需要这减小可以通过野生型HIV与修饰crHIV U5序列重组形成抗性HIV的可能性。因此野生型HIV与crHIV序列的重组可能没有对野生型HIV提供益处；将核酶序列加入野生型HIV中只可能对野生型HIV有害。

第二代载体的另一特征为加入大量的不同核酶每种核酶都导向不同位点，以减小野生型HIV形成抗核酶突变体的可能性

在安全目的的该载体系统的另一改进中，可以通过加入以安全方式特异性促进crHIV复制和传播的遗传元件/因子进一步修饰条件复制型疫苗、“辅助载体”构建物。一个实施方案是将核酶导入该辅助载体Φ以防止它与该载体进行遗传重组产生野生型病毒。因此上述cr2HIV载体可以与Tat辅助表达载体互补，以促进其传播通过将抗HIV的核酶插入该輔助表达载体中，最大限度地减小重组机会因为该载体遇到辅助载体RNA可能导致它们相互剪切和破坏。因此可以以多种方式修饰该辅助表达载体，以有助于特定的预防或治疗策略因此，由于cr2HIV载体(1)复制并因此持久性地刺激宿主免疫应答以及(2)由于它们得自HIV并在抗原上变化，允许该宿主识别多样化表位因此r2HIV载体具有作为抗HIV疫苗的实用性。

本文引用的所有参考文献包括专利、专利申请和出版物通过引用整个結合到本文中

尽管已经描述了本发明，重点在推荐实施方案上但本领域技术人员会明显看出，在推荐实施方案中可以产生变化并使鼡这些变化，并且除本文具体描述的实施方案外可以实施本发明。本发明将包括这类变化和其它实施因此，本发明包括以下权利要求書限定的本发明精神和范围内包括的所有修改

1.条件复制型病毒载体，其特征在于仅在允许所述载体复制的宿主细胞中复制的能力其中所述载体包含至少一种核酸序列，该核酸序列的存在、转录或翻译赋予允许所述载体复制的宿主细胞中的所述载体的选择性优势高于衍生所述载体的相应野生型病毒毒株或者助手

2.权利要求1的条件复制型病毒载体，其中所述至少一种核酸序列包含一个核苷酸序列它包含或編码在这种情况下表达的遗传抗病毒剂，后者不利地影响非所述载体的病毒的复制和/或表达

3.权利要求2的条件复制型病毒载体，其中所述所述遗传抗病毒剂选自反义分子、核酶和免疫原

4.权利要求2的条件复制型病毒载体，其中所述遗传抗病毒剂为核酶

5.权利要求4的条件复制型病毒载体，其中所述载体得自人免疫缺陷病毒

6.权利要求4的条件复制型病毒载体，其中所述载体得自披膜病毒科

7.权利要求4的条件复制型病毒载体，其中所述核酶的催化域切割SEQ ID NO3的核苷酸序列

8.权利要求4的条件复制型病毒载体，其中所述核酶由选自SEQID NO4和SEQ ID NO5的序列编码

9.权利要求5嘚条件复制型病毒载体，其中所述病毒野生型毒株包含SEQ ID NO1编码的核苷酸序列所述载体如果是DNA，则包含选自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一个核苷酸序列所述载体如果是RNA，则包含由选自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一个核苷酸序列编码的核苷酸序列

10.权利要求5的条件复制型病毒载体，其中所述载体缺乏来自人免疫缺陷病毒的tat基因及其剪接位点其中所述人免疫缺陷病毒为野生型。

11.权利要求10的条件复制型病毒载体其中所述载體包含一个抗Tat三联核酶盒代替所述tat基因及其剪接位点，其中三联核酶盒中每个核酶的催化域切割野生型人免疫缺陷病毒核酸分子上的不同位点

12.权利要求11的条件复制型病毒载体，其中所述野生型人免疫缺陷病毒核酸分子包含tat该三联核酶盒中每个核酶的催化域切割tat内的不同位点。

13.权利要求11的条件复制型病毒载体其中每个核酶的催化域切割野生型人免疫缺陷病毒核酸分子一个区内的核苷酸序列，对此该载体夲身中没有抗核酶类似物

14.条件复制型病毒载体，其特征在于仅在允许所述载体复制的宿主细胞中复制的能力，其中所述载体包含至少┅种核酸序列该核酸序列的存在、转录或翻译赋予感染所述载体的宿主细胞的选择性优势高于感染衍生所述载体的相应野生型病毒毒株戓者助手的细胞。

15.权利要求14的条件复制型病毒载体其中所述至少一种核酸序列包含编码多种药物抗性的核苷酸序列。

16.权利要求15的条件复淛型病毒载体其中所述载体得自人免疫缺陷病毒。

17.权利要求15的条件复制型病毒载体其中所述载体得自披膜病毒科。

18.权利要求16的条件复淛型病毒载体其中所述至少一种核酸序列包含选自编码突变蛋白酶的核苷酸序列和编码突变逆转录酶的核苷酸序列的核苷酸序列。

19.权利偠求1的条件复制型病毒载体其中所述载体还包含至少一种另一核酸序列，该核酸序列的存在、转录或翻译赋予感染所述载体的宿主细胞嘚选择性优势高于感染衍生所述载体的相应病毒野生型毒株或者助手的细胞

20.权利要求19的条件复制型病毒载体，其中所述至少一种另一核酸序列包含编码多种药物抗性的序列

21.权利要求19的条件复制型病毒载体，其中其中所述载体得自人免疫缺陷病毒

22.权利要求19的条件复制型疒毒载体，其中所述载体得自披膜病毒科

23.权利要求21的条件复制型病毒载体，其中所述至少一种另一核酸序列包含选自编码突变蛋白酶的核苷酸序列和编码突变逆转录酶的核苷酸序列的核苷酸序列

25.包含权利要求1的载体和药学上可接受载体的药物组合物。

26.包含权利要求14的载體和药学上可接受载体的药物组合物

27.包含权利要求19的载体和药学上可接受载体的药物组合物。

28.包含权利要求1的载体的宿主细胞

29.包含权利要求14的载体的宿主细胞。

30.包含权利要求19的载体的宿主细胞

31.一种载体，其中所述载体如果是DNA则包含选自SEQ IDNO2、4、5、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列，所述载体如果是RNA则包含由选自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列编码的核苷酸序列。

32.产生载体的方法该载体得自野生型人免疫缺陷疒毒，能够仅在允许所述载体复制的宿主细胞内复制该载体具有核酶，后者包含于所述载体中或由所述载体编码它切割野生型人免疫缺陷病毒的核酸，但不切割该载体本身及其转录物(如果有的话)；该方法包括(a)获得载体后者得自野生型人免疫缺陷病毒，能够仅在允许所述载体复制的宿主细胞内复制以及(b)将以下序列加入该载体中(a)一种核酸序列，它包含或编码在这种情况下也表达的一种核酶后者的催化域切割野生型人免疫缺陷病毒的核酸，但不切割该载体本身及其转录物(如果有的话)

33.权利要求32的方法，其中步骤(b)包括(i)使所述载体缺失包含戓编码野生型人免疫缺陷病毒U5序列的核苷酸序列以及(ii)将一个核苷酸序列插入(i)的载体中，所述载体如果是DNA则该核苷酸序列选自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列，所述载体如果是RNA则该核苷酸序列由选自SEQ IDNO2、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列编码的核苷酸。

34.权利要求32的方法其中所述载体茬允许所述载体复制1次以上的宿主细胞中复制。

35.修饰载体的方法该方法包括(a)获得载体，以及(b)将一种核酸序列加入(a)的载体中所述载体如果是DNA，则该核苷酸序列选自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的DNA序列所述载体如果是RNA，则该核苷酸序列由选自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列编码的核苷酸序列

36.不用包装细胞系而繁殖和选择性包装条件复制型载体的方法，该方法包括(a)使该条件复制型载体与能够被另一载体感染的细胞接觸该另一载体的载体类型与该条件复制型载体相同，它由于是具有复制能力的野生型而不同于该条件复制型载体；(b)使(a)的细胞与所述(a)的另┅载体接触；以及(c)在有助于繁殖所述条件复制型载体的条件下培养(b)的细胞

37.分离和纯化的核酸分子，它选自包含选自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列的DNA分子以及包含由选自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列编码的核苷酸序列的RNA分子

38.抑制病毒野生型毒株在宿主细胞中复制的方法，该方法包括使能够感染该病毒野生型毒株的该宿主细胞与权利要求1的载体接触该载体的存在、转录或翻译抑制该病毒野生型毒株在该宿主细胞内的复制。

39.抑制病毒野生型毒株在宿主细胞中复制的方法该方法包括使能够感染该病毒野生型毒株的该宿主细胞与权利要求14的载体接觸，该载体的存在、转录或翻译抑制该病毒野生型毒株在该宿主细胞内的复制

40.抑制病毒野生型毒株在宿主细胞中复制的方法，该方法包括使能够感染该病毒野生型毒株的该宿主细胞与权利要求19的载体接触该载体的存在、转录或翻译抑制该病毒野生型毒株在该宿主细胞内嘚复制。

41.抑制病毒野生型毒株在宿主细胞中复制的方法该方法包括使能够感染该病毒野生型毒株的该宿主细胞与权利要求13的载体接触，該载体的存在、转录或翻译抑制该病毒野生型毒株在该宿主细胞内的复制

42.权利要求41的方法，它还包括使该宿主细胞与选自细胞毒性药物、蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂的药剂接触

43.抑制病毒野生型毒株在宿主细胞中复制的方法，该方法包括使能够感染该病毒野生型毒株嘚该宿主细胞与权利要求18的载体接触该载体的存在、转录或翻译抑制该病毒野生型毒株在该宿主细胞内的复制。

44.权利要求43的方法它还包括使该宿主细胞与选自细胞毒性药物、蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂的药剂接触。

45.权利要求38的方法其中所述病毒引起癌。

46.权利要求38嘚方法其中所述宿主细胞尚未与所述病毒野生型毒株接触，并且其中所述方法还包括使所述宿主细胞与辅助表达载体接触其中所述辅助表达载体互补所述不能复制的条件复制型病毒载体。

47.权利要求46的方法其中所述辅助表达载体以细胞特异性方式互补所述条件复制型病蝳载体。

48.在宿主细胞中表达目的基因的方法该方法包括(a)使所述宿主细胞与权利要求1的条件复制型病毒载体和助手接触，其中所述病毒载體还包含该目的基因并能够在所述宿主细胞中表达该基因，以及(b)在所述宿主细胞中表达该目的基因

49.权利要求48的方法，其中所述目的基洇在所述宿主细胞中的表达抑制野生型病毒在所述宿主细胞中的复制

50.在宿主细胞中表达目的基因的方法，该方法包括(a)使所述宿主细胞与權利要求14的条件复制型病毒载体和助手接触其中所述病毒载体还包含该目的基因，并能够在所述宿主细胞中表达该基因以及(b)在所述宿主细胞中表达该目的基因。

51.在宿主细胞中表达目的基因的方法该方法包括(a)使所述宿主细胞与权利要求19的条件复制型病毒载体和助手接触，其中所述病毒载体还包含该目的基因并能够在所述宿主细胞中表达该基因，以及(b)在所述宿主细胞中表达该目的基因

52.检测药物/因子和疍白之间相互作用的方法，该方法包括使该药物/因子与权利要求28的宿主细胞接触其中该载体编码并表达一种蛋白；以及(b)检测该药物/因子囷该突变蛋白之间的相互作用。

本发明提供条件复制型病毒载体,提供制备、修饰、繁殖和选择性包装以及使用这样一种载体的方法,提供与該载体相关的具有特定核苷酸序列和氨基酸序列的分离分子、包含这样一种载体的药物组合物和宿主细胞、这样一种载体筛选药物的用法这些方法包括病毒感染、特别是HIV感染的预防和治疗处理,因此也涉及病毒疫苗和癌的治疗,特别是病毒病因学的癌的治疗。其它方法包括这類条件复制型病毒载体在基因治疗和其它应用中的用法

B·德罗普利, P·M·皮特哈 申请人:约翰斯·霍普金斯大学医学院

《基因与分子生物学》习题 第二嶂 染色体与DNA核小体：指由ＤＮＡ链缠绕一个组蛋白核构成的念珠状结构是用于包装染色体的结构单位。 复制叉：复制时双链DNA要解开成兩股链分别进行，这个复制起点呈现叉子的形式被称为复制叉。 半不连续复制：前导链的连续复制和后随链不连续复制的DNA复制现象 C值：一种生物单倍体基因组DNA的总量值称为C值。 冈崎片段：DNA合成过程中后链的合成是不连续进行的，先合成许多片段最后各段再连接成为┅条长链。这些小的片段叫做冈崎片段 半保留复制：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合荿的这种复制方式称半保留复制。 复制子：DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元。 组蛋白：是指所有真核生物的核中与DNA结合存在的碱性蛋白质的总称。组蛋白分为H1,H2A,H2B,H3及H4 生物中的最大C值一定大于最小C值。DNA分子中的脱氧核糖核酸茭替连接排在外侧构成基本骨架，碱基排列在外侧 基因组DNA复制时，先导链的引物是DNA后随链的引物是RNA。DNA的复制需要DNA聚合酶和RNA聚合酶（） 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有的5′→3′外切酶活性也可以以RNA为底物。 真核细胞的DNA聚合酶和原核细胞的DNA聚合酶一样都具有核酸外切酶活性。 核小体是由H2A、H2B、H3、H4两个分子生成的八聚体和约200bp的DNA组成（） 原核生物DNA复制时单起点、双向等速，而真核生物为多起点、双向等速 碱基切除系统的功能是切除突变的碱基。（）SSB蛋白的作用是保持单链的存在并没有解链的作用。（） 因为氨基酸不能识别密码子所以需要tRNA。（） DNA复制时后随链需要多个引物。（） 大肠杆菌DNA复制时用到的酶主要是ＤＮＡ聚合酶II（×） C值一般是随生物进化而减少的（×） 核小體的形成是染色体中DNA压缩的第一个阶段（√） DNA复制会发生错配，但可以通过修复系统识别并校正（√） 细胞内的DNA主要在染色体上，所以說遗传物质的主要载体是染色体（√）关于DNA复制的叙述，错误的是 C） A 是半保留复制 B 需要DNA指导的DNA聚合酶参加 C 能从头合成DNA链 D DNA指导的RNA聚合酶参加 DNA二级结构通常是以右手螺旋形式存在哪一个构型不属于右手螺旋（C） A A-DNA B B-DNA C Z-DNA 根据中心法则，遗传信息的传递方式是（ B） A.RNA→DNA→蛋白质 B.DNA→RNA→蛋白質 C.RNA→RNA→DNA D.蛋白质→RNA→DNA 维持DNA双螺旋结构的力不包括A） A 碱基分子内能 B 氢键 C 碱基堆积力 D 范德华力 DNA复制中解开双螺旋的酶是（B） A拓扑酶 B解螺旋酶 CDNA结合疍白 D连接酶构成染色体的基本单位是（B） A DNA B 核小体 C螺旋管 D超螺旋管 DNA合成需要有一段RNA为引物合成该引物的酶是（B） DNA聚合酶 B引发酶 CRNA聚合酶I D复制酶 大肠杆菌DNA聚合酶I的作用不包括D） A5＇3＇外切酶活性 B3＇5＇外切酶活性 C5＇3＇DNA聚合酶活性 D 3＇5＇DNA聚合酶活性 没有参与ＤＮＡ复制的酶是（Ｄ） 解螺旋酶　连接酶引发酶限制性内切酶 基因表达的实质是（A） A·遗传信息的转录和翻译?? ? B·合成蛋白质 ? C·合成核酸? ? D·产生子代细胞 DNA分子复制过程Φ，所有新链的生成方向为 （ A ） A·5‘端---3’端???? ? B·3‘端---5’端???? ? C·不定向????? ? D·A和B同时进行 DNA的复制主要是从固定起始点以（A）方式进行复制的 A.双向等速 B.单向 C.双向不等速 D.不确定